西藏青稞根部内生拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及防病促生特性

Screening and Identification of Root Endophytic Antagonistic Bacillus from Xizang Highland Barley and Their Biocontrol and Plant Growth-Promoting Traits

摘要

为获得生防菌资源，本研究采用稀释涂布平板法从青稞根部分离纯化内生细菌，通过平板对峙试验筛选获得2株高效内生拮抗菌，并通过无菌发酵滤液和挥发性物质抑菌试验分析其抑菌活性，结合菌落形态、生理生化特征及16S rDNA/gyrB序列分析进行菌种鉴定。研究结果显示，2株菌对3种病原菌的平板抑制率均超过75%；在无菌发酵滤液抑菌试验中，菌株ZDR20对3种病原菌的抑制率为79.45% ~ 84.69%，ZDT27对3种病原菌的抑制率范围为75.25% ~ 92.98%，2株菌均对青稞条纹病菌的抑制率最高；在挥发性物质抑菌试验中，菌株ZDR20与ZDT27对青稞条纹病菌、小麦根腐病菌的抑制率分别为60.04%与34.46%、60.04%与34.46%，但2株菌均对小麦赤霉病菌无抑制作用。胞外酶检测结果显示，2株菌均具有分泌葡聚糖酶、蛋白酶等5种胞外酶的能力。经鉴定菌株ZDR20与ZDT27均为Bacillus amyloliquefaciens。本研究成功筛选出2株高效内生拮抗细菌，可为作物病害生物防治与生防菌剂开发提供优良菌种资源与理论依据。

Abstract

To obtain biocontrol microbial resources, endophytic bacteria were isolated and purified from highland barley roots by the dilution plate method in this study. 2 highly efficient antagonistic endophytic strains were screened via the plate confrontation assay. Their antifungal activities were further evaluated using cell-free fermentation filtrates and volatile compounds. Strain identification was performed based on colony morphology, physiological and biochemical characteristics, as well as sequence analysis of the 16S rDNA and gyrB genes. The results showed that the 2 strains exhibited plate inhibition rates of more than 75% against the three pathogenic fungi. In the test of cell-free fermentation filtrates, the inhibition rates of strain ZDR20 against the three pathogens ranged from 79.45% to 84.69%, and those of strain ZDT27 ranged from 75.25% to 92.98%. Both strains had the strongest inhibitory effect on Pyrenophora graminea. In the volatile antifungal test, the inhibition rates of ZDR20 and ZDT27 against Pyrenophora graminea and Bipolaris sorokiniana were 60.04% and 34.46%, respectively. Neither strain showed inhibitory activity against Fusarium graminearum. Extracellular enzyme assays indicated that both strains could produce 5 kinds of extracellular enzymes including glucanase and protease. Strains ZDR20 and ZDT27 were finally identified as Bacillus amyloliquefaciens. In summary, 2 excellent antagonistic endophytic bacteria were successfully obtained in this study, which can provide valuable strain resources and a theoretical basis for biological control of crop diseases and the development of biocontrol agents.

Graphical abstract

关键词

芽孢杆菌 / 内生细菌 / 拮抗活性 / 促生测定 / 菌种鉴定

Key words

Bacillus / Endophytic bacteria / Antagonistic activity / Growth promotion test / Strain identification

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.）是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，是栽培大麦的变种，其显著特征是成熟时籽粒内外稃与颖果分离，籽粒呈裸露状态，因此也称之为裸大麦^[1]。中国是世界上青稞分布范围最广、种植面积最大的国家，其种植区域主要集中于西藏、青海、四川、甘肃和云南的藏区^[2]，具有生长周期短、产量高、耐寒、抗旱、对贫瘠土壤有较强的适应能力等特性^[3,4]。调查发现，由麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）引起的青稞条纹病，可导致青稞年均产量损失10%左右，严重时可达25%；由平脐蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）引起的小麦根腐病，每年可导致小麦粮食损失占小麦总产量的10%以上^[5]；由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起小麦赤霉病，大流行时可导致小麦减产10% ~ 40%，中度流行时可导致小麦减产5% ~ 15%^[6]。因此，开发安全、高效、环境友好的生物防治策略，已成为青稞病害综合防控中亟待解决的关键问题。

