基于网络药理学、分子对接及实验验证探讨清心宁神汤治疗心不藏神不寐的作用机制

Mechanism of Qingxin Ningshen Decoction in the treatment of heart not holding spirit sleepless based on network pharmacology, molecular docking, and experimental verification

摘要

目的 基于网络药理学、分子对接技术探讨清心宁神汤治疗心不藏神不寐的作用机制，并进行实验验证。 方法 采用中药系统药理学数据库分析平台对清心宁神汤的药物活性成分及其靶点进行检索，接着在disgenet、OMIM和GeneCards数据库中查询并筛选出与失眠相关的靶点。随后，构建蛋白相互作用网络数据库，并将药物与疾病相关的交集基因上传至DAVID数据库以进行KEGG和GO通路的富集分析，从而预测清心宁神汤治疗失眠的潜在作用靶点和信号通路。此外，对清心宁神汤的主要活性成分与核心靶点蛋白进行分子对接分析，并通过动物实验来验证这些活性成分与蛋白靶点对治疗心不藏神失眠大鼠模型的相关指标的影响。 结果 在药物作用靶点与失眠相关靶点基因的交集分析中，共识别出181个同时与失眠和药物相关的靶点基因。其中AKT1、TNF、TP53、IL-6、IL-1β为核心靶点，GO分析共筛选条目1 052条，清心宁神汤治疗失眠富集的生物功能主要条目789条，细胞成分相关的有103条，分子功能相关的有160条；KEGG通路富集分析揭示了PI3K/AKT等170条信号通路的显著富集；而分子对接分析表明，AKT、NRF2、SOD等关键靶点与治疗失眠药物的亲和力较强。动物实验结果显示，清心宁神汤可改善GSH-Px、SOD及NRF2的表达，改善体内的氧化应激反应。 结论 清心宁神汤能够通过作用于多个靶点和多条信号通路，对人体的氧化应激反应产生影响，从而改善GSH-Px、SOD及NRF2的表达水平，并调节PI3K/AKT信号通路中关键蛋白的表达，实现治疗心不藏神不寐的效果。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Qingxin Ningshen Decoction in the treatment of insomnia， and to carry out experimental verification， based on network pharmacology and molecular docking technology. Methods The active ingredients and their targets of Qingxin Ningshen Decoction were searched using the TCM system pharmacology database analysis platform， and then the targets related to insomnia were screened in disgenet， OMIM， and GeneCards databases. Subsequently， the protein interaction network （PPI） database was constructed， and the intersection genes related to drugs and diseases were uploaded to the DAVID database for enrichment analysis of KEGG and GO pathways， so as to predict the potential targets and signaling pathways of Qingxin Ningshen Decoction in the treatment of insomnia. In addition， the molecular docking analysis of the main active components of Qingxin Ningshen Decoction and the core target protein was carried out， and the influence of these active components and protein targets on the related indexes of the treatment of insomnia rat model with cardiac failure was verified by animal experiments. Results In the intersection analysis of drug action targets and insomnia related target genes， 181 target genes were identified. Among them， AKT1， TNF， TP53， IL‑6， and IL‑1β were the core targets. A total of 1 052 items were screened by GO analysis. There were 789 main items of biological function （BP）， 103 related to cell components （CC）， and 160 related to molecular function （MF） in Qingxin Ningshen Decoction for insomnia. KEGG pathway enrichment analysis revealed significant enrichment of 170 signaling pathways such as PI3K/AKT. Molecular docking analysis showed that AKT， NRF2， SOD and other key targets had a strong affinity with insomnia drugs. The results of animal experiments showed that Qingxin Ningshen decoction could improve the expression of GSH-Px， SOD and NRF2， and improve the oxidative stress reaction in vivo. Conclusion Qingxin Ningshen Decoction can affect the oxidative stress response of human body by acting on multiple targets and multiple signaling pathways， thereby improving the expression levels of GSH-Px， SOD and NRF2， and regulating the expression of key proteins in PI3K/AKT signaling pathway， so as to achieve the effect of treating insomnia.

