白头翁皂苷B4通过调控AMPK/ACC/CPT1A信号通路改善非酒精性脂肪肝小鼠氧化应激水平的研究

Study of anemoside B4 improving oxidative stress levels in mice with non‑alcoholic fatty liver disease by regulating the AMPK/ACC/CPT1A signaling pathway

摘要

目的 探究白头翁皂苷B4（anemoside B4，AB4）对非酒精性脂肪性肝病（non‑alcoholic fatty liver disease，NAFLD）小鼠的干预作用及可能的分子机制。 方法 采用高脂饮食构建NAFLD小鼠模型并以AB4进行干预。实验过程中监测小鼠体质量、葡萄糖耐量及胰岛素耐量；8周后收集血清、肝脏等组织样本，检测总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low‑density lipoprotein cholesterol，LDL‑C）及高密度脂蛋白胆固醇（high‑density lipoprotein cholesterol，HDL‑C）；采用H&E染色及油红O染色观察肝脏组织病理学改变和脂质沉积情况；采用免疫荧光方法评估AB4对肝脏代谢性炎症的影响；qRT‑PCR及Western blot法检测肝脏组织中腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'‑monophosphate‑activated protein kinase，AMPK）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase,ACC）、肉碱棕榈酰转移酶（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A） mRNA及蛋白表达水平的变化；分析超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH‑Px）的水平。 结果 AB4可明显降低高脂喂养小鼠的体质量，改善小鼠糖耐量异常情况，缓解胰岛素抵抗情况。AB4可改善TC、TG、LDL‑C及HDL‑C的病理变化；各给药组肝脏病理切片显示损伤程度减轻，肝脏脂肪空泡数量减少；血清MDA水平降低，SOD、GSH‑Px水平升高；肝脏炎症因子白细胞介素‑6表达减少。此外，给药组肝脏中AMPK、ACC、CPT1A mRNA及蛋白表达升高。 结论 AB4能够调节肝脏脂肪代谢与血糖水平、减轻氧化应激反应，且其治疗NAFLD的潜在的作用机制可能与调控AMPK/ACC/CPT1A信号通路有关。

Abstract

Objective To explore the intervention effect of anemoside B4（AB4） on mice with non‑alcoholic fatty liver disease （NAFLD） and its possible molecular mechanism. Methods The NAFLD mouse model was established by a high‑fat diet and was treated with AB4. During the experiment， the body weight， glucose tolerance， and insulin tolerance of the mice were monitored. After 8 weeks， serum， liver and other tissue samples were collected to detect total cholesterol （TC）， triglycerides （TG）， low‑density lipoprotein cholesterol （LDL‑C）， and high‑density lipoprotein cholesterol （HDL‑C）； Histopathological changes and lipid deposits in the liver were assessed using H&E staining and oil red O staining. Immunofluorescence was used to evaluate the effects of AB4 on liver metabolic inflammation. The mRNA and protein expression levels of adenosine 5'‑monophosphate‑activated protein kinase（AMPK）， acetyl CoA carboxylase （ACC）， and carnitine palmitoyltransferase 1A （CPT1A） in liver were detected by qRT‑PCR and Western blot. The levels of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA） and glutathione peroxidase （GSH‑Px） were analyzed. Results AB4 could significantly reduce the body weight of high‑fat fed mice， improve the abnormal glucose tolerance of mice， and relieve insulin resistance. AB4 could improve the pathological changes of TC， TG， LDL‑C， and HDL‑C. The liver pathological sections of each administration group showed that the degree of injury was reduced， the number of hepatic fat vacuoles was reduced， the serum MDA level was decreased， the SOD and GSH‑Px levels were increased， and the expression of liver inflammatory factor interleukin‑6 was decreased. In addition， after AB4 intervention， the mRNA and protein expressions of AMPK， ACC， and CPT1A in liver of drug administration groups were increased. Conclusion AB4 can regulate liver fat metabolism and blood glucose level， reduce oxidative stress response， and its potential mechanism of action in the treatment of NAFLD may be related to the regulation of the AMPK/ACC/CPT1A signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

白头翁皂苷B4 / 非酒精性脂肪肝 / 氧化应激 / AMPK/ACC/CPT1A信号通路

Key words

Anemoside B4 / Non‑alcoholic fatty liver disease（NAFLD） / Oxidative stress response / AMPK/ACC/CPT1A signaling pathway