植物内生菌是指能够定殖于植物组织内部，且不引起植物病害的微生物类群，包括细菌、放线菌和真菌，其中内生细菌是植物微生物组中的优势类群^[7]。它们通过产生抗菌活性物质、水解酶类、挥发性有机物等多种机制抑制病原菌的生长，同时还能分泌植物生长激素（如IAA）等，并具有固氮、解磷等促进植物生长等功能^[8,9]。近年来，从作物根部分离具有拮抗和促生特性的内生细菌，并利用其防治土传病害已成为研究热点。有研究发现，根、叶内生菌能通过分泌可扩散物质和挥发性有机物来抑制病原菌，展现出巨大的生防潜力^[10]；从燕麦根部分离得到内生细菌能够有效防治燕麦炭疽病，并对燕麦有促生效果^[11]。芽孢杆菌（Bacillus spp.）是一类重要的生防菌资源，已有研究从西藏山南、日喀则、林芝3个地区的青稞样品中筛选出对禾谷镰刀菌具有较好生防效果的贝莱斯芽孢杆菌RKZ-05，其无菌发酵液能显著抑制禾谷镰刀菌菌丝生长和DON毒素合成^[12]；黄馨玉等^[13]分离的贝莱斯芽孢杆菌Sneb2570对黄瓜枯萎病菌抑制率为61.64%，该菌株具有分泌蛋白酶、磷酸酯酶、淀粉酶等胞外水解酶的能力，对黄瓜枯萎病的盆栽和田间防效分别为44.12%和45.24%。然而，关于西藏高原青稞根部内生细菌研究仍相对有限。西藏气候条件差异显著，其特有的高原生态环境可能孕育着独特的微生物资源，挖掘这些地区的青稞内生拮抗菌株，对于开发适应高原环境的生物防治菌剂具有重要意义。

本研究以西藏阿里地区札达县、拉萨市堆龙德庆区采集的健康青稞根部为材料，分离纯化内生细菌，以青稞条纹病菌、小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌为靶标，筛选具有拮抗活性的菌株，并进一步测定其无菌发酵滤液、挥发性物质的抑菌活性以及产胞外酶能力；结合形态学、生理生化特征及16S rDNA和gyrB基因序列分析对目标菌株进行鉴定，旨在为作物病害生物防治提供优良菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样本采集

样本于2024年7月采自西藏自治区阿里地区札达县、拉萨市堆龙德庆区。采用5点取样法，选取健康的青稞植株，先用铁锹将根部挖出，然后用无菌剪刀从茎部剪断并装入无菌采样袋中，最后放入4 ℃车载冰箱中保存。

1.1.2 供试病原菌

供试病原菌青稞条纹病菌（Pyrenophora graminea）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）和小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）均由西藏农牧大学植物病理实验室提供，菌株保存于零下80 ℃甘油中（终浓度20%）。试验前将病原菌接种至PDA固体培养基，28 ℃恒温培养5 d活化，备用。

1.1.3 培养基与试剂

（1）分离培养基

LB培养基：琼脂18 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，胰蛋白胨10 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0；R2A培养基、TSA培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。PDA培养基：琼脂18 g，去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）促生测定培养基

阿须贝氏培养基、无机磷培养基和CAS培养基均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。解钾培养基^[14]：葡萄糖5 g、七水硫酸镁0.5 g、碳酸钙0.1 g、磷酸三钙2 g、钾长粉2 g、六水氯化铁0.008 g、蒸馏水1 000 mL，灭菌后加入溴百里酚蓝显色剂。

（3）IAA显色液

Salkowski显色液的配制参考文献^[11]，将硫酸铁替换为氯化铁。具体配置方法：0.5 mol/L FeCl₃溶液10 mL，35% HClO₄ 500 mL。

