基于系统性硬化症溶酶体相关基因的人工神经网络模型的构建及实验验证

Construction and experimental verification of artificial neural network model based on lysosome related genes in systemic sclerosis

摘要

目的 建立基于GEO数据库硬皮病溶酶体相关基因的随机森林和人工神经网络（artificial neural network，ANN）联合诊断模型并评价其效果。 方法 通过GEO数据库获取4份硬皮病芯片，从AmiGO2数据库中获取875个溶酶体相关基因。其中GSE95065及GSE76807合并作为实验组数据集，使用随机森林算法筛选硬皮病溶酶体相关特征基因，并用特征基因构建人工神经网络模型，用10折交叉验证模型准确性。再用验证数据集GSE32413与GSE59787对模型进一步验证，利用ROC曲线下面积值评估模型准确性。最后用实时荧光定量PCR （real‑time quantitative PCR， RT‑qPCR）进行实验验证。 结果 共获取差异基因46个，其中上调基因16个，下调基因30个。进一步通过随机森林筛选得到最相关的6个特征基因（LYN、TNFAIP3、RNF128、MCOLN3、ANKFY1、PLD3），并构建ANN诊断模型。使用该模型绘制了实验组和验证组诊断的ROC曲线，AUC值为0.999。10折交叉验证AUC平均值大于0.980。验证组AUC为0.740和0.732。RT‑qPCR结果表明与对照组相比，硬皮病中LYN（P=0.004）、TNFAIP3（P=0.000 1）表达量明显上调，而RNF128（P=0.000 2）、MCOLN3（P=0.001）、ANKFY1（P=0.02）、PLD3（P<0.000 1）表达量在硬皮病组中明显下调。与机器学习算法结果相一致。 结论 构建了硬皮病溶酶体相关特征基因的ANN诊断模型，为探索硬皮病发病机制提供了一个新视角。

Abstract

Objective To establish a combined random forest and artificial neural network diagnosis model of lysosome related genes in scleroderma based on GEO database and evaluate its effect. Method Four scleroderma chips were obtained from GEO database. GSE95065 and GSE76807 were combined as training data set， and random forest algorithm was used to screen scleroderma lysosome‑related characteristic genes. The artificial neural network model was constructed with characteristic genes， and the accuracy of the model was verified by 10‑fold crossover. Then the verification data set GSE32413 and GSE59787 are used to further verify the model， and the product value under the ROC curve is used to evaluate the accuracy of the model. Finally， RT‑qPCR was used for experimental verification. Result The results showed a total of 46 differentially expressed genes were identified， including 16 genes that were up‑regulated and 30 genes that were down‑regulated. Furthermore， the six most relevant characteristic genes （LYN， TNFAIP3， RNF128， MCOLN3， ANKFY1， PLD3） were screened by random forest， and the artificial neural network diagnosis model was constructed. Using this model， the ROC curves of training group and verification group were drawn， and the AUC value was 0.999. The AUC of the verification group was 0.740 and 0.732， respectively. The average AUC of 10% discount cross‑validation is greater than 0.980. RT‑qPCR results showed that compared with the control group， the expressions of LYN （P=0.004） and TNFAIP3 （P=0.000 1） were significantly up‑regulated in scleroderma， while the expressions of RNF128 （P=0.000 2）， MCOLN3 （P=0.001）， ANKFY1 （P=0.02） and PLD3 （P<0.000 1） were significantly down‑regulated in scleroderma. Consistent with machine learning results. Conclusion An artificial neural network diagnosis model of lysosome‑related characteristic genes in scleroderma was constructed， which provides a new perspective for exploring the pathogenesis of scleroderma.

Graphical abstract

关键词

系统性硬化症 / 溶酶体 / 人工神经网络 / 随机森林 / 诊断模型

Key words

Systemic sclerosis / Lysosome / Artificial neural network / Random forest / Diagnostic model

系统性硬化症（systemic sclerosis， SSc）也称硬皮病，是一种罕见的自身免疫性疾病，主要影响皮肤和内脏器官，其病理特征包括炎症、血管异常和纤维化^［1］。尽管近年来SSc的研究较前取得了一些进展，但其发病机制仍未阐明。因此，探究SSc的潜在分子机制对其诊断和治疗有重要意义^［2］。

溶酶体是将细胞内膜的各种生物大分子降解的细胞器。其接收和消化小分子和细胞表面蛋白的内吞产生的物质，吞噬大颗粒如凋亡的细胞和病原菌，或自噬细胞质内容物，包括受损的线粒体、内质网和溶酶体^{［3， 4］}。溶酶体功能障碍会使人患有多种疾病，如溶酶体储存疾病、神经退行性疾病及免疫系统疾病等^［5］ 有研究发现SSc患者的血清中溶酶体/β‑半乳糖苷酶含量显著增加^［6］。

