西藏娘亚牦牛耳组织成纤维细胞的分离培养

Isolation and Cultivation of Fibroblasts from the Ear Tissue of Niangya Yaks in Xizang

摘要

娘亚牦牛作为西藏那曲市嘉黎县的珍贵牦牛品种，对当地经济发展具有重要意义，但其较低的繁殖效率成为限制当地经济发展主要因素之一。为加快娘亚牦牛良种繁育进程，保护其种质资源，本研究采集3 ~ 4岁娘亚牦牛耳组织进行组织块贴壁法分离培养成纤维细胞，并对其生长曲线、细胞周期、细胞凋亡等进行了研究。结果显示，娘亚牦牛耳组织成纤维细胞生长曲线呈典型的“S”型，其潜伏期为3天，对数生长期从第4 天持续至第7 天，第8 天开始进入平台期；台盼蓝染色和细胞凋亡检测结果显示，冻存前后成纤维细胞的活率均能达到90%以上、细胞凋亡率分别为12.46%、14.8%，无显著性差异；细胞周期检测结果显示，原代细胞与第3代（F3）细胞之间并无太大差距，处于G₀ ~ G₂期细胞仍占据较大比重，且培养中均未发现细菌真菌及病毒污染。本试验成功对娘亚牦牛耳组织成纤维细胞进行了分离培养，不仅提供了娘亚牦牛耳组织成纤维细胞的培养方法，更丰富了娘亚牦牛种质资源。

Abstract

The Niangya yak, a prized breed in Jiali County, Naqu City, Xizang, holds significant economic importance for the local region. However, low reproductive efficiency has become one of the primary constraints hindering local economic development. To accelerate the breeding process and safeguard its genetic resources, this study collected ear tissue samples from 3 to 4 years old Niangya yaks and cultured fibroblasts using the tissue block adherence method. The growth curve, cell cycle, and apoptosis of these fibroblasts were systematically investigated. Results indicated that the growth curve of Niangya yak ear tissue fibroblasts exhibited a typical "S" shape, with a latency period of 3 days, a logarithmic growth phase from day 4 to day 7, and a plateau phase beginning on day 8. Trypan blue staining and apoptosis assays revealed that the viability of fibroblasts remained above 90% both before and after cryopreservation, with apoptosis rates of 12.46% and 14.8%, respectively, showing no significant differences. Cell cycle analysis demonstrated minimal variation between primary cells and third-generation (F3) cells, with a substantial proportion of cells remaining in the G₀ to G₂ phases. No bacterial, fungal, or viral contamination was detected during the culture process. This study successfully isolated and cultured fibroblasts from ear tissues of Niangya yaks, establishing a reliable method for in vitro fibroblast culture and thereby contributing to the preservation and enrichment of Niangya yak germplasm resources.

Graphical abstract

关键词

娘亚牦牛 / 耳组织成纤维细胞 / 细胞增殖 / 细胞凋亡 / 细胞周期

Key words

Niangya yak / Auricle fibroblast cells / Cell proliferation / Cell apoptosis / Cell cycle

牦牛是分布在我国青藏高原地区及其周围高山、亚高山地区的特有牛种^[1]，具有耐高寒、抗逆性强、肉质好等特点，是高原地区人民生活必需品的主要来源之一^[2]。娘亚牦牛作为生活在平均海拔4 500 m西藏自治区那曲市嘉黎县的珍贵牦牛品种，已成为中国国家地理标志产品之一^[3]。然而，有研究指出，高海拔低氧环境会显著降低牦牛的繁殖效率^[4]，与其他家畜相比，牦牛的繁殖力要低40% ~ 60%^[5,6]。不仅如此，娘亚牦牛作为单胎动物，特别是处于高海拔地区，其生长周期长，繁殖方式大多为自然交配，使得其繁殖性能受到极大的阻碍，因此保护其物种资源多样性极其重要。