1.2 方法

1.2.1 青稞根部内生细菌的分离纯化

采用稀释涂布平板法分离青稞根部内生细菌^[15]。将采集的青稞样本在超净工作台中进行严格的表面消毒，然后将消毒后的根段放入无菌研钵中，加入18 mL无菌PBS缓冲液（pH 7.2），充分研磨至匀浆状，静置5 min后，取上清液1 mL，用无菌PBS按10倍梯度稀释至10^-3、10^-4、10^-5，每个稀释梯度取100 μL分别涂布于LB、R2A、TSA平板上，每种培养基、每个稀释梯度重复3次。平板倒置后置于28 ℃恒温培养箱，培养2 ~ 5 d，每日观察菌落生长情况。根据菌落形态（颜色、大小、边缘、隆起度）挑取不同类型的单菌落，接种至LB平板上纯化培养后于4 ℃冰箱保存备用（保存期不超过1个月，每月转接1次），同时制备20%甘油菌悬液于零下80 ℃长期保存。

1.2.2 青稞根部内生拮抗菌的筛选

参考林胜楠等^[16]的方法对内生细菌进行拮抗活性评估。在超净工作台中将病原菌菌饼（直径4 mm）接种至PDA平板中央，然后在距中心20 mm的左右两侧用无菌竹签划线接种待测内生细菌，以仅接种病原菌的平板为对照。每个处理设3次重复，将平板置于28 ℃条件下培养7 d，测量各处理的菌落直径并计算抑制率。计算公式如下：

\mathrm{抑制}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{对照}\mathrm{组菌}\mathrm{落直}\mathrm{径}-\mathrm{处理}\mathrm{组菌}\mathrm{落直}\mathrm{径})/(\mathrm{对照}\mathrm{组菌}\mathrm{落直}\mathrm{径}-\mathrm{菌饼}\mathrm{直径})\times \mathrm{100}{\mathrm{\%}}^{[\mathrm{17}]}（1）

1.2.3 内生拮抗菌无菌发酵滤液拮抗测定

无菌发酵滤液的制备：将拮抗菌株接种于LB液体培养液中，在振荡培养箱28 ℃、180 r/min条件下培养至OD₆₀₀为0.6 ~ 0.8后，按10%（v/v）接种量转接至新的LB液体培养液中，再次置于振荡培养箱内以相同条件培养48 h后，取发酵液经10 000 r/min离心10 min后收集所得上清液，经孔径为0.22 μm的一次性微孔滤膜过滤后获得无菌发酵滤液。将无菌发酵滤液与PDA培养基按体积比1:5充分混合后制成平板，待平板冷却后将病原菌菌饼接种于含无菌发酵滤液的PDA平板中央，在不含无菌发酵滤液的PDA平板中央接种病原菌作为对照^[18]。每个处理设3次重复，将平板置于28 ℃条件下培养7 d，测量各处理的菌落直径并计算抑制率。

1.2.4 内生拮抗菌挥发性物质拮抗测定

参考原甜甜等^[19]的方法测定内生细菌挥发性物质的拮抗作用。拮抗菌株按照上述方法制成发酵液后，取200 μL均匀涂布于LB平板上，然后将只接种了病原菌菌饼的PDA平板倒扣在涂布了拮抗菌的LB平板上方，以在下方LB平板上不接种拮抗菌的平板为对照。每个处理设3次重复，将平板置于28 ℃条件下培养7 d，测量各处理的菌落直径并计算抑制率。

1.2.5 内生拮抗菌产胞外酶测定

采用平板检测法定性检测内生细菌产胞外酶特性。按照1.2.3方法制备菌悬液，然后用移液枪取10 μL菌悬液接种至各检测平板上，平板封口于28 ℃恒温培养3 d后观察检测结果。纤维素酶和果胶酶检测平板先用1 g/L刚果红染色20 min，然后用58.44 g/L氯化钠脱色15 min，若观察到菌落周围产生透明圈，则表明菌株具有分泌纤维素酶和果胶酶的能力^[20]。葡聚糖酶和蛋白酶检测平板，若观察到产生透明圈则表明菌株具有分泌葡聚糖酶和蛋白酶的能力；淀粉酶检测平板用碘液染色3 min后观察颜色变化，若在菌落周围产生透明圈，则表明菌株具有分泌淀粉酶的能力^[21]。