Graphical abstract

关键词

清心宁神汤 / 心不藏神不寐 / 网络药理学 / 分子对接 / 机制研究

Key words

Qingxin Ningshen Decoction / Insomnia / Network pharmacology / Molecular docking / Mechanism research

失眠是指频繁而持续的入睡困难和（或）睡眠维持困难并导致睡眠感不满意为特征的睡眠障碍^［1］，随着社会的发展，其发病率也在增加。现代流行病学研究显示，我国成年人失眠的发病率已经达到38.2%^［2］。长期失眠不仅影响患者的日常生活和工作效率，还可能导致身体器质性损伤，因此，治疗失眠变得尤为重要。张星平教授根据中医经典理论和临床实践经验，提出了“中医不寐五神分型诊断法”，其中心不藏神不寐的主要症状是入寐维艰甚则彻夜不寐^［3］。张星平教授是全国名老中医药专家传承工作室专家和第六、七批全国名老中医药学术经验继承指导老师。清心宁神汤是张星平教授治疗心不藏神不寐的经验方和有效方。网络药理学是一个融合药理学、生物信息学和系统网络分析等多学科的学科，能够从分子和信号通路层面阐释药物与疾病之间的联系。本研究采用网络药理学和分子对接方法，探索药物活性成分、目标蛋白和疾病之间的关系，寻找药物治疗疾病的物质基础，并通过实验验证，旨在为心不藏神不寐的基础研究和临床防治提供新的理论支持。

1 数据来源及研究方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 中药的化学成分收集及靶点预测

通过中药系统药理学据库分析平台^［4］（https：//tcmsp-e.com/），以口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为筛选标准，对清心宁神汤中的中药成分进行活性成分的检索和筛选。随后，将筛选出的靶点数据通过Uniprot^［5］（https：//www.uniprot.org/）数据进行校准，排除非人源基因，并移除无效或重复的靶点，最终获得标准化的基因名称。

1.1.2 失眠相关靶点的获取

通过在GeneCards^［6］（https：//www.genecards.org/）、OMIM^［7］（https：//omim.org/）数据库和disgenet数据库^［8］（https：//www.disgenet.org/login/）中输入关键词“insomnia”进行检索，收集与失眠相关的靶点信息。将这些靶点信息汇总至Excel表格中，去除重复的基因条目，并通过Uniprot数据库进行验证和校正，最终得到准确的失眠疾病靶点基因信息。

1.1.3 药物-疾病靶点预测结果

首先，将药物成分的靶点与疾病的靶点进行对比映射，并通过绘制Venn图来识别两者的交集基因。接着，利用Cytoscape 3.8.2软件来构建一个展示“药物-成分-作用靶点”关系的网络图。

1.1.4 靶蛋白相互作用网络构建

为了深入探究清心宁神汤治疗失眠时蛋白质间的相互作用，将药物与疾病相关的交集基因输入到String数据库^［9］（https：//string-db.org/）进行蛋白相互作用网络（PPI）的构建。在构建过程中，选择了“Homo sapiens”作为物种，并设定了最低相互作用评分为0.4，以确保研究结果的可靠性。其他参数则采用默认设置，并将结果以TSV格式保存。随后，将TSV文件导入Cytoscape 3.8.2软件中进行网络分析，通过Cytoscape的“Tools→Network analyzer→Network analysis→Analyze network”功能来执行。分析完成后，将结果保存，并利用节点的大小和颜色来表示Degree值的大小，节点越大表示Degree值越高，从而绘制出蛋白质相互作用网络图。

1.1.5 GO富集分析和KEGG通路分析

为了探究清心宁神汤治疗失眠的分子作用机制，研究者将药物与疾病相关的交集基因提交至DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp），基因标识符选择OFFICIAL_GENE_SYMBOL，物种设置为：Homo sapiens。利用DAVID 6.8进行GO基因功能分析，从生物过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）三个维度对清心宁神汤治疗失眠的靶蛋白在基因功能上的作用进行注释。此外，为了揭示这些靶点在信号通路中的作用，还进行了KEGG通路富集分析。在GO功能分析中，选取了BP、CC、MF排名前10的条目，而在KEGG通路分析中，选择了排名前30的通路（基于P值排序）。这些数据被用来预测清心宁神汤治疗失眠的主要基因功能富集过程和信号通路，从而为理解其治疗作用机制提供科学依据。