尽管有研究表明溶酶体与自身免疫性疾病的发病机制存在联系，但少有研究SSc与溶酶体之间的关系，且对于SSc基因层面与溶酶体相关的系统分析研究更为缺乏。

1 材料及方法

1.1 数据来源和差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）获取

使用GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载SSc数据。得到GSE95065和GSE76807基因芯片。通过R（4.2.1版）软件“sva”包将两个数据集合并作为训练集。从AmiGO2数据库（https：//amigo.geneontology.org/amigo）中获取875个溶酶体相关基因数据。随后，从训练组芯片中获取875个溶酶体基因表达量。用 “limma”软件包分析筛选DEGs，显著性标准设置为|logFC|>0.5，adj.P<0.05。GSE32413与GSE59787数据集作为验证组。

1.2 Metascape分析

用Metascape （http：//metascape.org/gp/index.html） 网站对差异表达基因分析，设定条件：P<0.01且富集因子>1.5，显示排名前20的通路或功能。

1.3 GO及KEGG富集分析

使用 R 中“clusterProfiler”包（条件：P<0.05）分析，用“ggplot2”包将GO及KEGG结果可视化^［7］。

1.4 随机森林算法获取SSc关键基因

用R中“randomForest”包对DEGs筛选， 以确定最佳的错误率和稳定性树数为参数，计算1~500棵树每个错误率的变化情况^［8］。选择基因重要性评分>1的基因，绘制随机森林树图和基因重要性评分图^［9］。

1.5 人工神经网络的构建

选择前一步中重要性评分>1的基因进行神经网络模型训练。将数据归一化至最大值和最小值后，使用R包“neuralnet”包和“NeuralNetTools”构建ANN。设置5个隐含层作为模型参数，通过获得基因权重信息构建SSc疾病分类模型^［10］。进一步用 “Caret”包进行模型的10折交叉验证以去除过拟合。使用“pROC”包绘制ROC曲线并计算AUC值，以评估ANN在预测SSc溶酶体基因方面的效能。随后对训练集整体进行了ROC验证。

1.6 人工神经网络模型的验证

为进一步探究ANN模型的效能，使用外部数据集（GSE32413、GSE59787）进行验证。用R包“PROC”绘制ROC曲线，模型的有效性则通过分析AUC值及其对应的95%置信区间（CI）来确定。

1.7 RT‑qPCR验证关键基因

动物实验：6~8周龄SPF级雌性小鼠6只（河南斯克贝斯生物科技股份有限公司），许可证号：SCXK（豫）2020‑0005。南阳理工学院伦理委员批准号：南理工动伦审［2023］014。饲养于南阳理工学院动物实验中心，自由饮食、昼夜光照交替、湿度40%~60%、温度（22±2）℃。小鼠（6只）随机分配为SSc组（3只）和对照组（3只），去除背部中心区域的毛发后，对照组予皮下注射0.9%的生理盐水（0.1 mL/d），连续注射4周。SSc组小鼠则通过皮下注射博来霉素（200 μg/mL，0.1 mL/d）造模，使用pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline， PBS）稀释，同样持续4周。背部皮肤取样，10%福尔马林溶液固定、常规脱水、石蜡包埋，制备切片行HE染色和Masson胶原纤维面积比较。造模成功后，trizol法提取总RNA、逆转录为cDNA并扩增关键基因。通过2^‑ΔΔct方法检测关键基因的mRNA相对表达量。Trizol试剂盒、逆转录试剂盒及RT‑qPCR试剂盒购自美国赛默飞世尔公司。引物（武汉合测基因科技有限公司）序列见表1。

1.8 统计学分析

用Graphpad Prism 9.5进行统计学处理并绘图。计量资料两组间差异比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DEGs筛选结果

共筛选出SSc溶酶体相关DEGs共计46个，其中有16个基因上调，30个基因下调。绘制热图。

2.2 Metascape结果

Metascape分析结果显示：中性粒细胞脱颗粒、囊泡介导运输的调控、炎症反应、细胞激活、肾上腺素介导的细胞排斥、蛋白质分解代谢过程、先天免疫反应、对外部刺激反应的正向调节、溶酶体转运、蛋白质定位于液泡、血管生成的调控等为DEGs最显著富集的功能或通路（图2）。

2.3 GO及KEGG通路富集分析结果

GO结果显示，DEGs的生物学功能主要涉及到内吞作用的调节、内吞作用的正向调节、溶酶体膜、溶解液泡膜、液泡膜、初级溶酶体、笼状蛋白结合等有关。KEGG结果显示DEGs主要富集在幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号转导、内吞作用、补体和凝血级联、阿米巴病、蛋白多糖与癌症等（图3）。

