小檗碱减轻鱼藤酮诱导的帕金森病模型大鼠损伤的实验研究

Experimental study of berberine alleviating rotenone‑induced damage of Parkinson's disease model rats

摘要

目的 探讨小檗碱（berberine，BBR）对鱼藤酮（rotenone，Rot）诱导的帕金森病（Parkinson’s disease，PD）模型大鼠的作用及其机制。 方法 将36只大鼠随机分为对照组（control，Con）、Rot组、Rot+BBR组和Con+BBR组，对各组分别进行行为学评估，观察各组大鼠中脑纹状体脑组织的多巴胺含量以及氧化应激指标的变化，同时纹状体脑组织检测酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺转运体（DAT）、囊泡单胺转运蛋白2（VMAT2）蛋白表达情况；进一步对Rot+BBR组进行腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抑制剂dorsomorphin（Dor）干预，将12只大鼠随机分为Rot+BBR组和Rot+BBR+Dor组，通过检测Rot+BBR组大鼠经Dor干预后的APMK、p-AMPK、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ以及α-synuclein表达水平变化来验证BBR对AMPK信号通路介导的自噬的影响。 结果 与对照组相比，Rot组大鼠存在明显的神经功能障碍和氧化应激损伤、纹状体脑组织多巴胺含量显著减少以及TH、DAT、VMAT2表达水平显著下降；与Rot组相比，予以BBR干预可显著改善Rot+BBR组大鼠的神经功能，并且呈剂量依赖性；予以20 mg/kg的BBR干预后，Rot+BBR组大鼠氧化应激损伤减轻、脑组织多巴胺含量增加，同时TH、DAT、VMAT2蛋白表达水平显著升高；进一步采用Dor药物干预后BBR+Rot组大鼠的p-AMPK/AMPK和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例下降，α-synuclein蛋白表达显著升高，同时TH阳性荧光强度也明显降低。 结论 BBR可改善Rot诱导的PD模型大鼠的神经功能障碍和氧化应激损伤，其机制可能与BBR通过激活AMPK信号通路介导的自噬有关。

Abstract

Objectives To investigate the effects of berberine （BBR） on rotenone-induced Parkinson's disease （PD） model rats and its mechanisms. Methods 36 Healthy male SD rats were randomly assigned into the following four groups： A control group （Con）， a Rot group， a Rot+BBR group， and a Con+BBR group. Behavioral assessments were performed in each group， and the changes in dopamine content and oxidative stress indicators were observed. Meanwhile， tyrosine hydroxylase （TH）， dopamine transporter （DAT）， and vesicular monoamine transporter 2 （VMAT2） expression levels were detected in each group. Rot+BBR group was further treated with adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK） inhibitor dorsomorphin （Dor） intervention. 12 Rats were randomly assigned into a Rot+BBR group and a Rot+BBR+Dor group. The expression levels of APMK， p-AMPK， LC3-Ⅰ， LC3-Ⅱ， and α-synuclein were detected in the Rot+BBR group and Rot+BBR+Dor groups to determine the effects of BBR on AMPK signaling pathway-mediated autophagy. Results Compared to the control group， the rats in the Rot group manifested neurological dysfunction， oxidative stress injury， decreased dopamine content， and decreased expression levels of TH，DAT，and VMAT2. Compared to the Rot group， the motor function of the rats was significantly improved in the Rot+BBR group after BBR treatment. Moreover， the degree of ifluorescence intensity improvement was associated with the BBR dosage. After 20 mg/kg of BBR treatment， oxidative stress injury was alleviated， and the content of dopamine in striatum brain tissue of the rats in the Rot+BBR group was increased. Additionally， the proportions of p-AMPK/AMPK and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ significantly reduced in the Rot+BBR group after using AMPK inhibitor Dor. Futhermore， the increased expression of α-synuclein and decreased TH-positive fluorescence intensity were also found in the Rot+BBR+Dor group. Conclusions BBR can alleviate neurological dysfunctions and oxidative stress damage in Rot-induced PD model rats， and the mechanism may be associated with activating AMPK pathway-mediated autophagy.