1.2 核心成分与关键靶点的分子对接验证

为了验证活性成分与药物-疾病交集靶点之间的结合亲和力，研究者从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载了筛选出的核心化合物的SDF格式结构文件，这些文件代表了药物的小分子结构。同时，通过蛋白质结构数据库PDB（http：//www.rcsb.org/）获取了药物-疾病交集靶点的三维结构，这些结构代表了蛋白质的大分子结构。随后，使用PyMOL软件对蛋白受体的结构进行了处理，包括去除水分子和无效的小分子配体等，以便进行后续的分子对接分析。将靶点蛋白及药物活性成分导入AutoDock Tools 1.5.7，利用AutoDock Vina进行分子的半柔性对接，获得活性分子与受体蛋白的结合能和结合位置。

1.3 实验验证

1.3.1 药物

清心宁神汤饮片：黄连10 g、黄芩10 g、夏枯草15 g、醋柴胡10 g、白芍15 g、赤芍15 g、郁金10 g、茯苓10 g、法半夏15 g、炒白术10 g、陈皮10 g、炙甘草10 g。新疆维吾尔自治区中医医院提供，所有药材经医院药学部鉴定为正品。煎煮浓缩至含药量2.8 g/mL。酒石酸唑吡坦片（赛诺菲杭州制药有限公司，批号JT1662），LY294002（奥默生物技术上海有限公司，批号：M1925-08）、咖啡因（成都德斯特生物技术有限公司，批号：DSTDK004902）。

1.3.2 动物

于新疆医科大学动物实验中心共购买了36只SPF级雄性大鼠，体重180~220 g，周龄10~12周，实验动物生产许可证编号为SCXK（新）2023-0001。这些大鼠被饲养在新疆医科大学的SPF级实验室中，实验室的环境条件为室温（26±2）℃，相对湿度维持在45%~55%，并且实行12 h光照和12 h黑暗的交替周期，大鼠可以自由地进食和饮水。在实验操作过程中，严格遵守了实验动物的伦理标准，动物伦理委员会的批准文件编号为IACUC-20210301-45。

1.3.3 仪器与试剂

水迷宫设备和软件（成都泰盟科技有限公司，型号：WMT-100）、全波长酶标仪［赛默飞世尔（中国）科技公司，型号：Multiskan GO］、PowerPac Basic电泳仪（美国 Bio-Rad 公司，型号：041BR319633）、全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司，型号：JXFSTPRP-24）、台式高速冷冻离心机（德国Sigma实验室离心机股份有限公司，型号：3-18KS）、真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：DZF-6090）、生物显微镜（瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：DM2500）、轮转式石蜡切片机（德国徕卡公司，型号：RM2235）。核因子E2相关因子（NRF2）抗体、超氧化物歧化酶（SOD）抗体（沈阳万类生物科技有限公司，货号：T04082135、T01121846）、GAPDH抗体、二抗山羊抗兔IgG（H+L）HRP偶联抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，货号：AF7021、S0001）、Coralite 488山羊抗兔IgG（H+L）偶联抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：SA00013-2）、大鼠谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）试剂盒、大鼠超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（上海优选生物科技有限公司，货号：YX-E28756、YX-E20806）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、DAB 显色试剂盒、抗荧光衰减封片剂（含DAPI）、中性树胶、4×蛋白上样缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，货号：PC0020、P1200-2、2241D0401、S2110、G8590、P1016）、PBS缓冲液、封闭用山羊血清工作液、兔二步法试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9062、ZLI-9056、PV-6001）、三色预染蛋白Marker（和元李记上海生物技术有限公司，货号：AP13L062）、甲醇（福晨天津化学试剂有限公司，批号：20240326）。

