雪豹粪便微生物组成分析与宿主健康的关联研究

A Study of the Association Between Microbial Composition Analysis of Snow Leopard Feces and Host Health

摘要

为深入了解西藏雪豹肠道微生物组成情况，收集了1例拉萨野生动物园圈养雪豹的粪便样本，利用16S rDNA基因测序技术对其肠道微生物群落进行分析。共计获得125 958条高质量序列，样本的平均有效组合序列为109 270条。在门水平上，雪豹肠道微生物中占据主导地位的是厚壁菌门，其次是拟杆菌门。在属水平上，食甲硫氨酸嗜胃杆菌是雪豹肠道微生物中的优势菌群。在Alpha多样性指数中雪豹Chao1指数为1 209.84； ACE指数为1 327.63；Shannon指数为4.57；Simpson指数为0.91，表明微生物群落的多样性和均匀性较高。对雪豹肠道微生物菌群功能预测分析表明，这些微生物主要参与碳水化合物、氨基酸、萜类、聚酮类、辅因子和维生素的代谢，这些代谢过程对于支持宿主的健康至关重要。通过对雪豹粪便微生物群落的深入分析，本研究为评估雪豹的健康状态及其栖息地的生态系统提供了有力的理论支持，这不仅有助于了解雪豹在自然环境中的生理状态，也为制定保护雪豹的措施提供了依据。

Abstract

In order to further understand the health status of snow leopards, one fecal sample was collected from a captive snow leopard (Panthera uncia) at Lasa Wildlife Park, and their intestinal microbial communities were analyzed in detail by 16S rRNA gene sequencing technology. A total of 125 958 high-quality sequences were obtained, and the average effective combination sequence of the sample was 109270. At the phylum level, the dominant intestinal microbiota of snow leopards was Firmicutes, followed by Bacteroidota. At the genus level, Peptoniphilus_methioninivorax was the dominant microbiota in the snow leopard. Among the alpha diversity indexes, the Chao1 index of snow leopard was 1 209.84, the ACE index was 1 327.63, the Shannon index was 4.57, and the Simpson index was 0.91, indicating that the diversity and uniformity of microbial communities were high. Predictive analysis of intestinal microbiota function in snow leopards showed that: these microorganisms were mainly involved in the metabolism of carbohydrates, amino acids, terpenoids, polyketides, cofactors and vitamins, which were essential for supporting the health of the host. Through in-depth analysis of the fecal microbial community of snow leopards, the study provides a strong theoretical support for assessing the health status of snow leopards and the ecosystem of their habitats. This not only helps to understand the physiological state of snow leopards in the natural environment, but also provides a scientific basis for the formulation of its protection measures.

Graphical abstract

关键词

雪豹 / 16S rDNA / 粪便微生物 / 野生动物保护

Key words

Snow leopard / 16S rDNA / Fecal microbes / Wildlife protection

雪豹（Panthera uncia）是一种生活在中亚高山地区的濒危大型猫科动物^[1]，主要栖息于海拔3 000 ~ 4 500 m的山区，雪豹的栖息地偏远且不易被人类接近，但这种孤立的环境同时也使雪豹面临诸多威胁。非法狩猎、栖息地丧失、气候变化等对雪豹生存造成威胁，濒临灭绝的危险日益加剧，保护雪豹及其栖息环境已经成为全球范围内的重要任务^[2]。人工驯养（动物园饲养）作为一种方法，在野生动物保护方面起着重要作用^[3]。

