基于METTL14‑m⁶A‑FOXO3A信号通路介导的细胞自噬探讨补肾强督方抑制炎症治疗强直性脊柱炎的机制研究

Bushen Qiangdu formula in suppressing inflammation in ankylosing spondylitis via METTL14‑m⁶A‑FOXO3A signaling pathway mediated autophagy

摘要

目的 观察补肾强督方对T淋巴细胞METTL14-m⁶A-FOXO3A信号通路介导的细胞自噬的影响，从而明确其抑制炎症、治疗强制性脊柱炎的分子机制。 方法 使用Jurkat细胞，采用抗CD3联合抗CD28抗体诱导24 h构建细胞模型，并给予补肾强督方含药血清和METTL14重组蛋白进行干预。采用ELISA法检测炎症因子（IL-23和IL-17A）和氧化应激指标的水平，流式细胞术检测ROS水平，Western blot法检测自噬相关蛋白、METTL14和FOXO3A的表达，RT-qPCR检测METTL14和FOXO3A的表达，斑点杂交实验检测FOXO3A的m⁶A甲基化水平。 结果 与模型组比较，补肾强督方显著降低Jurkat细胞上清中IL-23、IL-17A和MDA的含量与ROS的水平，增加SOD和GSH-Px的活性，差异均具有统计学意义（P<0.01）。此外，补肾强督方能显著上调Jurkat细胞中Beclin-1、FOXO3A和METTL14蛋白和基因的表达和增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下调p62蛋白的表达，与模型组比较差异均具有统计学意义（P<0.01）。在此基础之上，与模型组比较，补肾强督方能显著上调Jurkat细胞FOXO3A的m⁶A甲基化水平，差异均具有统计学意义（P<0.01）。 结论 补肾强督方通过METTL14介导的FOXO3A的m⁶A甲基化修饰促进T细胞自噬，从而达到治疗强直性脊柱炎的作用。

Abstract

Objective To investigate the effect of Bushen Qiangdu formula on METTL14-m⁶A-FOXO3A signaling pathway-mediated autophagy in T lymphocytes， and to elucidate its molecular mechanism in suppressing inflammation for the treatment of ankylosing spondylitis （AS）. Methods Jurkat cells were stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies for 24 h to establish the cell model， followed by intervention with Bushen Qiangdu medicated serum and METTL14 recombinant protein. ELISA was used to measure the levels of inflammatory factors （IL-23 and IL-17A） and oxidative stress markers. ROS levels were assessed by flow cytometry. Western blot methodology was utilized to ascertain the levels of expression of autophagy-related proteins， namely METTL14 and FOXO3A.Real-time quantitative polymerase chain reaction was used to determine the mRNA and protein expression levels of METTL14 and FOXO3A， and dot blot hybridization was performed to assess the m⁶A methylation level of FOXO3A. Results Compared to the model group， Bushen Qiangdu medicated serum significantly reduced the levels of IL-23， IL-17A， and MDA， as well as ROS levels of Jurkat cells， all of which were statistically significant （P<0.01）， while the activity of SOD and GSH-Px were increased. The results demonstrated statistically significant discrepancies between the experimental and control groups （P<0.01）. Additionally， Bushen Qiangdu medicated serum notably upregulated the expression of Beclin-1， FOXO3A， and METTL14 proteins， and increased the LC3II/LC3I ratio while downregulating p62 protein expression （P<0.01）. Moreover， Bushen Qiangdu medicated serum significantly enhanced the m⁶A methylation level of FOXO3A in Jurkat cells compared to the model group （P<0.01）. Conclusion Bushen Qiangdu formula promotes T cell autophagy through METTL14-mediated m⁶A methylation of FOXO3A， achieving therapeutic effects in AS.