Graphical abstract

关键词

帕金森病 / 鱼藤酮 / 小檗碱 / AMPK信号通路 / 自噬

Key words

Parkinson's disease / Rotenone / Berberine / AMPK signaling pathway / Autophagy

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种老年人常见的神经系统疾病，以黑质纹状体多巴胺（dopamine，DA）能神经元的变性和丢失为主要病理特征^［1］。PD是一种神经退行性疾病，病情随着病程增加而逐渐加重，疾病晚期可严重致残，目前尚无根治办法^［2］。小檗碱（berberine，BBR）是一种天然的中成药，具有抗炎、抗氧化、控制血糖、调脂等功能。多项研究表明BBR还在调节自噬方面具有重要的作用^［3］。前期研究发现BBR对PD、阿尔茨海默病等神经退行性疾病具有一定的治疗作用^［4］。然而，也有研究显示BBR对多巴胺神经元具有一定的神经毒性^［5］，目前对于BBR对PD受损的多巴胺神经元的作尚无确切的定论。研究显示在PD患者和PD动物模型的大脑中发现存在线粒体自噬途径，PD自噬功能失调与PD的发生具有密切的联系^［6］，调节自噬的小分子是治疗PD的重要方向^［7，8］。BBR可能通过作用于自噬途径从而对PD发挥神经保护作用。研究表明可通过调节自噬和抑制氧化应激对线粒体功能发挥保护作用，激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可减轻PD模型大鼠的多巴胺能神经元损伤作用^［9］。因此，靶向调节AMPK信号通路是PD神经保护治疗的靶点之一^［10］，但目前尚不明确BBR是否可通过激活AMPK信号通路调节自噬改善PD的症状。

本研究通过采用鱼藤酮（Rot）诱导的PD大鼠模型，探讨BBR对Rot诱导的帕PD模型大鼠的神经功能以及氧化应激损伤的影响，进一步明确BBR是否可通过激活AMPK信号通路介导的自噬对Rot诱导的PD模型大鼠发挥神经保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验采用月龄为3~5月龄健康雄性Sprague-Dawley大鼠［动物许可证号：SCXK（沪）2023-0009］作为研究对象，体重约为250~300 g；保持室内22 ℃左右的温度和40%左右的湿度，进行12 h的明/暗周期循环，保证充足的水和食物供应。本实验所有程序均已获得苏州大学附属第一医院动物伦理委员会的批准（No. 2020147）。

1.2 主要试剂

Rot和葵花油、BBR和多巴胺标准品均购于Sigma公司（美国）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，中国）、anti-酪氨酸羟化酶（TH）（T55731，abmart公司）、多巴胺转运体（DAT）（ab184451，abcam公司）、囊泡单胺转运蛋白2（VMAT2）（ab259970，abcam公司）anti-α-synuclein（D37A6，CST公司）、anti-LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ（PQA2576，abmart公司）、anti-AMPK和anti-P-AMPK（T55608和T55326， abmart公司）及IgG-HRP antibody （CST公司，美国）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒购于Bio-Swamp公司；Dorsomorphin（Compound C，BML-275）购自美国MCE公司。

1.3 实验设计和分组

实验1：将36只大鼠随机分为对照组（Con组）、Rot组、Rot+BBR组、Con+BBR组，每组给药方式如下：（1）Con组：正常大鼠常规饲养3周；（2）Rot组：采用背部皮下注射Rot的方法建立PD大鼠模型^［11］，Rot剂量为2.5 mg/kg/d，将Rot和葵花油进行混合溶解后进行皮下注射，共注射3周；（3）Rot+BBR组：采用上述方法皮下注射Rot，同时每天予以BBR溶解于蒸馏水中配置浓度为5、10、20 mg/kg的悬浊液灌胃饲养，共饲养3周；（4）Con+BBR组：采用上述方法皮下注射葵花油，同时每天予以BBR溶解于蒸馏水中配置浓度为20 mg/kg灌胃饲养，共饲养3周。

实验2：将12只大鼠随机分为Rot+BBR组和Rot+BBR+Dorsomorphin（Dor）组，每组给药方式如下：（1）Rot+BBR组：同实验1；（2）Rot+BBR+Dor组：PD模型建立后立即予以腹腔注射Dor药物（Dor药物溶解于生理盐水中配置浓度为25 mg/kg）进行干预，其余均同Rot+BBR组。

1.4 大鼠行为学评估方法

本实验主要采用旷场实验和转棒实验对大鼠行为学进行评估，其中旷场实验以大鼠每5 min进入旷场周边和中央区域的次数作为主要分析指标；而转棒实验主要分析大鼠处于慢速（5 r/min）和快速（29 r/min）时，分别计算大鼠能够停留在转棒上的时间，最后结果为3次的平均值。