1.3.4 模型复制、分组及给药

采用随机数字表法将36只大鼠随机分配为6个组，正常组、模型组、唑吡坦组、清心宁神汤低剂量组、清心宁神汤高剂量组、通路抑制剂组，每组6只，进行3 d的适应性饲养。参照课题组先前的研究，制备心不藏神不寐大鼠模型^{［10，11］}，其中正常组每天接受等量的生理盐水腹腔注射，1次/d，连续10 d；其他组在第1~7天每天接受60 mg/kg的咖啡因水溶液腹腔注射，1次/日，第8~10天则接受300 mg/kg的对氯苯丙氨酸（PCPA）皮下注射。模型制备完成后，唑吡坦组予以1.05 mg·kg^-1d^-1酒石酸唑吡坦溶液灌胃，清心宁神汤低剂量组按14.7 g·kg^-1d^-1清心宁神汤灌胃，高剂量组则每天接受29.4 g·kg^-1d^-1的清心宁神汤灌胃，大鼠的给药量是根据人类剂量的6.3倍换算得出^［12］，抑制剂组每天接受0.3 mg·kg^-1d^-1的LY294002腹腔注射，而正常组和模型组则每天接受等体积的0.9%生理盐水灌胃，所有组别均连续给药14 d。通过多导睡眠图（PSG）观察到大鼠的睡眠特征与心不藏神型不寐患者的PSG相似：总睡眠时间（TST）减少，睡眠潜伏期显著延长，慢波睡眠（SWS）时间明显减少，快动眼睡眠（REMS）时间减少，这表明心不藏神不寐大鼠模型成功构建，与心不藏神的主要症状“入寐维艰，甚则彻夜不寐”相吻合^［13］。

1.3.5 Morris水迷宫实验

在模型构建完成后，从第25天起，通过Morris水迷宫实验来评估大鼠的运动和空间记忆能力。实验使用的水池直径大约为180 cm，中央的小平台直径约6 cm，高度约为20 cm。摄像头安装在水池正上方的中心位置，并与计算机连接，以自动追踪并记录大鼠的游泳轨迹。水池被划分为四个象限，在第二象限的中心位置放置了一个小型平台，并在每个象限的中心区域设定了大鼠的入水点。水池中注入水，水面高度略高于小平台约0.5 cm，并加入可食用的白色色素使水呈现乳白色，以便更好地追踪大鼠。大鼠的头部被涂上黄色颜料，以便于摄像头捕捉和记录，每次记录的时长为90 s。

1.3.6 利用酶联免疫吸附法检测血清GSH‑Px及SOD含量

首先，确保大鼠血清完全解冻，然后，遵循酶联免疫试剂盒的说明书步骤，对血清样本中的SOD和GSH-Px含量进行测定。

1.3.7 利用蛋白免疫印迹法检测脑组织NRF2及SOD蛋白表达水平

每只大鼠称取脑组织60 mg、600 μL RIPA裂解液、3颗研磨珠一同置于研磨管中，充分研磨，15 000转、4 ℃离心15 min，冰上静止30 min后取上清液，BCA蛋白定量，4×loading buffer按比例加入，100 ℃使蛋白变性行凝胶电泳，80 V恒压电泳30 min，120 V恒压电泳65 min，100%甲醇激活PVDF膜，100 V恒压电转60 min，PVDF膜置于5%的脱脂奶粉中封闭60 min，一抗及内参（SOD、NRF2：1∶1 000，GAPDH：1∶5 000），4 ℃摇床孵育过夜。室温孵育二抗60 min（1∶5 000）。使用ECL超敏发光液进行显色和曝光，最后利用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.3.8 免疫组织化学染色法

石蜡切片64 ℃，烤片2 h，二甲苯、梯度乙醇脱蜡，微波炉高火7 min 30 s抗原修复，内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min，滴加一抗（SOD、NRF2：1∶200），4 ℃湿盒孵育过夜，滴加酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育30 min，DAB显色液现配现用，镜下观察，自来水终止反应，苏木素复染10 s，盐酸乙醇分化2 s，自来水返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性表达颜色为棕（褐）色。采集图像，Image J软件分析结果。