非酒精性脂肪性肝病（non‑alcoholic fatty liver disease，NAFLD），即在排除了过度饮酒及其他确切的肝脏损害因素之后，肝细胞呈现出弥漫性、大泡性、脂肪变性的一种临床症状^［1‑3］，是目前全球范围内最常见的慢性肝病，其具体发病机制较为复杂，其中“二次打击”学说被广泛接受^［4，5］。目前，针对NAFLD主要的治疗手段聚焦于饮食管控与运动强化两方面；在药物治疗领域，胰岛素增敏剂和他汀类药物是较为常用的药物类型^［6‑8］。然而，这些药物在使用过程中存在一定的局限性，不能达到理想的治疗效果。因此，寻找新型的低毒高效抗NAFLD药物具有迫切的现实意义。

白头翁是毛莨科植物白头翁Pulsatilla chinensis （Bge.） Regel的干燥根，具有清热解毒、凉血止痢的功效^［9，10］。白头翁皂苷B4（anemoside B4，AB4）是从白头翁中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节和抗血管生成等作用^{［11‑14］}。相关研究显示，AB4能促使脓毒症大鼠血清里的天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase， AST）及丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase， ALT）水平明显降低，还能大幅降低肝脏过氧化物酶的活性，进而改善脓毒症大鼠的肝脏状态^［15］。AB4对于高脂饮食所引发的ApoE^‑/‑ 基因敲除小鼠的动脉粥样硬化同样具有疗效。深入探究其治疗作用背后的内在机理，发现其与降低脂质在机体组织中的浸润程度，以及缓解炎症反应的程度有着密切联系^［16］。此外，AB4对急性肝损伤有一定的治疗效果^［17］，但其具体机制尚不明确。本研究采用高脂饮食诱导的方式构建NAFLD小鼠模型，其核心目标在于深入探究AB4针对NAFLD的治疗效能以及潜在的作用机制，以期为后续新型抗NAFLD药物的研发提供坚实的理论基础，从而为NAFLD的临床治疗提供更多的药物选择和治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性C57BL/6J小鼠购自江苏华创信诺公司［SCXK（苏）2020‑0009］，于江苏医药职业学院SPF实验动物房进行饲养，实验期间允许小鼠自由饮水和进食。本实验获得江苏医药职业学院动物伦理委员会批准（编号：2020011）。

AB4（上海爱必信生物科技有限公司）；H&E染色液（Solarbio 公司）；总RNA提取试剂（Trizol Thermofisher公司）；RNA逆转录合成cDNA试剂盒（Thermofisher公司）；PCR试剂盒（Roche公司）；PCR引物（博士德生物工程有限公司）；白细胞介素‑6（interleukin‑6，IL‑6）抗体（CST公司）；腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'‑monophosphate‑activated protein kinase，AMPK） Alpha Monoclonal Antibody、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC） Monoclonal Antibody、肉碱棕榈酰转移酶（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A） Monoclonal Antibody（武汉三鹰生物有限公司）。

酶标仪（美国Bio Tek公司）；脱色摇床（其林贝尔仪器制造有限公司）；涡旋仪（上海泱浩仪器有限公司）。

1.2 实验动物分组与干预

实验小鼠给予60%高脂饲料喂养建立肥胖模型。24只小鼠适应性喂养1周后，随机分为4组（n=6）：Control组、Model组、AB4低剂量组（AB4‑10 mg/kg）和AB4高剂量组（AB4‑20 mg/kg）。实验小鼠给予60%高脂饲料喂养建立肥胖模型，Control小鼠给予10%脂肪供能，通过灌胃给药8周，Control组和Model组给予相同体积的生理盐水。在实验期间，小鼠可自由饮水和进食饲料。

1.3 葡萄糖耐量实验

在禁食12 h后，对各组小鼠进行腹腔注射20%葡萄糖溶液，注射体积按小鼠体质量（g）×10 μL计算，并在30、60、90、120 min测量小鼠的血糖水平。

1.4 胰岛素耐量实验

在禁食2 h后，对各组小鼠进行腹腔注射0.1 U/mL胰岛素溶液，注射体积按小鼠体质量（g）×10 μL计算，并在30、60、90、120 min时测定其血糖水平。