1.5 检测脑组织多巴胺含量

本实验采用高效液相色谱法检测各组大鼠纹状体区域脑组织的多巴胺含量。首先，在EP管中依次加入脑组织样品和生理盐水，充分混匀和离心后取上清液，再次重复离心，结束后取上清液进0.22 μm滤膜过滤样品即得到待测样品；随后采用色谱纯甲醇（速度为1 mL/min）冲洗泵和进样阀，结束后将甲醇换为流动相（速度为1 mL/min），压力稳定后走基线，设置进样量等参数，单胺类神经递质分别设置1 mL/min的流速，10 μL进样量，激发波长290 nm，发射波长330 nm的参数，同时设置横坐标为对照品的进样量（ng），纵坐标为吸收峰面积，根据上述坐标绘制的曲线计算多巴胺神经递质的含量（ng/mg）。

1.6 检测ROS、MDA含量和GSH-Px、SOD活性的变化

根据试剂盒说明书来进行测定ROS、MDA的含量和GSH-Px、SOD的活性。实验测试主要步骤为：首先将大鼠纹状体脑组织在冰上研磨成匀浆，在4 ℃的离心机里以12 000 g的转速进行离心，结束后收集上清液，然后进行ROS含量的测定，根据试剂盒说明书的操作步骤，采用氧化剂敏感的探针2，7-二氯荧光素二乙酸酯的方法进行检测，再使用荧光酶标仪（FilterMax F5，美国）（波长为485 nm）测量每个样品的荧光强度，最后计算ROS含量以荧光强度/蛋白（mg）表示。运用上述类似方法进行测定其他氧化应激指标，加入相对应的工作液混合，由普通酶标仪测定混合液的吸光度值，三者激发波长分别为532、412、450 nm，根据公式计算脑组织中MDA的含量、GSH-Px和SOD的活力值。

1.7 Western blot实验步骤

在大鼠纹状体脑组织中以100∶1的比例滴加一定量组织细胞裂解液和PMSF的混合物，在冰上研磨成匀浆，静置30 min后进行离心，离心结束后取上清液转移至EP管中，作为待测的蛋白样品。蛋白样品通过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭实验步骤后，按照说明书的稀释比例，分别在Western blot一抗稀释液中滴加抗TH（1∶1 000）、DAT（1∶1 000）、VMAT2（1∶1 000）、α-synuclein（1∶1 000）、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ（1∶500）、p-AMPK（1∶500）、AMPK（1∶500）抗体，然后在4 ℃冰箱内孵育过夜（约12 h）；利用抗体β-tubulin（1∶2 000）和GAPDH（1∶2 000）作为目的蛋白的内参，第二天孵育后将NC膜置于Western blot PBST溶液中进行洗膜，然后在常温下按照比例（1∶2 000）用Western blot二抗稀释液进行稀释，在室温孵育1 h后在化学发光成像系统暗箱中显色曝光，利用Image J软件计算蛋白条带的灰度值。

1.8 免疫荧光实验步骤

首先将含有中脑黑质脑组织的石蜡切片置入70 ℃的烘箱内进行烘片2 h，然后将石蜡切片进行脱蜡处理，再放置到微波炉加热煮沸的柠檬酸钠原液中浸泡5 min后取出置于常温的柠檬酸钠溶液中，浸洗后采用5%BSA封闭溶液进行室温封闭1 h，结束后在切片上加入免疫荧光一抗anti-TH抗体，在4 ℃冰箱中孵育12 h，然后浸洗3次后在切片上加入免疫荧光二抗anti-TH抗体，将其置入37 ℃烘箱中进行孵育1 h；最后，加DAPI溶液进行封片，结束后采用荧光显微镜进行观察，并分析图片和数据结果。

1.9 统计学处理

采用SPSS 24.0进行统计分析，数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，若数据符合正态分布方差齐性，两组间比较采用两样本的t检验，多组间比较采用单因素方差分析方法进行统计，进一步各组间两两比较采用LSD检验方法进行分析；若数据不符合正态分布或方差不齐，两组和多组间数比较则采用非参数检验，取P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量的BBR干预对Rot模型大鼠神经行为学的影响

旷场实验（图1A、1B）结果显示，Rot组大鼠在5 min内穿越旷场周边和中央的次数较对照组明显减少（P<0.001，t=15.66；P<0.001，t=23.88）；在模型大鼠中同时予以不同剂量的BBR（5、10、20 mg/kg）处理后，发现Rot+BBR组大鼠穿越旷场周边和中央的次数显著增加（P<0.01，F=37.60；P<0.01，F=39.62），并且表现为剂量依赖性，其中以20 mg/kg剂量最佳（P<0.001，F=14.81；P<0.001，F=27.84）；与对照组相比，单独给予20 mg/kg BBR处理后的Con+BBR组大鼠在穿越旷场周边和中央运动的次数无显著变化（P>0.05）。