Graphical abstract

关键词

补肾强督方 / T淋巴细胞 / METTL14 / FOXO3A / m⁶A甲基化修饰

Key words

Bushen Qiangdu formula / T lymphocytes / METTL14 / FOXO3A / m⁶A methylation modification

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种全身性、慢性进行性的炎症性自身免疫性疾病^［1］。AS是中轴型脊柱关节炎（axial spondyloarthritis，AxSpA）的最常见亚型之一，主要影响骶髂关节、中轴骨骼和外周关节，最终导致脊柱和关节强直^［2］。此外，AS患者还存在关节外表现，包括急性炎症性肠病、银屑病、前葡萄膜炎和骨质疏松症等^［3］。AS常见于20~30岁的年轻男性，大约90%的AS患者在40岁之前出现症状，不仅严重影响患者的生活质量，抑制年轻患者的工作能力，危害个人身心健康，还给患者和社会带来巨大的负担^［4］。

AS的患病率在西方人群中为1%~2%，在中国汉族人群中约为0.2%~0.54%^［5］。尽管在AS发病机制方面研究取得了重大进展，但其确切原因仍然未知。非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是治疗AS的一线药物，然而长期服用存在显著的副作用^［6］。此外，针对NSAIDs效果不佳的患者推荐使用包括肿瘤坏死因子抑制剂或白细胞介素-17抑制剂等在内的生物制剂，然而临床疗效欠佳^［7］。AS属于中医“脊痹”“肾痹”“骨痹”等的范畴，中医认为本病与督脉密切相关，主要由寒邪外袭导致。补肾强督方为李泽光教授治疗AS的经验方，已被证实可以抑制破骨细胞的分化和炎症反应^［8］。为进一步明确补肾强督方治疗AS的机制，本研究通过观察补肾强督方对T淋巴细胞METTL14-m⁶A-FOXO3a信号通路介导的细胞自噬的影响，从而深入阐述其抑制免疫炎症的分子靶点，从而为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞

人急性T淋巴细胞白血病细胞株（Jurkat）由南京珞宁生物科技有限公司提供。使用含10%胎牛血清、10 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI100培养液，并置于5%CO₂、37 ℃的无菌培养箱中进行细胞培养。

8周龄的Sprague Dawley大鼠（SPF级别，雄性，体质量范围220~250 g）购于赛业（固安）生物科技有限公司，许可证号：SCXK（冀）2021-003。大鼠饲养于黑龙江中医药大学中西医结合实验室，12 h循环周期光照，饲养环境：温度为（23±3） ℃、湿度为（48±4）%。

1.2 药物与试剂

补肾强督方（由熟地20 g、狗脊15 g、续断20 g、桂枝15 g、独活15 g、威灵仙15 g、伸筋草30 g、千年健20 g、红花10 g、忍冬藤20 g、蜈蚣1条、土茯苓20 g、延胡索10 g、乌药10 g、白芥子5 g和炙甘草10 g组成）购于黑龙江中医药大学附属第一医院草药局。活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购于上海翌圣生物科技股份有限公司（货号：50101ES01）。重组人CD3、CD28和METTL14蛋白均购于英国Abcam公司（货号：ab286041、ab245796和ab163640）。兔抗Beclin-1、LC3、P62/SQSTM1、FOXO3A、METTL14、β-actin和HRP标记的羊抗兔二抗均购于武汉Proteintech公司（货号：11306-1-AP、14600-1-AP、18420-1-AP、10849-1-AP、26158-1-AP、66009-1-Ig和SA00001-2）。ECL Plus超敏发光液、人白细胞介素23（interleukin 23，IL-23）、IL-17A、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司（货号：SEKH-0034、SEKH-0026、PE0010、BC0025、BC5165和BC1195）。

1.3 含药血清制备

经过1周适应性饲养，大鼠随机分为两组：空白组（n=10）与补肾强督方组（n=10）。参照人与动物药物等效剂量换算公式，补肾强督方组大鼠给予补肾强督方水煎液20.57g/kg进行灌胃，2 mL/次，2次/日。而空白组给予等体积的蒸馏水灌胃，连续7 d。于末次灌胃后2 h大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，静置后离心（3 000 rpm，离心半径10 cm，10 min）。随后以滤膜过滤和水浴灭活，-20 ℃保存备用。