1.5 小鼠称重以及组织样本采集

在实验过程中，每周记录1次小鼠的体质量。连续喂养8周后，眼眶采血后在异氟烷麻醉下处死小鼠，随后收集肝组织。

1.6 组织病理学分析

将固定24 h的肝组织取出进行石蜡包埋，并切成厚度为5 μm的切片，随后对切片进行染色，最后在光学显微镜下观察并拍摄图像。

1.7 血脂相关指标测定

将采集的各组小鼠外周血采用全自动生化分析仪测定总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low‑density lipoprotein cholesterol，LDL‑C）、高密度脂蛋白胆固醇（high‑density lipoprotein cholesterol，HDL‑C）的含量。

1.8 氧化应激水平检测

采用ELISA测定小鼠血清中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH‑Px）水平。按照试剂盒说明书的操作步骤，检测血清中上述指标的具体水平。

1.9 免疫荧光

将肝组织石蜡切片经脱蜡和梯度酒精脱水处理后，用PBS冲洗5 min，重复3次，随后进行免疫荧光染色。首先，在室温下使用3% BSA封闭切片30 min，然后在切片上滴加稀释比例为1∶100的IL‑6抗体，并置于湿盒中，4 ℃下过夜孵育。次日，回收一抗，再用PBS冲洗5 min，重复3次。之后在每张切片上滴加二抗，并在室温下孵育1 h，移去二抗，再用PBS冲洗5 min，重复3次。接着滴加DAPI孵育5 min，用PBS冲洗5 min，重复3次，晾干切片后，使用防荧光淬灭剂进行封片，最后立即在荧光显微镜下观察。

1.10 qRT‑PCR检测肝组织中相关因子转录水平的表达

使用Trizol试剂从肝脏中提取RNA，随后利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以GAPDH作为内参基因，应用2^-△△CT方法计算目标基因的mRNA相对表达量。实验步骤依据试剂盒说明书进行操作，基因引物序列见表1。

1.11 Western blot检测肝脏组织中相关蛋白水平的表达

使用RIPA裂解液在冰上对肝脏组织进行匀浆，以提取总蛋白。蛋白定量后，取30 μg总蛋白进行SDS‑PAGE电泳，转膜并封闭，然后将一抗在4 ℃摇床上孵育过夜。随后用TBST洗膜，加入二抗在常温下孵育1 h。再用TBST洗膜后，加入ECL显色液对蛋白条带进行显影并拍照。最后，分析条带的灰度值，并以β‑actin作为内参计算各目的条带的相对表达量。

1.12 统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。计量资料以\overline{x}\pm s表示，对于符合正态分布且方差齐性的检验数据，采用两独立样本均数的t检验比较2组之间的差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AB4对小鼠体质量的影响

C57BL/J小鼠经适应性喂养1周后进行分组。随机分成4组后再按照试验设计分别给予正常或高脂饲料或联合药物后喂养8周。随着喂养时间的延长，各组小鼠的体质量逐渐增加（图1A）。Model组小鼠的体质量明显高于Control组（P<0.01）；与Model相比，AB4‑10 mg/kg组及AB4‑20 mg/kg组小鼠体质量呈降低趋势，差异具有统计学意义（P<0.01）（图1B）。上述结果表明AB4能降低高脂喂养小鼠的体质量。

2.2 AB4对小鼠葡萄糖耐量和胰岛素耐量的影响

腹腔注射葡萄糖溶液后，各组的血糖水平在30 min内达到峰值然后开始下降。此外，在每个时间点Model组小鼠血糖值明显高于Control组（P<0.01），说明喂养高脂饲料的小鼠糖耐量发生异常；而与Model组小鼠相比，AB4‑10 mg/kg组及AB4‑20 mg/kg组小鼠血糖浓度明显降低，并且曲线下面积也明显低于Model组（P<0.01），表明AB4能改善喂养高脂饲料小鼠糖耐量异常情况，见图2A。

腹腔注射胰岛素后，各组的血糖水平在30 min内到达最低然后开始上升。另外，在每个时间点Model组小鼠血糖值明显高于Control组（P<0.01），说明喂养高脂饲料的小鼠发生胰岛素抵抗现象；而与Model组小鼠相比，AB4‑10 mg/kg组及AB4‑20 mg/kg组小鼠血糖浓度明显降低，并且曲线下面积也明显低于Model组（P<0.01），表明AB4能提高小鼠胰岛素敏感性，从而改善胰岛素抵抗情况，见图2B。