1.2.6 促生能力测定

（1）内生拮抗菌固氮、溶磷、解钾、产铁载体能力测定

采用阿须贝氏培养基法^[22]测定菌株的固氮能力。将内生拮抗细菌首先接种于LB液体培养液中，在28 ℃、180 r/min的条件下培养24 h后，用无菌竹签挑取单菌落后划线接种于阿须贝平板上。若连续转接3次都能正常生长，则表明菌株具有初步固氮能力。

采用无机磷固体培养基法^[23]测定菌株的溶磷能力。内生拮抗细菌按照1.2.3的方法获得菌悬液后，用无菌竹签蘸取菌悬液点接至无机磷平板上。平板置于28 ℃恒温培养箱中培养7 d，观察菌落周围是否产生透明圈，若产生透明圈，则表明菌株具有溶解无机磷的能力。

采用钾长石固体培养基^[24]测定菌株的解钾能力。菌株接种方式和平板培养时间与上述方法一样。观察菌落周围是否产生黄色晕圈，若产生黄色晕圈，则表明菌株具有解钾的能力。

采用CAS固体培养基法^[25]测定菌株的产铁载体能力。菌株接种方式和平板培养时间与上述方法一样。观察菌落周围是否产生黄色晕圈，若产生黄色晕圈，则表明菌株具有产铁载体的能力。

（2）IAA定性测定

参考吴晓东等^[26]的方法进行测定。挑取内生细菌接种于LB液体培养液中培养至OD₆₀₀为0.6 ~ 0.8后转移至含色氨酸（0.2 g/L）的LB液体培养液中（5%接菌量），在振荡培养箱内28 ℃、180 r/min条件下培养48 h后，经10 000 r/min离心5 min获得上清液。取上清液与Salkowski显色液等量混合于2 mL离心管中，置于室温避光条件下30 min，观察反应液颜色变化，重复3次，以10 mg/L IAA标准液为阳性对照、以未接菌的液体培养液（含0.2 g/L色氨酸）为阴性对照，若反应液颜色变为红色，则表示菌株具有合成IAA的能力^[27]。

1.2.7 内生拮抗菌鉴定

（1）形态及生理生化鉴定

将菌株划线接种于LB平板上，28 ℃培养48 h后观察其形态特征，根据《常见细菌系统鉴定手册》^[28]对菌株进行革兰氏染色、甲基红、V-P、明胶液化、硝酸盐还原、硫化氢产气、柠檬酸盐利用等生理生化测定。

（2）分子生物学鉴定

使用细菌鉴定通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R（5'-GGTTACCTTG TTACGACTT-3'）进行PCR扩增16S rDNA的部分序列，使用引物UP1（5'-GAAGTCATC ATCAGACCG TTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'）和UP2r（5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACR TCNGCRTCNCTCAT-3'）扩增gyrB基因的部分序列^[29]。菌株DNA的提取和PCR扩增测序，由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。返回序列用PhyloSuite拼接后，上传至NCBI数据库与已知菌株的序列进行同源性比对，用MEGA11软件采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建系统发育树^[30]，并采用Bootstrap法进行1 000次重复检验各分支的支持率，进而确定菌株的分类地位。

1.2.8 数据统计与分析

使用Excel 2021和SPSS 25进行数据整理和差异显著性分析（显著性水平为P < 0.05），利用Photoshop 2018进行作图。

2 结果与分析

2.1 青稞根部内生细菌的分离纯化

从2个采样的青稞样本中共分离获得176株内生细菌，其中阿里地区札达县的样本中分离获得103株，占细菌分离株的58.52%；拉萨市堆龙德庆区的样本中分离获得73株，占细菌分离株的41.48%。