1.4 细胞分组与药物干预

取处于对数生长期的Jurkat细胞随机分为空白组、模型组、补肾强督方低剂量组、补肾强督方中剂量组。除空白组外，余下各组参照文献中方法采用抗CD3联合抗CD28抗体诱导24 h构建细胞模型^［9］。随后各组给予相应的药物进行干预，具体如下：（1）培养基（900 μL）+空白血清（100 μL）；（2）模型组：培养基（900 μL）+CD3（1 μg/mL）+CD28（1 μg/mL）+空白血清（100 μL）；（3）补肾强督方低剂量组：培养基（990 μL）+CD3（1 μg/mL）+CD28（1 μg/mL）+补肾强督方含药血清（10 μL）；（4）补肾强督方中剂量组：培养基（950 μL）+CD3（1 μg/mL）+ CD28（1 μg/mL）+补肾强督方含药血清（50 μL）；（5）补肾强督方高剂量组：培养基（900 μL）+CD3（1 μg/mL）+CD28（1 μg/mL）+补肾强督方含药血清（100 μL）；（6）METTL14过表达组：培养基（1 mL）+CD3（1 μg/mL）+CD28（1 μg/mL）+METTL14（300 μg/mL）。24 h后收集各组细胞，用于后续指标检测。

1.5 指标检测

1.5.1 ELISA法检测

24 h后取上述干预后的Jurkat细胞，于冰上用超声波破碎细胞，离心（5 000 rpm，离心半径10 cm，15 min）取上清。采用酶标仪于450/412/532 nm处检测各组细胞上清中IL-18、IL-17A、MDA、SOD和GSH-Px的吸光度值，实验操作严格按照试剂盒说明进行。

1.5.2 流式细胞检测

取生长对数期Jurkat细胞，以5×10⁵每孔的密度接种于24孔板中，参照“1.4”项中分组与干预方法，24 h后收集细胞。加入适当比例稀释的DCFH-DA探针，并充分接触。无血清培养基洗涤后调整细胞浓度，上流式细胞仪检测细胞ROS的水平。

1.5.3 Western blot

24 h后取上述干预后的Jurkat细胞，于冰上加入RIPA进行细胞裂解，4 ℃离心（3 000 rpm，离心半径10 cm，5 min）分离蛋白并测定蛋白浓度。上样，电泳，转膜后加入5%脱脂牛奶室温下封闭。加入稀释后的Beclin-1、LC3、p62、METTL14、FOXO3a和β-actin一抗，4 ℃过夜。随后加入对应稀释后的二抗，室温下继续孵育1h。TBST洗膜后，加入发光液置于凝胶成像系统中显影。采用3软件对结果进行定量分析，以β-actin作为内参蛋白。

1.5.4 RT‑qPCR

24 h后取上述干预后的Jurkat细胞，参照试剂盒说明书提取细胞总RNA，逆转录试剂盒将RNA转录为互补DNA。以互补DNA作为模板，加入反应体系进行PCR扩增。引物信息如下：METTL14上游：5'-GGGATAGTGAAAAGCCGGAG-3'，下游：5'-GCTCATCTTTGCTATTTAACACGG-3'；FOXO3A上游：5'-CTAAGCAGGCCTCATCTCAG-3'，下游：5'-GGTATCACTGTCCACTTGCTG-3'；β‑actin上游：5'-GTCTTCCC CTCCATCGTG-3'，下游：5'-GTACTTCAGGGTGAGGATGC-3'。变性、退火、延伸，以β‑actin作为内参基因，使用2^-∆∆Ct法计算METTL14和FOXO3A的相对表达水平。

1.5.5 Dot blot

24 h后取上述干预后的Jurkat细胞，参照试剂盒说明书分别提取总RNA并分离mRNA，紫外线照射变性后冰上冷冻。将mRNA滴加在带正电的尼龙膜上，紫外线照射固定。TBST洗涤，加入5%脱脂牛奶后加入适当比例稀释的m⁶A抗体于4 °C孵育过夜。滴加适当比例稀释的HRP标记的二抗继续孵育60min。TBST洗膜后，加入发光液置于凝胶成像系统中显影。采用Image J软件对结果进行定量分析。

1.6 统计分析

实验数据通过SPSS软件（版本29.0）进行统计分析，数据均以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示。多组间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两的比较采用最小显著性差异法检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞IL‑23和IL‑17A含量的比较