1.3.9 荧光抗体技术法

石蜡切片64 ℃，烤片2 h，二甲苯、梯度乙醇脱蜡，微波炉高火7 min 30 s抗原修复，0.1%Triton×100室温孵育10 min/2次，10%山羊血清工作液室温孵育30 min，滴加一抗（SOD、NRF2：1∶200），4 ℃湿盒孵育过夜，滴加二抗（Coralite488山羊抗兔IgG（H+L）偶联抗体，1∶200），在室温下孵育4 h，在玻片上滴加抗荧光衰减封片剂（含DAPI），盖玻片封片。采集图像，Image J软件分析结果。

1.3.10 统计分析

使用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，数据以（\overline{x}\pm s）的形式呈现，如果数据满足正态分布和方差齐性的条件，采用单因素方差分析来比较多组之间的差异；对于组间两两比较，当方差齐时，采用最小显著性差异法，当方差不齐时则采用 Dunnett's T3 检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学结果分析

2.1.1 清心宁神汤中药物有效成分及靶点预测

通过TCMSP检索，以OB≥30%，DL≥0.18并剔除无效成分后，筛选收集到清心宁神汤436个靶点。

2.1.2 失眠相关靶点

通过整合GeneCards、OMIM和disgenet数据库中的信息，并进行去重处理，共识别出6 833个与失眠相关的靶点，随后通过Uniprot数据库对这些基因进行校正。在药物作用靶点与失眠靶点基因取交集后，筛选出181个共同的靶点基因，这些基因构成了药物治疗失眠的潜在交互靶点，见图1。

2.1.3 药物‑成分‑靶点预测结果

利用药物-成分-靶点数据，构建“network.xlsx”文件以及“type.xlsx”文件，将文件导入Cytoscape3.8.2进行作图。图中包括366个节点和1 866条边，见图2。

2.1.4 核心靶点及网络相互作用

将所有药物的作用靶点与失眠的靶点基因取交集后，获得181个失眠与清心宁神汤的交集靶点基因，为清心宁神汤治疗失眠的交互靶点基因。在String（https：//string-db.org/）数据库中对181个交集靶点基因进行蛋白互作，选择“Homo Sapiens”物种，置信度0.4。将保存的TSV格式文件导入Cytoscape 3.8.2软件绘图。图中包181个节点和1 111条边，对网络进行拓扑分析，以degree值反映靶点大小及颜色，如图3所示。其中肿瘤蛋白P53（TP53）、白细胞介素1β（IL1β）、白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白激酶B1（AKT1）为核心靶点。

2.1.5 生物功能富集分析

2.1.5.1 GO富集分析

通过DAVID数据库对药物与疾病相关的交集基因进行GO基因功能富集分析，筛选出了1 052个GO条目。清心宁神汤治疗失眠富集的生物功能（BP）主要条目789条，细胞成分（CC）相关的有103条，分子功能（MF）相关的有160条，见图4。BP条目主要与对外源性刺激的反应、腺苷酸环化酶激活肾上腺素受体信号通路以及基因表达的正向调控等相关；CC条目则主要富集在质膜、突触前膜和等离子体膜等位置；而MF条目主要包括酶结合、相同蛋白质结合和蛋白结合等功能。

2.1.5.2 KEGG通路富集分析

通过DAVID数据库进行的通路富集分析显示，共识别出170条显著富集的通路。在KEGG通路分析中，主要涉及的治疗相关通路包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidynositol 3kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、血管内皮生长因子（VEGF）、高级糖基化终末产物-受体（AGE-RAGE）信号通路等，见图5。