近年来，科学技术的不断进步为研究人员提供了更多机会来探索雪豹的行为和生态学等，16S rDNA宏基因组测序等新的分子生物学方法已在自然生态系统的微生物组成和多样性研究中发挥了重要作用，同时肠道微生物的研究也为野生动物保护工作提供了新的思路和方法^[4,5]，可以详细分析样本中的微生物多样性和群落结构，为理解微生物与宿主之间的复杂互动提供了有力工具^[6,7]。而宏基因组学则通过对环境样本中所有基因组的全面分析，可以确定微生物的种类，探索其潜在的功能和代谢路径。这些方法通常被认为是反映宿主健康状况的重要指标之一。越来越多的研究表明，肠道微生物群落在宿主体内的健康和疾病状态中扮演着关键角色，肠道菌群直接参与宿主的代谢、免疫、内分泌和神经活动等重要生理过程^[8-10]。此外，肠道微生物群在抵御病原菌侵袭方面发挥着重要作用，通过竞争性排斥、产生抗菌物质以及调节宿主免疫反应来保护宿主免受病原菌的侵害。微生物群落的平衡与否直接影响宿主的疾病抵抗能力，同时微生物群落的组成对环境变化具有高度敏感性^[11]，这种敏感性使得微生物群落可以作为环境变化和生态系统健康的指标。通过监测微生物的动态变化，有助于评估宿主对环境压力的适应能力。在资源匮乏的野外环境中，肠道微生物能够将宿主无法直接吸收的物质转化为能量，从而提高其环境适应能力，增加生存机会。野生哺乳动物的肠道微生物菌群通常能对季节和饮食的变化迅速做出反应，以缓冲季节性变化对野生动物的影响^[12-14]。藏羊肠道中不同季节的微生物群落表现了不同的功能^[15]。对比红鹿放归前和野生红鹿的肠道中，厚壁菌门（Firmicutes）作为主要生物标志物，展示了其在适应野外环境中的关键作用^[16]。目前对豹属动物肠道菌群的研究已初步揭示，其主要由变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和梭菌门构成。这些门类在豹属动物的肠道中占据了主导地位，在消化系统中发挥着重要作用。变形菌门和厚壁菌门作为主要的微生物群，参与了复杂的代谢过程，有助于食物的分解和养分的吸收。放线菌门和梭菌门则与肠道免疫系统和菌群稳定性密切相关^[17,18]。这些研究结果不仅丰富了人们对豹属动物肠道微生物群落的认识，也为进一步探索其在生态适应和健康维护中的作用提供了基础。在高蛋白、高脂肪饮食下，哺乳动物的肠道微生物群落中变形菌门和厚壁菌门的丰度会更占优势^[19,20]，雪豹主要以高蛋白高脂肪的食物为能量来源。通过研究雪豹粪便中的微生物组成有助于了解其栖息环境的微生物信息，有助于深入了解高山生态系统的动物健康和变化趋势^[21,22]。

考虑到雪豹栖息地的特殊性，本研究选择了拉萨地区野生动物园的雪豹作为研究对象，使用宏基因组测序分析其粪便样本中的微生物组成，以探究其肠道微生物群落结构。

1 材料和方法

1.1 样本采集

在拉萨市野生动物园采集1份成年雄性雪豹的粪便样本。采样时间为12月份。实验动物在采样前3个月内未患任何疾病，未用任何药物、抗生素和肠道益生菌喂养或治疗。采用无菌试管收集雪豹粪便样本后，立即在液氮中冷冻保存。

1.2 仪器与设备

DNA提取试剂盒（D3141），广州美基生物科技有限公司；NanoDrop 2000 微量分光光度计，赛默飞世尔科技；DYY-6C琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一仪器厂。

1.3 基因组DNA提取和PCR扩增

根据DNA提取试剂盒说明书，从样本中提取基因组DNA后，使用Nanorop 微量分光光度计测定核酸的纯度，保证A260/A280比值应在1.8 ~ 2.0之间，琼脂糖凝胶电泳仪检验核酸样本的完整性。使用带有barcode的特异引物对16S rDNA的V3＋V4区域进行PCR扩增。引物序列为：341F:CCTACGGGNGGCW GCAG；806R:GGACTACHVGGGTATCTAAT。将纯化后的扩增产物连接测序接头，使用Illumina DNA Prep Kit构建测序文库。

1.4 序列处理和数据分析

测序得到Raw reads之后，首先基于FASTP软件对低质量Reads进行过滤，然后进行组装，使用FLASH软件将双端Reads拼接为Tag，再对Tag进行过滤，得到的数据称为Clean Tag。接下来使用USEARCH软件的UCHIME算法基于Clean Tag进行聚类，去除聚类比对过程中检测到的嵌合体Tag，得到的数据为Effective Tag。按照97%相似度聚类获得OTU序列后，基于Effective Tag进行OTU丰度统计。在QIIME中计算alpha多样性指数。