与空白组比较，模型组Jurkat细胞IL-23和IL-17A的含量显著增加，差异均具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，补肾强督方低剂量、补肾强督方中剂量、补肾强督方高剂量和METTL14重组蛋白均能显著降低Jurkat细胞上清中IL-23和IL-17A的含量，差异均具有统计学意义（P<0.01），见表1。

2.2 各组细胞ROS水平的比较

与空白组比较，模型组Jurkat细胞ROS的水平显著增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，补肾强督方低剂量、补肾强督方中剂量、补肾强督方高剂量和METTL14重组蛋白均能显著降低Jurkat细胞ROS水平，差异均具有统计学意义（P<0.01），见表2和图1。

2.3 各组细胞MDA、SOD和GSH‑Px的比较

与空白组比较，模型组Jurkat细胞中MDA的含量显著增加，SOD和GSH-Px的活性显著降低，差异均具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，补肾强督方低剂量、补肾强督方中剂量、补肾强督方高剂量和METTL14重组蛋白均能显著降低Jurkat细胞中MDA的含量，增加SOD和GSH-Px的活性，差异均具有统计学意义（P<0.01），见表3。

2.4 各组细胞自噬蛋白表达的比较

与空白组比较，模型组Jurkat细胞中Beclin-1蛋白的表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显著下调，p62蛋白的表达显著上调，差异均具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，补肾强督方低剂量、补肾强督方中剂量、补肾强督方高剂量和METTL14重组蛋白均能显著上调Jurkat细胞中Beclin-1蛋白的表达和增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下调p62蛋白的表达，差异均具有统计学意义（P<0.01），见表4和图2。

2.5 各组细胞FOXO3a表达的比较

与空白组比较，模型组Jurkat细胞中FOXO3A蛋白和mRNA的表达显著下调，差异均具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，补肾强督方低剂量、补肾强督方中剂量、补肾强督方高剂量和METTL14重组蛋白均能显著上调Jurkat细胞中FOXO3A蛋白和mRNA的表达水平，差异均具有统计学意义（P<0.01），见表5和图3。

2.6 各组细胞METTL14表达的比较

与空白组比较，模型组Jurkat细胞中METTL14蛋白和mRNA的表达显著下调，差异均具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，补肾强督方低剂量、补肾强督方中剂量、补肾强督方高剂量和METTL14重组蛋白均能显著上调Jurkat细胞中METTL14蛋白和mRNA的表达水平，差异均具有统计学意义（P<0.01），见表6和图4。

2.7 各组细胞FOXO3A m⁶A甲基化水平的比较

与空白组比较，模型组Jurkat细胞中FOXO3A m⁶A甲基化水平显著下调，差异均具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，补肾强督方低剂量、补肾强督方中剂量、补肾强督方高剂量和METTL14重组蛋白均能显著上调Jurkat细胞FOXO3A m⁶A甲基化水平，差异均具有统计学意义（P<0.01），见表7和图5。

3 讨论

AS是以慢性、持续和低水平炎症为特征，T细胞是炎性细胞因子的主要来源。越来越多的证据表明，T细胞免疫失衡引起的持续炎症反应和组织损伤是AS的突出特征^［10］。IL-23是一种促炎细胞因子，通过驱动Th17细胞的分化和活化，产生IL-17A、IL-6、IL-22和肿瘤坏死因子α，促进炎症和骨质破坏^［11］。自噬是细胞通过溶酶体/空泡消化其组分以维持正常生理活动和稳态的重要机制。越来越多的证据表明自噬参与AS的发病机制^［12］。此外，自噬还能够通过靶向错误折叠的HLA-B27蛋白，促进其降解。不仅如此，研究发现在自噬水平的缺陷与AS患者T细胞中促炎细胞因子的表达显著增加^［13］。本研究结果显示，在CD3/CD28诱导的Jurkat细胞中，IL-23和IL-17A的含量显著增加。而补肾强督方能够显著抑制Jurkat细胞中IL-23和IL-17A的水平。进一步研究结果显示，补肾强督方能够显著上调Jurkat细胞中Beclin-1蛋白的表达和增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下调p62蛋白的表达，从而促进Jurkat细胞的自噬水平。以上研究结果提示，补肾强督方通过促进自噬抑制T细胞的活化，从而达到抗炎的作用。