2.3 AB4对小鼠血生化指标的影响

分析各组小鼠血清TC、TG、LDL‑C和HDL‑C的水平发现，与Control组相比，Model组小鼠TC、TG和LDL‑C水平明显升高（P<0.01），而HDL‑C水平明显降低（P<0.01）；与Model相比，在给予20 mg/kg AB4后，小鼠TC、TG和LDL‑C水平明显降低（P<0.01），而HDL‑C水平明显升高（P<0.01）。实验结果表明AB4能改善小鼠的血脂水平升高的症状，见图3A~D。

2.4 AB4对小鼠肝组织形态及脂质累积的影响

H&E染色结果显示Model组小鼠的肝脏受损明显，而在低剂量和高剂量AB4组中，肝损伤有所缓解。油红O染色结果显示Model组小鼠的肝脂肪蓄积较Control组明显增加，而AB4低剂量和高剂量组肝脏脂肪的堆积明显减少。这些结果表明，AB4可以改善高脂饮食小鼠的肝损伤和脂肪堆积，见图4。

2.5 AB4对小鼠肝组织代谢性炎症的影响

通过免疫荧光检测各组小鼠肝组织中IL‑6表达情况。与Control组相比，Model组肝组织中IL‑6的表达明显升高；AB4处理组中的IL‑6的表达较Model组明显降低。上述实验结果表明AB4能减少高脂喂养小鼠肝脏炎症因子IL‑6的表达，见图5。

2.6 AB4对小鼠肝脏组织AMPK、ACC、CPT1A的mRNA表达的影响

通过qRT‑PCR分析肝脏组织中AMPK、ACC、CPT1A的表达。与Control组相比，Model组小鼠肝脏中的AMPK、ACC、CPT1A的mRNA相对表达量降低，差异具有统计学意义 （P<0.01）。与Model组相比，AB4‑20 mg/kg组小鼠肝脏组织中AMPK、ACC、CPT1A的mRNA相对表达量明显升高（P<0.05），见图6A~C。

2.7 AB4对小鼠肝脏组织AMPK、ACC、CPT1A蛋白表达的影响

进一步通过Western blot分析肝脏组织中AMPK、ACC、CPT1A蛋白的表达。与Control组相比，Model组小鼠肝脏中的p‑AMPK、p‑ACC、CPT1A蛋白的相对表达量降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。此外，与Model组相比，AB4‑20 mg/kg组小鼠肝脏组织中p‑AMPK、p‑ACC、CPT1A蛋白的相对表达量明显升高（P<0.05），见图7A~D。

2.8 AB4对小鼠氧化应激水平的影响

与Control组相比，Model组小鼠血清SOD活性水平及GSH‑Px含量明显降低（P<0.05），MDA含量明显升高（P<0.01）。与Model组相比，AB4‑20 mg/kg组小鼠血清中SOD活性水平及GSH‑Px含量明显升高（P<0.05），且MDA含量明显降低（P<0.01）。上述实验结果表明AB4可有效改善小鼠氧化应激的水平，见图8A~C。

3 讨论

NAFLD属于临床常见的慢性肝脏疾病类型，存在向非酒精性脂肪性肝炎转变的可能性。一旦发展为非酒精性脂肪性肝炎，病情便有继续恶化的风险，可能引发肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌等严重后果，对肝脏健康构成严重威胁^{［18，19］}。线粒体功能障碍、内质网应激和细胞因子等多种因素共同诱导NAFLD的发生^［20］。研究表明，调控脂质和能量代谢可能成为治疗NAFLD的重要突破口^［21］。课题组前期研究发现，AB4具有明显的降脂作用，能有效减少NAFLD小鼠肝脏脂肪蓄积。然而，其具体作用机制尚不明确。已有研究表明，AMPK在肝脏脂质代谢进程中占据关键地位，当前已成为NAFLD预防与治疗的核心靶点^［22］，其在肝脏中能借助调控下游的ACC以及CPT1A通路参与脂肪酸的氧化分解^{［23，24］}。因此，本研究基于AMPK/ACC/CPT1A信号通路，从氧化应激调控的角度探讨AB4治疗NAFLD的潜在机制。

肝脏是胰岛素发挥作用的重要器官之一，其对血糖的调节依赖于对胰岛素的敏感性。本次实验结果显示，高脂饲料诱导的NAFLD小鼠体内出现胰岛素抵抗，肝脏对胰岛素的敏感性下降，导致肝脏对葡萄糖的摄取和利用减少。通过AB4干预，不仅可以改善高脂饲料喂养小鼠的糖耐量异常情况，还能提高小鼠的胰岛素敏感性，从而缓解胰岛素抵抗。