2 结果

2.1 测序结果

本次测序结果显示，从1个雪豹粪便样本中共计获得125 958个高质量序列。经过严格的质量控制和优化处理后，样本的平均有效组合序列为109 270个（表1）。所有优化后的序列通过UPARSE软件与OTU代表序列进行比对，并选择与代表序列相似度100%的序列来生成OTUs。经过分类匹配，共获得1 077个OTU序列。

2.2 物种组成

为分析雪豹肠道微生物群落，根据操作分类单元（OTU）的序列信息，并参考数据库进行物种注释，设定置信度阈值在0.8到1之间。这一高置信度的设定确保了物种注释的准确性和可靠性。统计了该样品在各个分类水平上的序列数目，从界、门、纲、目、科、属、种7个层级进行全面分析，详细占比如下：

门：厚壁菌门Firmicutes（85.02%）、放线杆菌门Actinobacteriota（7.62%）、梭杆菌门Fusobacteriota（3.80%）、弯曲杆菌门Campilobacterota（1.36%）、变形菌门Proteobacteria（0.72%）、拟杆菌门Bacteroidota（0.69%）、疣微菌群Verrucomicrobiota（0.17%）、绿弯菌门Chloroflexi（0.08%）、螺旋体门Spirochaetota（0.07%）、髌骨细菌门Patescibacteria（0.02%）(图1A)。

属：食甲硫氨酸嗜胃杆菌Peptoniphilus_methioninivorax（19.04%）、梭状芽孢杆菌属-1 Clostridium_ sensu_stricto_1（12.93%）、肽梭菌属Peptoclostridium（11.41%）、索杆菌属Solobacterium（10.69%）、柯林斯菌属Collinsella（6.74%）、链球孢菌属Catenisphaera（6.46%）、布劳特氏菌属Blautia（4.97%）、消化链球菌属Peptostreptococcus（4.54%）、梭杆菌属Fusobacterium（3.80%）、梭状芽孢杆菌属-7 Clostridium_ sensu_stricto_7（2.37%）(图1E)。

为了更直观地了解各分类层级上微生物的组成，绘制了各层级的丰度堆叠图（图1），展示了不同分类群在雪豹肠道微生物群落中的占比情况。这些图表清晰地显示了雪豹肠道中主要微生物的分布和相对丰度，为理解其肠道微生态环境提供了重要的数据参考。

2.3 Alpha多样性结果

Alpha多样性是生态学中用于描述特定生境或生态系统内物种多样性的重要指标。在本研究中，采用了多种Alpha多样性指数来全面评估雪豹肠道微生物群落的多样性和复杂性，包括Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数。其中Chao1指数为1 209.84；ACE指数为1 327.63；Shannon指数为4.57；Simpson指数为0.91（图2A），并通过Rank Abundance曲线直观反应样品中包含的分类丰富度和均匀度（图2B）。

2.4 功能预测分析

根据操作分类单元（OTU）的物种注释和丰度信息，利用PICRUSt2软件对细菌进行微生物功能预测和KEGG代谢通路注释，从而深入分析微生物群落的潜在代谢功能和生物学意义，详细结果（如图3）所示。功能预测主要包括：新陈代谢、遗传信息处理、细胞过程、环境信息处理、有机体系统和人类疾病功能相关。在KEGG通路注释结果主要包括：代谢、遗传信息处理和细胞过程等多个方面。具体作用包括：（1）代谢途径：涵盖了碳水化合物、氨基酸、萜类、聚酮类、辅因子和维生素的合成和代谢，涉及能量生产、营养物质的合成和分解，以及各种细胞功能的维持；（2）遗传信息处理途径：包括DNA复制和修复、RNA翻译等，确保遗传信息的准确传递和蛋白质的正确合成；（3）细胞过程：涉及细胞的生长、分裂和死亡等基本生命活动的调控。这些生物途径共同作用，以维持生物体的正常运作和适应环境变化的能力（表2）。