2.4 随机森林筛选SSc特征基因的验证

随机森林中，通过分析树的数目与模型误差之间的关系，观察到当树的数目为19时，模型的误差率趋于稳定，因此，选择19棵树来构建最终模型（图4A），筛选出重要性评分>1的基因（图4B）。最终得到6个具有代表性的SSc关键基因（LYN、TNFAIP3、RNF128、MCOLN3、ANKFY1、PLD3）。6个基因能够识别SSc样本， LYN及TNFAIP3在正常样本中低表达而在SSc样本中高表达。另一方面，RNF128、MCOLN3、ANKFY1及PLD3则在正常样本中高表达但在SSc样本中低表达（图4C）。

2.5 ANN的构建结果

本研究设计ANN模型包含6个输入层、5个隐藏层和2个输出层，具体公式为neuraSSc=∑（Gene Expression×Neural Network Weight）， ANN中每条连接线上的数字表示节点之间的权重^［11］。进一步验证表明，模型组数据集整体AUC值为0.999，10折交叉验证结果平均AUC>0.980。证明该模型的性能优异。见图5~7A。

2.6 ANN模型验证结果

在验证组中得到了6个模型基因的表达差异，其AUC值分别为0.732及0.740（图7B、C）。说明该模型准确性较高，已经成功构建了一种基于SSc溶酶体特征基因的ANN诊断模型。

2.7 HE 染色及Masson胶原纤维面积百分比检测小鼠皮肤组织病理变化

HE染色后与对照组相比，模型组组织的毛囊和汗腺等减少、血管壁增厚及真皮层破坏。Masson分析法显示：与对照组小鼠相比，SSc组小鼠胶原纤维明显增多、脂肪层明显变薄、胶原纤维面积百分比相较于对照组明显升高（SSc组标准差44.66±6.78；对照组标准差26.77±5.76；与对照组比较，^*P<0.05）。确定 SSc 小鼠模型造模成功（图8）。

2.8 RT‑qPCR结果

结果显示与对照组相比，SSc中LYN（P=0.004）、TNFAIP3（P=0.000 1）表达量明显上调，而RNF128（P=0.000 2）、MCOLN3（P=0.001）、ANKFY1（P=0.02）、PLD3（P<0.000 1）表达量在SSc组中明显下调（图9），实验结果与机器学习算法相一致。

3 讨论

在21世纪，关于SSc发病机制的研究虽然取得了一定进展，但在SSc溶酶体相关基因方面的研究尚空缺。研究表明，溶酶体与机体自身免疫密切相关，但免疫介导的SSc与溶酶体功能异常之间的关系仍不清楚^［12］。因此，建立基于SSc诊断模型，深入研究SSc与溶酶体相关基因之间的关系对未来临床诊疗至关重要。本研究比较了正常和SSc样本之间溶酶体相关基因的表达差异。共得出6个溶酶体关键基因（LYN、TNFAIP3、RNF128、MCOLN3、ANKFY1、PLD3），构建了用于诊断的ANN模型。

LYN属于SRC家族蛋白激酶的一部分，有研究表明抑制SRC激酶有效地预防了体内小鼠真皮纤维化，减少了真皮厚度和胶原含量。在促纤维化细胞因子的刺激下，SSc成纤维细胞中的SRC激酶可以被激活，并调节ECM蛋白的合成。抑制SRC激酶可减少体外和体内实验性真皮纤维化中细胞外基质的产生^［13］。 TNFAIP3基因变异导致DREAM表达改变而导致的A20表达或功能受损可能直接导致多器官纤维化的发生或进展，并代表了抗纤维化治疗的新靶点^［14］。TNFAIP3基因的遗传变异赋予了多种自身免疫表型的易感性，也赋予了SSc的易感性^［15］。MCOLN3是TRP通道家族的成员，也是一种表达在质膜和多个细胞内的内向整流性钙离子通道，通过介导钙内流启动自噬，定位于多个细胞室，包括质膜、溶酶体和自噬小体^{［16‑18］}。研究表明LYN激酶可能通过多种机制影响TNFAIP3的表达或功能，如 LYN激酶可以调节TNFAIP3的表达水平，进而影响NF‑κB信号通路的抑制效果，从而调节炎症反应的程度^［19］。TRP通道在响应细胞外刺激时可以引起钙离子内流，而SRC家族激酶可以通过磷酸化作用调节TRP通道的活性，从而影响细胞的信号传导和响应^［20］。TRP通道和SRC家族激酶可能通过共同的细胞信号传导途径（如MAPK、PI3K/Akt等）调节炎症和纤维化相关的基因表达和细胞功能^［21］。