体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）作为良种快速扩繁的最有效途径之一，在物种保护、转基因研究和疾病模型建立方面应用广泛^[7]。目前，SCNT技术在多个物种，如猪^[8]、牛^[9]、羊^[10]等的保种育种、疾病研究等方面取得了较好的效果。然而，SCNT技术克隆效率低、克隆胚胎异常发育等现象限制了其应用^[11]。有研究表明，供体细胞的质量是决定该技术能否成功的重要因素，未分化的干细胞较分化后细胞能够提供更多的克隆后代，而牛体细胞克隆最优的供体细胞选择之一是耳组织成纤维细胞^[12]。

成纤维细胞又被称为纤维母细胞，在细胞外基质成分的分泌、构建以及组织的创伤修复方面发挥着重要作用。有研究报道称，成纤维细胞贴壁时呈现细长状或梭形，具有很强的增殖能力，生长速度快，且来源广泛，是一种极易培养的细胞^[13]。近年来，随着成纤维细胞分离培养技术的完善，猪^[14]、牛^[15]、羊^[16]等物种的成纤维细胞分离培养已取得较大突破并已经实现了相应物种遗传资源的生物冷冻保种。然而，娘亚牦牛作为中国国家地理标志产品之一，尚未见有关于耳组织成纤维细胞研究的报道。因此，本试验旨在通过对娘亚牦牛耳组织成纤维细胞进行分离培养、绘制生长曲线，并进行细胞活力、细胞凋亡和细胞周期检测，探索娘亚牦牛耳组织成纤维细胞的培养方法，保护其种质资源。

1 试验材料

1.1 试验主要试剂

DMEM培养基购自甘肃亚克隆生物科技有限公司；胎牛血清（FBS），购自浙江硕华生命科学有限公司；0.4%台盼蓝染色液、DPBS，购自北京索莱宝科技有限公司；0.25%胰蛋白酶、双抗（青链霉素混合物，PS）、DMSO，购自美国赛默飞世尔科技公司；CCK8检测试剂盒，购自生工生物工程（上海）有限公司；凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。40 μm细胞筛、T25细胞培养瓶，购自美国赛默飞世尔科技公司；15 mL离心管、24孔细胞培养板、96孔细胞培养板、细胞冻存管，购自美国康宁公司。

1.2 试验主要仪器

CO₂培养箱（CCL-170B-8，新加坡艺思高科技有限公司），台式低速离心机（HDL-4，常州华奥仪器制造有限公司），倒置显微镜（DMIL，德国徕卡仪器有限公司），酶标仪（Spectra Max ID3，美谷分子仪器（上海）有限公司），细胞流式仪（CytoFLEX，美国贝克曼库尔特有限公司）。

2 试验方法

2.1 娘亚牦牛耳组织采集

平均年龄3 ~ 4岁的娘亚牦牛耳组织采集自西藏那曲市嘉黎县西藏娘亚牦牛养殖产业发展有限责任公司。用DPBS清洗取样处灰尘等杂质，用干净手术刀片刮去取样处被毛，使用碘酒棉球进行消毒处理，75%酒精棉球脱碘，灭菌耳缺钳剪取娘亚牦牛耳组织。在无菌环境中使用无菌手术刀片将耳组织残留毛发刮去，用无菌镊子夹取耳组织于75%酒精中快速浸洗60 s，再置于含双抗的DPBS中漂洗两次去除残留酒精。处理后的耳组织置于无菌真空袋中，使用真空机抽真空、密封，于4 ℃车载冰箱中带回实验室。

2.2 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞分离培养

采用组织块贴壁法培养娘亚牦牛耳组织成纤维细胞。在超净工作台中将组织块用75%酒精浸泡至10 ~ 20 s，置于含1%双抗的DPBS中清洗后，在3.4 cm培养皿中去除残留被毛、剔除软骨组织，再次用含1%双抗的DPBS清洗后，于干净培养皿中用无菌眼科剪将组织块剪碎为1 mm³大小的碎块。将碎块移入T25瓶中并在瓶底均匀铺开，加入3 mL FBS，于CO₂培养箱中倒置培养，培养条件为37 ℃、5% CO₂。6 ~ 8 h后将T25瓶翻转，使FBS浸润组织，24 h后更换为含10% FBS的DMEM培养基，每隔2 d更换1次培养液。