2.2 青稞根部内生拮抗菌的筛选

采用平板对峙法对176株内生细菌进行拮抗初筛，以“对3种病原菌的抑制率均 ≥ 75%”为筛选标准，获得2株高效拮抗菌，分别命名为ZDR20与ZDT27。由表1可知，菌株ZDR20对3种病原菌的抑制率范围为79.45% ~ 84.69%，其中对青稞条纹病菌的抑制率显著高于对小麦根腐病菌（80.63%）和小麦赤霉病菌（79.45%）的抑制率（P < 0.05）；ZDT27对3种病原菌的抑制率范围为75.25% ~ 92.98%，其中对青稞条纹病菌的抑制率显著高于对小麦根腐病菌（82.13%）和小麦赤霉病菌（75.25%）的抑制率（P < 0.05）。结合平板对峙直观结果（图1），2株菌处理组的病原菌菌落直径明显小于对照组，为进一步证实其拮抗能力，选取这2株菌进行后续抑菌活性验证、机制探索及菌种鉴定。

2.3 内生拮抗菌无菌发酵滤液拮抗测定

为验证内生拮抗细菌的次生代谢产物是否对病原菌具有拮抗作用，测定了内生细菌无菌发酵滤液对3种病原菌的抑制率（表2、图2）。结果表明，菌株ZDR20对3种病原菌的抑制率范围为40.90% ~ 92.65%，其中对小麦根腐病菌的抑制率显著高于对青稞条纹病菌（84.98%）和小麦赤霉病菌（40.90%）的抑制率（P < 0.05）；ZDT27对3种病原菌均具有抑制作用，且对青稞条纹病菌抑制率最强。

2.4 内生拮抗菌挥发性物质拮抗测定

为验证内生细菌的挥发性物质是否对病原菌具有拮抗作用，测定了内生细菌挥发性物质对3种病原菌的抑制率（表3、图3）。结果表明，菌株ZDR20和ZDT27的挥发性物质对青稞条纹病菌、小麦根腐病菌具有明显的拮抗活性，但都对小麦赤霉病菌无拮抗活性。

2.5 内生拮抗菌产胞外酶测定

为探索内生细菌的抑菌机制，对内生细菌进行了产胞外酶检测，检测结果见表4，检测效果见图4。结果表明，2株内生细菌均能分泌果胶酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶和蛋白酶。

2.6 促生能力测定

（1）内生拮抗菌固氮、溶磷、解钾、产铁载体能力测定

采用平板培养法对2株内生拮抗菌开展功能定性检测。供试菌株在阿须贝氏培养基上连续转接3次均可正常生长，初步证实2株菌均具有固氮能力；菌株ZDT27可在无机磷平板形成明显解磷圈，在解钾平板产生清晰黄色晕圈，说明其兼具解无机磷与解钾功能；而2株菌在CAS培养基上均未出现黄色晕圈，表明二者均不具备分泌铁载体的能力（图5）。

（2）IAA定性测定

产IAA定性分析结果见图6，2株菌分别与Salkowski显色液反应后，与对照组相比均无颜色变化，表明这2株菌均不具备合成IAA的能力。

2.7 内生拮抗菌鉴定

（1）形态及生理生化鉴定

将2株拮抗菌接种于LB固体培养基，28 ℃培养48 h后观察形态特征。菌株ZDR20（图7-A）菌落呈灰白色，表面光滑湿润呈圆形凸起状，质地黏稠、半透明；菌株ZDT27（图7-B）菌落呈乳白色、不透明，表面有褶皱、凸起，边缘不规则。参照《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化测定（表5），结果显示，2菌株均为革兰氏阳性菌，甲基红、V-P试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验和接触酶试验均呈阳性，硫化氢试验和柠檬酸盐试验均呈阴性。结合形态特征与生理生化结果，初步将ZDR20和ZDT27归为芽孢杆菌属（Bacillus）。

（2）分子生物学鉴定

将菌株测序结果放入NCBI进行BLAST同源性比对分析并构建系统发育树，结果显示，2株菌与Bacillus amyloliquefaciens strain DSM7聚为一支，且与其他芽孢杆菌物种分支清晰（图8）。结合形态特征、生理生化结果，最终确定菌株ZDR20和ZDT27为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3 讨论与结论