转棒实验（图1C、1D）结果显示，与对照组相比，Rot处理后的模型大鼠的转棒保留时间显著缩短（P<0.001，t=15.98），表明大鼠的运动功能和协调功能受损；然而，在模型大鼠中分别予以BBR（5、10、20 mg/kg）处理后，Cot+BBR组大鼠的转棒保留时间明显延长（P<0.01，F=20.74），并且也具有浓度依赖性特征；对照组大鼠与单独应用BBR（20 mg/kg）的Con+BBR组大鼠在运动和协调平衡功能方面无显著差异（P>0.05）。

2.2 BBR干预对Rot模型大鼠纹状体脑组织多巴胺含量的影响

图2所示，与对照组相比，Rot组大鼠的纹状体区域脑组织总多巴胺含量显著降低（P<0.001，t=15.06）；与Rot组大鼠比较，在模型大鼠中分别予以5、10、20 mg/kg的BBR处理后，Rot+BBR组大鼠的纹状体脑组织多巴胺含量显著升高（P<0.001，F=29.01）；与其他剂量BBR处理的模型组相比，BBR（20 mg/kg）处理后模型组大鼠纹状体脑组织多巴胺含量升高最显著，差异具有统计学意义（P<0.01，F=14.02）；另外，在对照组中予以BBR（20 mg/kg）处理后，Con组与Con+BBR组大鼠的纹状体脑组织中多巴胺含量无明显差异（P>0.05）。因此，后续实验中均采用剂量为20 mg/kg的BBR进行干预。

2.3 BBR干预对Rot模型大鼠纹状体组织TH， DAT和VMAT2蛋白表达的影响

Western blot实验结果（图3）显示，与对照组相比，Rot组大鼠的纹状体脑组织TH和DAT、VMAT2蛋白水平均明显下降（P<0.001，t=13.91；P<0.001，t=12.60；P<0.001，t=18.43），这提示Rot干预可诱导大鼠的多巴胺能神经元损伤和退化。在Rot诱导的大鼠中，同时予以BBR（20 mg/kg）处理后，与较Rot组相比，Rot+BBR组大鼠的纹状体脑组织中TH、DAT以及VMAT蛋白水平显著升高，差异具有统计统学意义（P<0.001，t=6.572；P<0.001，t=7.064；P<0.001，t=11.064）。与正常组相比，正常组大鼠予以BBR（20 mg/kg）处理后纹状体脑组织中TH、DAT以及VMAT蛋白水平无明显变化（P>0.05）。

2.4 BBR干预对Rot模型大鼠脑组织氧化应激的影响

与对照组相比，Rot干预后PD模型大鼠脑组织中ROS、MDA的含量明显增高（P<0.001，t=7.799；P<0.001，t=14.37）（图4A、4B），而SOD和GSH-Px的活性降低（P<0.001，t=8.80；P<0.001，t=10.47）（图4C、4D）；在Rot诱导的大鼠中，同时予以BBR（20 mg/kg）处理后，Rot+BBR组大鼠脑组织中ROS、MDA的含量显著下降（P<0.01，t=4.087；P<0.001，t=5.347）（图4A、4B），而SOD和GSH-Px的活性明显提高（P<0.01，t=3.745；P<0.01，t=4.93）（图4C、4D），差异均具有统计学差异。

2.5 采用AMPK抑制剂Dor干预观察BBR对Rot模型大鼠AMPK信号通路和自噬相关蛋白的影响

与Rot+BBR组比较，AMPK抑制剂Dor处理后的Rot+BBR+Dor组大鼠纹状体脑组织中p-AMPK/AMPK表达相对比例显著下降（P<0.01，t=5.852）（图5A、5B），同时观察到Dor处理后的Rot+BBR组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例也显著降低（P<0.01，t=5.702）（图5C、5D），并且α-synuclein蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义（P<0.05，t=3.545）（图5C、5E）；进一步IF结果显示与Rot+BBR组相比，Rot+BBR+Dor组大鼠黑质部位TH阳性荧光强度明显降低（P<0.01，t=4.551）（图5F），提示AMPK抑制剂Dor可阻断BBR激活AMPK信号通路介导的自噬途径。