2.3 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞的纯化培养与传代

原代成纤维细胞生长至80% ~ 90%时，弃去培养基，用2 mL含1%双抗的DPBS润洗两遍，弃去DPBS，加入适量提前预热的0.25%胰蛋白酶，置于37 ℃培养箱中消化5 ~ 10 min。显微镜下观察，待80%左右细胞呈圆球形脱壁后，用移液枪反复吹打至细胞全部脱落，向培养皿中加入体积为0.25%胰蛋白酶2 ~ 3倍的DMEM进行终止消化。用40 μm细胞筛过滤细胞悬液至15 mL离心管中，1 200 r/min离心5 min，弃上清，使用含15% FBS和1%双抗的DMEM培养基重悬细胞，并接种于T25瓶中。按照“∞”字交叉法使细胞均匀铺在瓶底，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，前3 d每隔24 h更换1次培养基，之后每隔2 d更换1次培养基。传代2 ~ 3次即可得到纯化的娘亚牦牛耳组织成纤维细胞。

2.4 细胞冻存与复苏

细胞冻存：待T25瓶中细胞生长至90%时，弃去培养基，用含1%双抗的DPBS润洗两遍。加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶，消化5 ~ 10 min，收集细胞，1 200 r/min离心5 min，弃上清。用含1%双抗的DPBS清洗两遍。取7 mL DMEM培养基，加入2 mL FBS、1 mL DMSO，配制成细胞冻存液。取适量冻存液重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁵个/mL，均分至细胞冻存管中。按照4 ℃ 30 min、-20 ℃ 2 h、-80 ℃过夜、次日放置于液氮中进行冻存。

细胞复苏：取出液氮中细胞，迅速置于37 ℃水浴锅中解冻2 ~ 4 min，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入3 ~ 4 mL含15% FBS和1%双抗的DMEM培养基重悬细胞，按照“一传三”接种于新的T25瓶中，补加培养基至5 mL，置于培养箱中培养。

2.5 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞生长曲线绘制方法

使用CCK8检测试剂盒进行娘亚牦牛耳组织成纤维细胞的生长曲线绘制。向96孔细胞培养板中接种入100 μL密度为1×10⁴个/mL的细胞。设置不接种细胞孔作为空白对照，从接种日起算，每24 h进行1次测定，连续测定10 d，每次测定进行3个重复。测定时，向测定孔中加入10 μL CCK-8 Solution，37 ℃、5% CO₂条件下孵育0.5 ~ 4 h，于450 nm波长下测定OD值。

2.6 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞活力检测

使用台盼蓝染色液检测冻存前后细胞的活力。使用移液枪吸取9 μL细胞悬液加入1 μL 0.4%台盼蓝染色液混匀，将血球计数板置于显微镜下进行计数，统计细胞活率。活细胞完整不着色，死细胞着色为蓝色。

2.7 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞凋亡检测

采用一步法检测娘亚牦牛耳组织成纤维细胞的凋亡。T25瓶中细胞生长至90%时，用0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞。300 r/min离心5 min，弃上清，用DPBS洗涤后，离心弃上清，加入500 μL 1 × Annexin V Binding Buffer重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC Reagent和5 μL PI Reagent（50 μg/mL），混匀后避光孵育15 ~ 20 min，于细胞流式仪上机检测。冻存后细胞用DPBS洗涤后，按照上述步骤进行凋亡检测。