有研究发现RNF128的下调与黑色素瘤的恶性表型有关，低水平的RNF128通过诱导细胞上皮‑间充质转化（EMT）和获得干性而促进黑色素瘤的进展，RNF128的下调通过CD44和CTTN泛素化激活Wnt信号，并参与Wnt信号‑CD44环的正反馈^［22］。随着RNF128表达的减少，细胞迁移能力下降，通过敲除RNF128抑制EMT进展，可降低纤维连接蛋白的水平^［23］。研究发现， LYN可以通过与Frizzled受体相互作用，调节其在细胞膜上的表达和分布，从而影响Wnt信号通路的启动，另一方面，LYN激酶可以直接与β‑catenin相互作用，导致其磷酸化和降解增加，从而抑制Wnt/β‑catenin信号的传导^［24］。RNF128通过其E3泛素连接酶活性，直接与β‑catenin相互作用，标记其泛素化并导致其降解。这种作用可以阻断β‑catenin的核转位和靶基因的转录，从而抑制Wnt/β‑catenin信号的传导^［22］。Wnt/β‑catenin信号通路在SSc的发病中通过多种途径参与了纤维化、免疫调节和血管异常等关键过程^［25］。PLD3是与人类疾病相关的磷脂酶D家族蛋白^［26］。新生小鼠需要PLD3和PLD4来预防一种与噬血细胞淋巴组织细胞增多症一致的炎症性疾病，它们都限制了自身炎症^［27］。另一方面，基因组关联研究已将PLD4基因多态与SSc联系起来^［28］。研究发现，NF‑κB信号通路通过影响PLD3的表达和活性来调节细胞的磷脂酰胺代谢和信号传导，而TNFAIP3则主要通过其泛素化活性调节NF‑κB信号通路，抑制炎症因子的表达和炎症反应的过度激活，对自身免疫性疾病的发展和免疫耐受性具有重要影响^{［29， 30］}。PLD3与PI3K/AKT通路之间的联系主要体现在磷脂酰肌醇（PI）代谢和信号传导途径的交叉调控上，且ANKFY1与PI3K/AKT信号通路之间的联系主要通过ANKFY1的FYVE结构域介导的磷脂酰肌醇的特异性结合和调控来体现，其参与调节细胞膜的动态变化、内吞作用以及细胞器的运输和定位^{［31，32］}。研究表明，Zyxin通过整合PI3K/AKT和转化生长因子‑β信号通路参与皮肤纤维形成过程和成纤维细胞的激活^［33］。

本研究发现LYN、TNFAIP3、RNF128、MCOLN3、ANKFY1和PLD3基因之间存在直接或间接的联系，并且它们对介导SSc发病的重要信号通路（如Wnt/β‑catenin信号通路、PI3K/AKT信号通路等）产生影响。这些基因通过调节这些信号通路的活性和效应，参与了SSc的发病机制。在临床治疗上，可以考虑通过激活或抑制与这些基因相关的信号通路来干预SSc的病理过程。例如，通过增强TNFAIP3的功能来抑制Wnt/β‑catenin信号通路的过度活化，或者通过调节LYN对PI3K/AKT信号通路的影响，以期望抑制纤维化和免疫异常等病理特征的发展。这些发现为开发针对SSc的靶向治疗策略提供了理论支持，未来的研究将进一步揭示这些基因及其调控的信号通路在疾病发展中的具体作用，以期改善临床治疗效果。

综上所述，SSc发病可能是通过调节LYN、TNFAIP3、RNF128、MCOLN3、ANKFY1、PLD3等基因实现的。本研究利用随机森林法构建了ANN模型，为未来的临床研究和基础实验提供了理论依据和数据支持，并为探索SSc的发病机制提供了新的视角。

本研究也存在一定不足。首先，所采用的数据集虽然已满足研究所需的样本量，但样本量来源相对较单一。其次，筛选硬皮病DEGs和建立的ANN模型虽已通过初步实验验证，但仍需后续临床实验来验证。

作者贡献度说明：

左志威：提出思路，设计方案，收集分析数据，撰写论文；卞博：分析数据、修改文章；崔家康：修改文章；耿玉鑫：撰写论文，协助实验；王一晨：协助实验；郭克磊：修改文章、协助实验；孟庆良：修改文章，审定论文；卞华：总体把关、审定论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82074415)

中原英才计划‑中原科技创新领军人才项目(234200510006)

河南省科技计划项目(232102311201)

南阳市基础与前沿技术研究专项计划重点项目(23JCQY1006)