3 讨论

BBR是一种从小檗碱中分离得到的异喹啉类生物碱，其具有抑制炎症反应、抗肿瘤、控制血糖、调脂的功能^［12］。近年来研究发现BBR对PD等神经退行性疾病也具有一定的神经保护作用^［3］。PD的主要表现为选择性黑质纹状体区域的多巴胺含量减少和DAT、VMAT2蛋白水平降低^［11］。黑质纹状体多巴胺合成和储存减少是导致PD患者出现运动障碍的重要原因^［13］。根据前期研究报道^［14］，予以1-甲基-4-苯基-1，2，3，6，四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）、6-羟基多巴（6-hydroxydopamine，6-OHDA）和Rot干预后，均可诱导TH和多巴胺含量减少，也是目前构建PD模型的常用药物。然而MPTP和6-OHDA模型造成多巴胺神经元的毒性大，不能模仿PD慢性进行性病程^［14］。研究显示Rot诱导的PD模型不仅可导致多巴胺神经递质减少，同时存在α-synuclein异常聚集、线粒体功能障及神经细胞凋亡和自噬途径等病理改变，Rot诱导的PD 动物模型更能模拟PD患者的病理学特征^［15］。因此，本研究通过采用Rot构建PD大鼠模型探讨BBR对受损的多巴胺神经元的作用及其相关机制。研究结果显示Rot干预后，大鼠不仅表现为运动和协调功能障碍，并且纹状体区域脑组织的TH、DAT和VMAT2蛋白表达显著下降，然而采用20 mg/kg的BBR干预3周后，发现PD模型大鼠的运动功能显著改善，脑组织多巴胺含量以及TH、DAT和VMAT2蛋白表达增加，氧化应激损伤减轻，并且通过采用AMPK抑制剂干预实验进一步验证了BBR可通过激活AMPK信号通路介导的自噬对Rot诱导的PD模型大鼠发挥神经保护作用。

自噬是一种溶酶体降解途径，是细胞器再循环的重要机制，对维持细胞的自身稳态与代谢平衡具有重要的作用 ^［16］，其中自噬途径障碍参与了PD的发生机制^［6］。研究显示自噬具有清除Rot诱导的细胞毒性蛋白质聚集的作用，然而在Rot诱导的PD模型中，神经细胞自噬途径障碍会导致α-synuclein蛋白异常表达，这也是Rot导致PD模型毒性的重要病理机制 ^［17］。因此，维持细胞内自噬平衡对神经细胞功能和生长发育具有重要的作用。LC3是自噬体常用的分子标记物，LC3蛋白以两种形式存在，其中一种是LC3-Ⅰ主要与细胞质定位有关，另一种就是与自噬体膜相关的LC3-Ⅱ，并且LC3-Ⅱ是直接反应自噬水平的指标 ^［18］。本研究探讨BBR是否可通过调控自噬来减轻Rot的神经毒性。本研究发现，与Rot组相比，BBR处理的Rot模型大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例明显升高，这些研究结果提示予以BBR治疗后不仅可减轻Rot诱导的神经功能障碍、多巴胺能神经元损失，同时BBR可以通过调控自噬相关途径来减轻Rot诱导的神经毒性。

AMPK在调节细胞内能量稳态方面发挥着重要的作用，其中包括抗氧化、抑制炎症反应、调节自噬等 ^［19］。研究提示激活AMPK可减少细胞对各种应激源的损伤，包括饥饿、缺氧、缺血和兴奋性毒性等，发挥神经保护作用 ^［20］。既往研究显示在MPTP处理的PD小鼠模型中BBR可增强自噬和促进AMPK磷酸化 ^［21］。本研究进一步在Rot诱导的PD模型中探讨BBR是否可通过激活AMPK信号通路介导的自噬，进一步促进α-synuclein清除和发挥神经保护作用。研究结果显示予以BBR干预后，Rot模型大鼠的磷酸化的AMPK蛋白表达水平明显增强，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例明显升高，α-synuclein表达显著下降，提示BBR可通过激活AMPK信号通路介导的自噬途径对PD发挥神经保护作用。

综上所述，BBR可通过激活AMPK信号通路介导的自噬减轻Rot诱导致的PD模型大鼠的神经功能障碍和氧化应激损伤，从而对PD发挥神经保护作用。因此，BBR是一种治疗PD的潜在药物，具有一定的临床应用前景。

作者贡献度说明：

龚艳：完成实验和指标检测、撰写论文、数据分析；巴艳秋、钱文君：协助完成实验、实验数据的收集整理；吴淼：协助实验设计、评价文献检索；龙现明、钱苏荣：实验设计、动物实验、论文修改、最后校审。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82102664)

苏州高新区医疗卫生科技计划项目（青年项目）(2017Q007)