2.2 分子对接结果

在PDB检索人源蛋白分子，在structure中筛选“method： X-RAY”，“resolution”较小的分子，分别选择PDB ID为“1alu”、“1azv”、“1unq”、“2flu”、“2w3l”的分子分别作为白细胞介素6（IL6）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、蛋白激酶B1（AKT1）、核因子E2相关因子（NRF2）、B淋巴细胞瘤-2基因（BCL2）的蛋白分子来源。利用pymol软件操作蛋白分子，包括删除配体、去水、加氢等；在pubchem数据库中检索“药物分子”。将蛋白分子与药物分子导入AutoDockTools-1.5.7软件，设置对接盒子，使用AutoDock Vina进行分子对接，对接能以热图形式展示见图6。保存结合能较低的药物分子构象，与蛋白分子共同导入pymol绘制“对接位点图”，结果见图7。

2.3 实验结果分析

2.3.1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较

相较于正常组，模型组大鼠的潜伏期和总运动距离显著延长（P<0.01），而它们在目标象限（第二象限）的探索时间百分比则显著减少（P<0.01）。与模型组相比，唑吡坦组、清心宁神汤低剂量组、清心宁神汤高剂量组以及通路抑制剂组的潜伏期和总运动距离减少（P<0.05），同时这些组在目标象限的探索时间百分比显著提高（P<0.01）。相关数据详见图8和图9。

2.3.2 各组大鼠血清中SOD及GSH-PX的水平

与正常组相比，模型组大鼠血清中SOD、GSH-Px水平显著降低（P<0.01），与模型组相比，唑吡坦组、清心宁神汤低剂量组、清心宁神汤高剂量组、通路抑制剂组大鼠血清中SOD、GSH-Px水平显著升高（P<0.01），见图10。

2.3.3 各组大鼠脑组织中NRF2及SOD蛋白表达情况

与正常组相比，模型组大鼠脑组织中NRF2及SOD蛋白表达降低（P<0.05），与模型组相比，唑吡坦组、清心宁神汤低剂量组、清心宁神汤高剂量组、通路抑制剂组大鼠脑组织中NRF2及SOD蛋白表达升高（P<0.05），见图11、图12。

2.3.4 免疫组化法检测各组大鼠脑组织中NRF2及SOD表达情况

与正常组相比，模型组大鼠脑组织中NRF2及SOD表达水平显著降低（P<0.01），与模型组相比，唑吡坦组、清心宁神汤低剂量组、清心宁神汤高剂量组、通路抑制剂组大鼠脑组织中NRF2及SOD表达水平显著升高（P<0.01），见图13、14。

2.3.5 各组大鼠脑组织中NRF2及SOD荧光面积表达情况

与正常组比，模型组脑组织中NRF2及SOD荧光面积表达减少（P<0.05），与模型组比，唑吡坦组、清心宁神汤低剂量组、清心宁神汤高剂量组、通路抑制剂组脑组织中NRF2及SOD荧光面积表达增加（P<0.05），见图15~17。

3 讨论

失眠又称为“不寐”“不得卧”，不仅对患者自身造成巨大困扰，影响其身心健康，并且对社会发展产生深远影响，例如增加交通事故几率、影响社会运转等，失眠也是其他生理和精神疾病的高危因素之一，包括心血管疾病、痴呆、抑郁焦虑等，并对日间认知功能产生负面影响，如降低警觉性、记忆力和执行功能等^{［14，15］}。虽然中医药在治疗失眠方面显示出了显著的疗效和较小的副作用，但由于不同的医学流派对该病的辨证论治方法各异，导致分型标准不一，使得后人难以完全继承其良好的治疗效果。这种情况造成了临床报道中疗效看似很高，但实际上重复性较低的现象。因此，开发一种既符合中医理论又简单客观的失眠辨证分型方法显得尤为重要^{［16，17］}。张星平教授基于不寐疾病的症状特征，提出了一种基于单一症状来确定不寐五脏辨证的诊断方法，即“中医不寐五神分型诊断法”^［18］。这种方法通过单一症状来明确不寐的五脏病位，操作简便且与中医的脏腑辨证理论以及“五神藏”理论相契合，对临床和科研具有重要的意义。其主要内容为：一以入寐维艰为主要临床表现的不寐，其核心病机为心神不入于舍，其病位主要在心；二以梦绕纷纭为主要临床表现的不寐，其核心病机为肝魂不入于舍，其病位主要在肝；三以思虑纷纭为主要临床表现的不寐，其核心病机为脾意不入于舍，其病位主要在脾；四以轻浅易寤为主要临床表现的不寐，其核心病机为肺魄不入于舍，其病位主要在肺；五以夜寐早寤为主要临床表现的不寐，其核心病机为肾志不入于舍，其病位主要在肾；虽然临床不寐病症表现复杂，绝不似以上描述如此单一，但其所有不寐直接症状总不出以上五类或者以上五类的不同排列组合，病位诊断也总不出五脏。该理论主要创新之处为根据不寐患者单一症状即可确立不寐病的五脏病位诊断。心不藏神不寐为其中常见的一种类型，主要表现为入寐维艰甚则彻夜不寐。