2.8 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞周期检测

使用细胞周期检测试剂盒进行娘亚牦牛耳组织成纤维细胞的周期检测。T25瓶中细胞生长至90%时，用0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞。用DPBS清洗后，300 r/min离心5 min，弃上清，加入0.3 mL DPBS重悬细胞，再加入1.2 mL -20 ℃的无水乙醇，充分混匀后置于-20 ℃冰箱中1 h或过夜。用DPBS清洗细胞后，300 r/min离心5 min，弃上清，静置15 min后加入100 μL RNase A Reagent 充分悬浮细胞，37 ℃水浴30 min。加入400 μL PI Reagent（50 μg/mL）并充分混匀，2 ℃ ~ 8 ℃避光孵育30 min。进行细胞流式仪上机检测。

2.9 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞细菌真菌及病毒检测

将细胞接种于24孔细胞培养板中，加入1 mL培养基培养3 d，对照组仅加入1 mL培养基。观察培养基是否出现杂质或培养基颜色是否变黄，检测是否有细菌真菌污染。使用显微镜观察细胞中是否有空斑、蚀斑，检测病毒污染。

3 统计分析

使用Excel 2021软件对数据进行整理，使用GraphPad Prism 8.0.2对数据进行分析和作图。使用MFLT32软件分析细胞周期。

4 结果

4.1 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞分离培养纯化结果

组织块贴壁培养时，原代细胞从组织中迁移出的速度较慢（图1），培养至第9 天时，可看到组织块周围出现梭形、纺锤形或星状的扁平细胞。培养至第14 天时，梭形扁平细胞生长至铺满T25瓶底的70%；培养至第16 天时，细胞几乎铺满整个瓶底。传代至第3代时即可获得纯化成纤维细胞（图2），传代培养48 h，梭形细胞呈现零散贴壁生长状态；传代培养120 h，细胞生长至90%。

4.2 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞生长曲线绘制结果

娘亚牦牛耳组织成纤维细胞生长曲线呈“S”型（图3）。细胞贴壁后，其生长经历增长期、对数期及平台期，基本符合细胞体外生长规律。在细胞贴壁培养的第1 ~ 3 天，细胞生长缓慢；培养的第4 ~ 7 天，细胞生长迅速，呈现对数生长；培养的第8 ~ 10 天，细胞处于生长抑制阶段，增长缓慢。

4.3 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞活力检测结果

娘亚牦牛耳组织成纤维细胞冻存前使用台盼蓝进行染色，细胞平均活率为93.2%（图4A），冻存细胞复苏后染色，细胞平均活率为90.78%（图4B），二者之间无显著性差异。

4.4 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞凋亡检测结果

收集细胞用于娘亚牦牛耳组织成纤维细胞凋亡检测（图5）。待细胞生长至90%时，用0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞，进行凋亡检测。冻存前后，娘亚牦牛耳组织成纤维细胞凋亡率分别为12.46%、14.8%，二者之间无显著性差异（P > 0.05）。

4.5 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞周期检测结果

娘亚牦牛耳组织成纤维细胞周期检测结果如图6所示。原代细胞处于G₀/G₁期的细胞占比为70.35%；S期细胞占比20.13%；G₂/M期细胞占比9.52%。第3代（F3）细胞处于G₀/G₁期的细胞占比为72.31%；S期细胞占比20.01%；G₂/M期细胞占比7.68%。

4.6 娘亚牦牛耳组织成纤维细胞细菌真菌及病毒检测结果

娘亚牦牛耳组织成纤维细胞在培养过程中未见培养基中出现絮状杂质、培养基未改变颜色，说明无细菌真菌污染；在显微镜下观察时，未见空斑、蚀斑等，说明无病毒感染（图7）。

5 讨论

5.1 关于娘亚牦牛耳组织成纤维细胞分离培养的讨论

当前研究报道中，动物的体细胞分离培养方法一般为胰酶消化法和组织块贴壁法^[17]。有研究指出，胰酶消化法虽能够去除细胞间质，使细胞以悬液的形式分离，但该方法容易造成细胞污染，且胰蛋白酶消化细胞时间不宜控制，长时间消化会使细胞形态发生改变，对细胞造成损伤^[18]。组织贴壁法虽培养时间长，但其操作简单，在培养过程中可较大程度减少细胞污染概率，且细胞生长是原始细胞从组织块中游离出到培养基中进行扩增，更利于后期细胞培养^[19]。因此，本研究选择组织贴壁法作为娘亚牦牛耳组织成纤维细胞分离培养的方法。