3 讨论

雪豹主要以野生山羊、岩羊及其他小型哺乳动物为食^[1,2]。在野外生存的雪豹面临诸多挑战，其生存完全依赖于自然资源的供给；而高原地区恶劣的环境条件，使其肠道微生物组成显著受饮食结构与地理环境的双重影响，这些微生物在辅助雪豹消化食物、摄取必要营养的过程中发挥着关键作用^[21]。已有研究表明，野生雪豹肠道微生物组成以拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌群^[22]。拟杆菌属微生物具备分解复杂植物纤维与蛋白质的功能，能帮助雪豹充分利用捕获的猎物，从中获取更多的营养成分^[23]。通过降解难以消化的植物性物质与蛋白质，这类微生物为雪豹额外补充了营养来源，有助于满足其在高原恶劣环境下的能量需求，提高了其在自然界中的生存机会^[24,25]；厚壁菌门有助于维持宿主肠道健康和增强免疫系统功能，还能提高能量吸收效率。通过抑制有害微生物的生长，保持肠道菌群平衡，有效防止消化系统疾病的发生。此外，厚壁菌门微生物还能分解复杂的食物成分，释放出更多营养物质，为雪豹提供必要的能量^[26,27]。以上研究结果表明，尽管雪豹生活在资源匮乏且环境严苛的高原区域，但其肠道微生物群落已高度适应这种特殊的饮食结构与生存环境，这些微生物不仅在促进营养消化吸收中发挥作用，还可通过维护肠道健康与免疫功能，为雪豹在严峻环境中的生存提供了重要支撑。

哺乳动物肠道微生物区系的组成受多种环境因素调控，其中生活条件是核心影响因素之一^[28]。本研究通过高通量测序技术分析拉萨动物园圈养雪豹的粪便样本发现，其肠道优势菌群为厚壁菌门，占比高达85.02%，而拟杆菌门占仅为0.69%。

这一低水平的拟杆菌门丰度，可作为评估雪豹健康状况的潜在指标。另有针对藏野驴的研究显示，与野外个体相比，圈养藏野驴饮食条件更优、蛋白质摄入量更高，其肠道菌群同样呈现“厚壁菌门占比高、拟杆菌门占比低”的特征，该研究推测圈养藏野驴的健康状态可能低于野生个体^[29]。

肠道微生物的存在及其功能为雪豹提供了关键生理支持，使其能在资源有限的环境中高效利用营养、维持生命活动并完成繁衍^[18,30]。在动物的健康与营养调节中，肠道微生物扮演着不可或缺的角色：它不仅维护肠道正常生理功能、优化营养吸收效率，还能为免疫系统提供支持，进而全面提升宿主整体健康水平^[31]。通过对雪豹肠道微生物的功能预测和研究，可帮助人们更好地了解这些微生物对动物消化系统的影响，从而为动物提供更合理的饲养管理和营养补充，有助于提高动物的健康水平和生存质量^[32]。同时，对比分析圈养（动物园）与野生个体的肠道微生物差异^[23,30]，可以进一步揭示野生动物的饮食习性、消化生理特点以及对环境变化的适应能力，为野生动物保护工作提供宝贵参考，也为制定更有效的保护策略提供科学依据^[32]。

本研究内容有助于增进对动物园饲养条件下野生动物肠道微生物的认识。总体而言，雪豹肠道微生物功能预测研究不仅有助于优化其饲养管理，提高雪豹的生存质量，同时也为其他野生动物保护工作提供了参考，有助于深入了解野生动物的生态习性和健康状况，为保护和管理提供更科学的指导。本研究功能预测结果显示，其肠道微生物主要参与新陈代谢、遗传信息处理、细胞过程、环境信息处理、有机体系统和人类疾病相关等功能活动，这与Zhang等的研究结果一致^[33,34]。此外，本研究中雪豹粪便样本的Shannon指数为4.57和Simpson指数为0.91，提示该个体肠道微生物菌群多样性和丰度较低。高原地区的环境条件复杂多变，微生物群落多样性和功能适应性对雪豹适应环境变化至关重要^[18,35,36]。这类微生物可通过代谢产物、营养物质及信号分子与宿主进行复杂的相互作用，进而影响雪豹免疫系统、消化系统的功能及整体健康状态^[37]。

4 结论

本研究利用16S rDNA宏基因组测序分析揭示了高原地区动物园中雪豹粪便样本中微生物群落的多样性和功能特征。动物园圈养雪豹肠道微生物的菌群多样性、丰度较低，饮食、肠道菌群和动物健康是相互关联的，低水平的拟杆菌门提示雪豹可能存在健康问题。综上所述，动物园或许需要针对雪豹的健康做出检查以及营养水平的调整。

参考文献

[1] Ale S B, Mishra C. The snow leopard's questionable comeback[J]. Science. 2018, 359(6380): 1110-1110.