清心宁神汤组方如下：黄连10 g、黄芩10 g、夏枯草15 g、醋柴胡10 g、白芍15 g、赤芍15 g、郁金10 g、茯苓10 g、法半夏15 g、炒白术10 g、陈皮10 g、炙甘草10 g。方中黄连为君药，《汤液本草·卷四·草部》言：“黄连气寒，味苦……泻心火，除脾胃中湿热，治烦躁恶心，郁热在中焦。”黄芩清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎，黄芩苷是其提取的有效成分，相关研究表明^［19］黄芩苷能清除超氧负离子、自由基，能抑制黄嘌呤氧化酶的活性，肺纤维化动物模型实验表明^［20］，黄芩苷显著提高机体超氧化物歧化酶的活性。现代研究表明夏枯草具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤和免疫抑制等多种作用^［21］。柴胡、赤芍、白芍、白术、茯苓借鉴了逍遥散的组方，能够疏肝健脾，益气和血，临床除了能治疗阿尔兹海默症等神经退行性病变及焦虑障碍等精神类疾病之外，有文献表明^［22］，能够抵抗皮质酮诱导的PC12细胞损伤模型中的神经损伤，具有神经保护作用。陈皮与法半夏的配伍为二陈，《夏小正·五月》说：“夏至之日鹿角解，后五日蝸始鸣，后五日半夏生。”指出夏至后十日左右，半夏开始生长，半夏能引阳入阴，达到安神的效果，现代药理研究表明^［23］，法半夏有良好的镇静神经中枢作用，其中半夏乙醇成分具有镇静、催眠和抗惊厥作用，并且能通过减少碎片睡眠和增加快速眼动睡眠，改善睡眠质量^［24］。历代以来，法半夏配伍陈皮常用来治疗痰证失眠，疗效显著^［25］。诸药合用，安抚心神，疏肝解郁，补养脾虚，确保心神内守，夜寐得安。

在本研究中，通过PPI 和网络拓扑分析，发现肿瘤蛋白P53（TP53）、白细胞介素1β（IL1β）、白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白激酶B1（AKT1）为清心宁神汤治疗失眠的核心靶点。AKT主要包含Akt1（PKBα）、Akt2（PKBβ）、Akt3（PKBγ）三种亚型，为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 AGC之一。TNF主要来源于活化的巨噬细胞、NK细胞和T淋巴细胞，主要包括TNF-α和TNF-β两种形式。白细胞或免疫细胞间相互作用的细胞因子称为 IL，包括 IL-1 家族、IL-2 家族、趋化因子家族、IL-6 家族、IL-10 家族、IL-12 家族、IL-17 家族及其他类型。失眠会导致机体内分泌紊乱，激活炎症通路，促进炎症基因表达，进而导致促炎细胞因子的释放，发生全身炎症反应^［26］。

GO富集分析显示BP主要集中在对外源性刺激的反应、腺苷酸环化酶激活肾上腺素受体信号通路及基因表达的正向调控。CC主要集中在质膜的组成、突触前膜的组成及等离子体膜。MF主要集中在酶结合、相同蛋白质结合及蛋白结合。KEGG富集分析结果指出，清心宁神汤治疗失眠可能涉及PI3K、AKT，即PI3K/AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路在机体生理病理代谢过程中扮演着关键角色，包括细胞炎症反应、细胞凋亡过程、细胞增殖、转录调控及细胞迁移等多个方面^［27］。