5.2 关于娘亚牦牛耳组织成纤维细胞特性的讨论

娘亚牦牛耳组织成纤维细胞原代培养时，第9 天可见细胞从组织块中爬出，第16 天时即可生长至90%以上，这与已报道的奶牛原代耳组织成纤维细胞培养生长周期接近^[7]。而在另一项研究中，8岁河北地区牦牛耳组织成纤维细胞培养5 天即可观察到细胞爬出，之后每72 h即可传代1次^[20]。本研究3 ~ 4岁娘亚牦牛耳组织成纤维细胞原代培养时间远超上述研究，且传代培养120 h后才可达到铺满T25瓶90%左右，与上述研究有较大的差距，其原因一方面可能是两者牦牛品种不同，体细胞培养过程中细胞分裂过程及时间不同；另一种原因可能是西藏高海拔地区低氧环境可能引起体细胞原代生长速度缓慢等问题^[21]。而在使用CCK8试剂检测娘亚牦牛耳组织成纤维细胞群密度，并绘制生长曲线后，发现其生长趋势呈典型“S”型，潜伏期为3 天，对数生长期可持续至第7 天，之后细胞进入平台期。这与已报道的麦洼牦牛^[22]、野牦牛^[23]耳组织成纤维细胞培养情况基本一致，说明娘亚牦牛耳组织成纤维细胞符合动物细胞体外培养的一般生长规律。

5.3 关于娘亚牦牛耳组织成纤维细胞冻存及传代的讨论

台盼蓝染色作为一种可快速鉴别活细胞的染色剂，广泛应用于细胞活力检测中^[24]。本研究染色结果显示，娘亚牦牛耳组织成纤维细胞冷冻后，其活率仍能够达到90.78%，较任子利等^[25]培养的牦牛胎儿成纤维细胞复苏后活率低，可能是二者所用牦牛细胞来源不同所致。而细胞冻存前后其凋亡率分别为12.46%、14.8%，这与Chacón等^[26]对牛成纤维细胞冷冻前后细胞凋亡检测的凋亡率增长情况基本一致。细胞周期检测显示，原代娘亚牦牛耳组织成纤维细胞经传代后，第3代（F3）细胞中处于G₀ ~ G₂期细胞占比仍能够达到90%以上，说明娘亚牦牛耳组织成纤维细胞在多次传代后仍具有较好的遗传增殖能力。这与已报道的南阳黄牛成纤维细胞传代培养中前4代细胞可稳定增殖结果一致^[27]。同时，娘亚牦牛耳组织成纤维冻存后传代经真菌、细菌和病毒检测均无污染，说明该方法培养的娘亚牦牛耳组织成纤维细胞可进行长期保存，用于种质资源保护。

6 结论

本研究采用组织块贴壁法成功对娘亚牦牛耳组织成纤维细胞进行了分离培养，并对该细胞生长特性进行了测定。该方法培养的成纤维细胞经冻存后仍能保持90.78%的活率，其凋亡率与冻存前无显著性差异，且传代过程无污染，仍能够保持良好的遗传特性。本研究不仅探索了娘亚牦牛耳组织成纤维细胞贴壁培养的方法，同时丰富了娘亚牦牛种质资源。

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基金资助

西藏自治区科技厅区域科技协同创新专项(QYXTZX-NQ2022-04)

西藏自治区科技厅重点研发计划项目(XZ202001ZY0044N)

西藏自治区基层农技推广体系示范基地建设项目(XZNYSFJD202509)