[2] Chen P, Gao Y, Wang J, et al. Status and conservation of the Endangered snow leopard Panthera uncia in Qomolangma National Nature Reserve, Tibet[J]. Oryx. 2017, 51(4): 590-593.

[3] Barelli C, Albanese D, Donati C, et al. Habitat fragmentation is associated to gut microbiota diversity of an endangered primate: implications for conservation[J]. Scientific Reports. 2015, 5: 14862.

[4] Zhu B, Wang X, Li L. Human gut microbiome: the second genome of human body[J]. Protein Cell. 2010, 1(8): 718-725.

[5] Li Y, Zhang Y, Wei K, et al. Review: Effect of Gut Microbiota and Its Metabolite SCFAs on Radiation-Induced Intestinal Injury[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2021 Jul 9;11:577236.

[6] DeSantis T Z Jr, Hugenholtz P, Keller K, et al. NAST: a multiple sequence alignment server for comparative analysis of 16S rRNA genes[J]. Nucleic Acids Research. 2006, 34(Web Server issue): W394-9.

[7] Langille M G, Zaneveld J, Caporaso J G, et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences[J]. Nature biotechnology, 2013. 31(9): 814-821.

[8] Muramatsu M K, Winter S E. Nutrient acquisition strategies by gut microbes[J]. Cell Host Microbe. 2024;32(6):863-874.

[9] Parker A, Fonseca S, Carding S R. Gut microbes and metabolites as modulators of blood-brain barrier integrity and brain health[J]. Gut Microbes. 2020;11(2):135-157.

[10] Dearing M D, Weinstein S B. Metabolic Enabling and Detoxification by Mammalian Gut Microbes[J]. Annual Review of Microbiology. 2022;76:579-596.

[11] Wenli S, Yu W, Jian Z, et al. Duodenal intestinal flora diversity of Tibetan pigs is lower than that of York pigs based on 16S rRNA analysis[J], Asian Journal of Agriculture and Biology, 2024(1).

[12] Oli M K, Taylor I R, Rogers M E, et al. Diet of the snow leopard (Panthera uncia) in the Annapurna Conservation Area, Nepal[J]. Journal of Zoology. 1993, 231(3): 365-370.

[13] Amato K R, Lelgh S R, Kent A, et al. The gut microbiota appears to compensate for seasonal diet variation in the wild blackhowler monkey(Alouatta pigra)[J]. Microbial Ecology, 2015,69(2):434-443.

[14] Sun B H, Wang X, Bernstein S, et al. Marked variation be-tween winter and spring gut microbiota in free-ranging Tibetan ma-caques(Macaca thibetana)[J]. Scientifie Reports, 2016, 6:26035.

[15] Springer A, Fichtel C, Al-Ghalith G A, et al. Pattemsof seasonality and group membership characterize the gut microbiota ina longitudinal study of wild Verreaux's sifakas (Prpithecus verreauxi)[J]. Ecology and Evolution, 2017, 7(15):5732 -5745.

[16] Liu H, Hu L, Han X, et al. Tibetan Sheep Adapt to Plant Phenology in Alpine Meadows by Changing Rumen Microbial Community Structure and Function[J]. Frontiers in Microbiology. 2020,11:587558.

[17] Guo J, Li Z, Jin Y, et al. The gut microbial differences between pre-released and wild red deer: Firmicutes abundance may affect wild adaptation after release[J]. Frontiers in Microbiology. 2024,15:1401373.

[18] Zhao J X, Zhang R S, Zhao Y L, et al. Analysis ofcecum bacteria diversity in Xinjiang Donkey[J]. Grass-Feeding Livestock, 2016, 4:20-25.

[19] Gao H, Chi X, Qin W, et al. Comparison of the gut microbiota composition between the wild and captive Tibetan wild ass (Equus kiang)[J]. J Appl Microbiol. 2019;126(6):1869-1878.

[20] David L A, Maurice C F, Carmody R N, et al. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome[J]. Nature. 2014, 505(7484): 559-63.