分子对接验证了IL6、SOD1、AKT1、NRF2、BCL2这些蛋白靶点与本方治疗失眠的关键活性成分存在较强亲和力。其中NRF2是一个关键的转录因子，对于氧化应激反应至关重要，它能结合到位于许多细胞保护基因启动子区域的抗氧化反应元件（ARE）上。在正常情况下，NRF2会被BCR（KEAP1）复合体泛素化修饰并在细胞质中降解。在氧化应激反应中，亲电子代谢物会抑制BCR（KEAP1）复合体活性，促进NFE2L2/NRF2与一类小的Maf蛋白形成异二聚体，在细胞核内发生聚集现象。NRF2也会通过调节β-珠蛋白增强子活性参与β-珠蛋白簇基因的转录激活^{［28，29］}。SOD是一种存在于生物体内的抗氧化金属酶，是抗氧化酶系统中的一个关键组成部分，它在微生物、植物和动物等生物体中普遍存在。SOD能够促进超氧阴离子自由基通过歧化反应转化为氧和过氧化氢，对于维持生物体内氧化与抗氧化的平衡具有及其重要的作用，并且与多种疾病的发生和发展密切相关^{［30，31］}。相关研究表明SOD1缺失可增强小鼠的氧化应激，并破坏肠道上皮屏障、降低抗氧化酶活性、增加促炎症性免疫细胞的结肠浸润，以恶化DSS诱导的小鼠结肠炎，而恢复SOD活性可抑制p38-MAPK/NF-κB信号介导的炎症与凋亡反应，从而缓解结肠炎^［32］。

针对网络药理学与分子对接结果，围绕PI3K/AKT这一信号通路进行实验验证。本次动物实验结果显示，失眠模型组大鼠血清中SOD、GSH-Px水平显著降低（P<0.01），脑组织中NRF2及SOD总蛋白表达降低（P<0.05），荧光面积表达减少（P<0.05）。服用清心宁神汤中药组的大鼠血清中SOD、GSH-Px水平显著升高（P<0.01），脑组织中NRF2及SOD蛋白表达升高（P<0.05），荧光面积表达增加（P<0.05），并且呈现剂量依赖性。本研究表明清心宁神汤能够使不寐大鼠水迷宫实验中潜伏期及运动总距离降低（P<0.05），目标象限探索时间增加（P<0.01），证明本方能够改善不寐大鼠的学习及记忆能力，改善失眠带来的健忘等副作用。同时本方能提高失眠大鼠血清中SOD、GSH-Px水平，证明本方能增强失眠大鼠抗氧化能力，缓解氧化应激和神经炎症的损伤。本次蛋白免疫印迹实验、免疫组化实验、免疫荧光实验结果表明清心宁神汤能够改善不寐大鼠体内NRF2及SOD蛋白的表达，改善体内氧化应激反应，缓解神经炎症的发生，达到改善失眠的效果，并且清心宁神汤的效果呈现剂量依赖性。

综上所述，本研究通过网络药理学、分子对接及动物实验相结合的方式较为全面的研究了清心宁神汤治疗失眠的作用机制。清心宁神汤通过其多种成分、多个靶点的共同作用，实现了改善失眠症状的效果。实验数据表明，该方能有效提升失眠大鼠体内SOD、GSH-Px及NRF2的水平，从而缓解氧化应激反应，这种作用机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。本研究尚存在一些局限性，预测靶点和通路的实验验证相对有限，仅验证了PI3K/AKT信号通路在清心宁神汤治疗失眠中的作用，但是对于其他预测的关键靶点和通路的作用，仍需通过额外的实验来进一步验证。

作者贡献度说明：

吴金鸿：负责设计实验、实施及撰写论文；张星平：负责论文指导及校审；梁政亭、梁瑞宁、陈旭、贾宏林、李振辉：负责数据处理和分析；胡燕玲、崔文军、胡龙涛：负责指标检测和数据收集。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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