氧化应激已被证实参与AS的发生和发展^［14］。与健康对照组相比，AS患者ROS和总氧化状态的水平显著增加，而总抗氧化状态与总抗氧化能力的水平显著降低^［15］。作为氧化应激的标志物，MDA是细胞膜脂质在氧化应激条件下的通过过氧化反应生成的一种脂质过氧化产物，与细胞氧化应激水平呈现显著正相关^［16］。SOD通过催化超氧化物阴离子转化为过氧化氢与氧气，从而减轻氧化应激达到防止细胞损伤的作用，是一类重要的抗氧化酶^［17］。GSH-Px通过催化过氧化氢和有机过氧化物的还原反应，从而防止脂质过氧化的发生，保护细胞膜的完整性，是体内重要的抗氧化剂^［18］。FOXO3A是叉头盒基因家族的一员，作为转录因子，FOXO3A与细胞增殖、凋亡、自噬、OS和衰老密切相关^［19］。此外，FOXO3A还被证实可调节T细胞的活化、分化和功能^［20］。本研究结果显示，在CD3/CD28诱导的Jurkat细胞中，ROS水平和MDA的含量显著增加，SOD和GSH-Px的活性显著降低。补肾强督方能够显著下调Jurkat细胞中FOXO3A的表达，降低ROS水平和MDA的含量，增加SOD和GSH-Px的活性。以上结果提示，补肾强督方主要通过FOXO3A抑制氧化应激。

在转录后修饰中，目前已鉴定出100多种RNA的化学修饰，其中N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰约占所有RNA甲基化的50%。作为是最常见和最丰富的RNA内部修饰之一，m⁶A甲基化存在于几乎所有真核生物和一些细菌、病毒、酵母菌和植物中^［21］。m⁶A甲基化广泛存在于mRNA、miRNA和非编码长链RNA中，并参与RNA的基本病理生理代谢过程，包括剪接、核输出、翻译、衰变、折叠和RNA-蛋白质相互作用^［22］。功能上，m⁶A由写入器“writer”、擦除器“eraser”和读码器“reader”调控，从而影响RNA的生命周期、功能和细胞内过程^［23］。作为写入器，METTL14是一个重要的RNA甲基转移酶，主要负责将甲基添加到RNA分子的特定位置上，已被证实参与炎症的调控^［24］。

补肾强督方为治疗AS的经验方，具有补肾强督、通络祛寒的功效。方中熟地和狗脊共为君药，以填精补髓、补肾壮骨。续断、桂枝、红花和延胡索共为臣药，以化瘀止痛、温通经脉。威灵仙、独活、千年健、伸筋草、土茯苓与蜈蚣通痹止痛、祛风除湿，白芥子与乌药助通络止痛、温通经脉之功，以上八药，共为佐药。炙甘草调和药性，作为使药。本研究结果证实本CD3/CD28诱导的Jurkat细胞中METTL14蛋白和mRNA的表达显著下调，而补肾强督方能够显著上调Jurkat细胞中METTL14的表达。进一步研究显示，补肾强督方通过METTL14促进FOXO3A的m⁶A甲基化修饰，从而增加FOXO3A的稳定表达。Jurkat细胞中FOXO3A的稳定表达通过促进细胞自噬，从而减轻T细胞持续炎症反应和氧化应激。

综上所述，补肾强督方能够通过促进细胞自噬水平，从而抑制炎症和氧化应激，达到治疗AS的作用。具体机制为补肾强督方促进METTL14的表达增加FOXO3A的m⁶A甲基化修饰水平，从而增加FOXO3A的稳定表达。本研究进一步证实了T细胞免疫失衡引起的炎症反应和氧化应激在AS中的作用，也明确了补肾强督方改善AS炎症的分子机制，从而为临床补肾强督方的推广应用提供了实验依据。

作者贡献度说明：

研究由吴琳设计，李泽光指导，李松倍和韩天然完成实验实验，苏晓庆完成指标检测，吴琳对实验数据进行统计，并撰写论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

白求恩医学科学研究基金(TY144EN)