[21] Bolnick D I, Snowberg L K, Hirsch P E, et al. Individual diet has sex-dependent effects on vertebrate gut microbiota[J]. Nature Communications. 2014, 5(1): 1-13.

[22] Reichert-Stewart J L, Santymire R M, Armstrong D, et al. Fecal endocrine monitoring of reproduction in female snow leopards (Uncia uncia)[J]. Theriogenology. 2014,82(1):17-26.

[23] Han S, Guan Y, Dou H, et al. Comparison of the fecal microbiota of two free ranging Chinese subspecies of the leopard (Panthera pardus) using high-throughput sequencing[J]. PeerJ. 2019, 7: e6684.

[24] Chen L, Xu D, Sun M, et al. The effect of environment on intestinal microbial diversity of Panthera animals may exceed genetic relationship[J]. Front Microbiol. 2022,13:938900.

[25] Rosshart S P, Vassallo B G, Angeletti D, et al. Wild mouse gut microbiota promotes host fitness and improves disease resistance[J]. Cell. 2017, 171(5): 1015-1028 e13.

[26] Filidou E, Kandilogiannakis L, Shrewsbury A, et al. Probiotics: Shaping the gut immunological responses[J]. World J Gastroenterol. 2024,30(15):2096-2108.

[27] Zafar H, Saier M H, Jr. Gut Bacteroides species in health and disease[J]. Gut Microbes. 2021, 13(1): 1-20.

[28] Erwin P M, Rhodes R G, Kiser K B, et al. High diversity and unique composition of gut microbiomes in pygmy (Kogia breviceps) and dwarf (K. sima) sperm whales[J]. Scientific Reports. 2017,7(1):7205.

[29] Sun Y, Zhang S, Nie Q, et al. Gut firmicutes: Relationship with dietary fiber and role in host homeostasis[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2023,63(33):12073-12088.

[30] Guan, Y, Zhang, H, Gao, X, et al. Comparison of the bacterial communities in feces from wild versus housed sables (Martes zibellina) by high-throughput sequence analysis of the bacterial 16S rRNA gene[J]. AMB Express. 2016,6:98.

[31] Gao H, Chi X, Qin W, et al. Comparison of the gut microbiota composition between the wild and captive Tibetan wild ass (Equus kiang)[J]. Journal of Applied Microbiology. 2019, 126(6): 1869-1878.

[32] Wasimuddin, Menke S, Melzheimer J, et al. Gut microbiomes of free-ranging and captive Namibian cheetahs: Diversity, putative functions and occurrence of potential pathogens[J]. Molecular Ecology. 2017, 26(20): 5515-5527.

[33] Schmidt N S, Lorentz A. Dietary restrictions modulate the gut microbiota: Implications for health and disease[J]. Nutrition Research. 2021,89:10-22.

[34] Xing P Y, Pettersson S, Kundu P. Microbial Metabolites and Intestinal Stem Cells Tune Intestinal Homeostasis[J]. Proteomics. 2020,20(5-6):e1800419.

[35] Rose P, Riley L. Five ways to wellbeing at the zoo: improving human health and connection to nature[J]. Frontiers in Psychology. 2023,14:1258667.

[36] Zhang H, Liu G, Chen L, et al. Composition and diversity of the bacterial community in snow leopard (Uncia uncia) distal gut[J]. Annals of Microbiology. 2015, 65(2): 703-711.

[37] Atzeni L, Cushman S A, Bai D, et al. Meta-replication, sampling bias, and multi-scale model selection: A case study on snow leopard (Panthera uncia) in western China[J]. Ecology and Evolution. 2020, 10(14): 7686-7712.

[38] Hooper L V, Midtvedt T, Gordon J I. How host-microbial interactions shape the nutrient environment of the mammalian intestine[J]. Annual Review of Nutrition. 2002, 22: 283-307.

[39] Eshar D, Lee C, Weese J S. Comparative molecular analysis of fecal microbiota of bobcats (Lynx rufus) and domestic cats (Felis catus)[J]. The Canadian Journal of Veterinary Research. 2019, 83: 42-49.

基金资助

西藏农牧学院林学博士点（一期）项目(533325001)

国家重点研发项目(2023YFD1801304)