3.1 讨论

化肥、农药过量使用引发土壤退化、生态受损、作物减产等问题。生物防治可降低化学农资依赖，护生态、稳防效、提高农产品品质并改良土壤，综合优势显著。挖掘植物功能内生菌以替代化学农用品，现已成为农业微生物研究热点。内生菌与宿主互利共生，既能促进植株生长健康，也助力生物多样性研究、天然产物挖掘与新药研发。青稞是青藏高原的重要粮食作物，但长期受连作障碍和土传病害影响，传统化学防控方式还易带来生态环境问题^[31]。因此，筛选适应高原环境的本土内生生防菌，对青稞病害绿色防控具有重要意义^[32]。

迄今为止，研究较多的植物病害生防菌包括芽孢杆菌属、假单胞菌属、木霉属等^[33]。针对小麦赤霉病和小麦根腐病，芽孢杆菌属与木霉菌属等内生菌的菌体抑菌率可达75%以上，发酵液抑菌率可达90%以上^[34-36]。本研究筛选的菌株ZDR20和ZDT27对青稞条纹病菌、小麦赤霉病和小麦根腐病的抑菌率均为75%以上。

目前有关植物内生菌代谢产物抑菌活性的研究日益增多，其抑菌效果与作用机制因病原菌种类不同而呈现差异化。本研究通过无菌发酵滤液与挥发性物质抑菌试验进一步分析菌株抑菌活性，在无菌发酵滤液抑菌试验中，2株菌的次生代谢产物对3种病原菌有明显抑菌作用且抑菌效果相近；在挥发性物质抑菌试验中，2株菌对青稞条纹病菌的抑制率均最高，且均对小麦赤霉病菌无抑制作用。抑菌机制研究表明，ZDR20和ZDT27的无菌发酵滤液对3种病原菌均具有较强抑制作用，其中ZDR20对小麦根腐病菌的抑制率达到92.65%。以上结果表明，菌株无菌发酵液与挥发性物质确有抑菌作用，这与王麒^[37]、巫瑞等^[38]研究发现的“菌株可通过发酵液代谢产物与挥发性物质抑菌”结果相符。胞外酶是协助拮抗菌抑制病原菌生长的关键因子。刘子瑶等^[39]研究发现贝莱斯芽孢杆菌LXS-N2具有分泌蛋白酶和纤维素酶的能力，其菌体和发酵液对病原菌的抑制效果比无菌发酵滤液好，且过滤后的细胞破碎液对病原菌仍然具有较好的抑菌性，表明菌株LXS-N2具有产生细胞壁降解酶的能力，可以通过破坏病原菌细胞壁达到抑制病原菌生长的目的，主要是通过活菌发挥抑菌作用。本研究中2株菌均可分泌果胶酶、淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶等胞外酶，这些酶能够破坏病原菌细胞结构并抑制其生长，是其发挥生防作用的重要机制之一^[40]。

促生功能测定结果显示，ZDR20和ZDT27均具有固氮能力，其中ZDT27还具有溶磷和解钾功能，可促进土壤养分活化和植物吸收利用，从而促进青稞生长。但2株菌均未检测到产铁载体和IAA合成能力，推测可能与其长期适应高原特殊生态环境有关，其具体促生机制仍需进一步研究。

目前，关于西藏地区青稞内生菌的研究仍相对有限。本研究主要基于离体条件开展抑菌与促生功能分析，后续仍需通过盆栽及田间试验进一步验证其实际应用效果，并深入解析菌株定殖机制及生物菌剂制备工艺，为其在高原农业中的产业化应用奠定理论基础。

3.2 结论

本研究从青稞根部筛选获得2株内生拮抗细菌，通过无菌发酵滤液、挥发性抑菌物质及5种胞外酶协同作用实现对青稞条纹病菌、小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌的抑制作用。综合评价显示，菌株ZDT27对3种病原菌的抑制效果优于菌株ZDR20，但2株菌的具体抑菌物质需进行进一步分离与结构鉴定。

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基金资助

国家自然科学基金(31960002)

高校发展改革专项资金植物保护学科建设(YJSXK202605)