研究表明，肝细胞中脂质积累异常和脂肪变性是NAFLD进展过程中的主要特征^［25］。本实验采用高脂饲料构建NAFLD小鼠模型，通过H&E染色和油红O染色发现，模型组小鼠的肝脏出现明显的脂肪变性、炎症和气球样变等病理变化。此外，模型组小鼠的TC、TG和LDL‑C水平明显升高，HDL‑C水平明显降低，提示模型组小鼠出现了肝功能损伤、肝脏脂肪蓄积、脂肪变性及脂代谢异常。经AB4干预后，低、高剂量组小鼠的肝脏结构和肝细胞明显恢复，同时肝脏脂肪变性明显改善，TC、TG和LDL‑C水平明显降低，HDL‑C水平明显升高。这表明高脂饲料诱导的NAFLD小鼠在AB4治疗下，病理状况得到明显改善。AB4能有效治疗NAFLD小鼠的肝功能损伤，明显减轻肝脏脂肪蓄积，改善脂代谢异常，从而减缓NAFLD病变的发展。免疫荧光结果也提示AB4能在一定程度上减少NAFLD模型小鼠肝脏炎症因子IL‑6的表达，进一步改善NAFLD的病程发展。

AMPK是调节细胞和整体代谢及治疗多种代谢性疾病的核心^［26］。肝脏AMPK活性受损被认为是肝脂肪变性的重要因素，抑制AMPK可刺激合成代谢途径如脂质合成，并抑制分解代谢途径^［27］。肝脏脂肪酸的主要消耗途径是线粒体β氧化，CPT系统在这一过程中发挥重要作用。在机体的代谢系统中，CPT1扮演着限速酶的关键角色，其主要作用是对游离脂肪酸进行转运工作。CPT1存在A、B、C 3种同工型，其中CPT1A呈现出在肝脏特异性表达的特点^［28］。相关研究发现，上调CPT1A的表达水平后，小鼠的NAFLD状况能得到有效的改善，这为进一步探究NAFLD的治疗策略提供了重要的方向和依据^［29］。激活AMPK能使下游ACC磷酸化并失活，从而促进CPT1A介导的脂肪酸线粒体β氧化，减少TG的合成^［30］。

本实验研究结果显示，NAFLD小鼠肝脏中AMPK、ACC、CPT1A的mRNA和蛋白表达降低，提示在NAFLD情况下，小鼠的AMPK、ACC、CPT1A表达受限。经AB4干预后，小鼠肝脏中AMPK、ACC、CPT1A的mRNA和蛋白表达上调，从而表明AB4可能通过上调AMPK、ACC、CPT1A的表达增强NAFLD小鼠的抗氧化应激水平。

基础研究表明，氧化应激是NAFLD进展过程中的重要危险因素之一^［31］。NAFLD的发生往往与氧化应激现象紧密相连，这种氧化应激状态还会进一步加剧肝脏中脂质的堆积情况^［32］。其中，SOD、MDA、GSH的含量出现异常，是导致氧化系统失去平衡的关键因素。SOD与GSH‑Px作为人体内部具有强大抗氧化效能的活性物质，能有效清除体内的自由基以及超氧化物，从而缓解氧化应激所带来的不良影响。在NAFLD患者中，由于体内氧自由基代谢紊乱，血清中MDA水平升高。MDA是用于衡量机体脂质过氧化程度的关键指标之一；当氧化应激情况出现时，其会推动脂质过氧化物的生成过程，这一过程会使SOD和GSH的水平下降，最终引起肝脏组织出现病理性的改变^［33］。

为进一步探讨AB4通过增强NAFLD小鼠的抗氧化应激水平从而改善小鼠NAFLD，本研究分别检测各组NAFLD小鼠血清中SOD、MDA、GSH的水平，结果显示NAFLD小鼠血清中SOD活性和GSH‑Px含量明显降低，而MDA含量明显升高。经AB4干预后，低、高剂量组小鼠的血清SOD活性和GSH‑Px含量明显升高，MDA含量明显降低。以上研究结果提示AB4干预能调节NAFLD小鼠的抗氧化系统平衡。

综上所述，本实验采用AB4干预高脂饲料诱导的NAFLD模型小鼠，通过检测葡萄糖耐量、胰岛素耐量、TC、TG、LDL‑C、H‑DLC以及氧化应激SOD、MDA、GSH‑Px的表达水平，证实AB4可调节NAFLD小鼠血糖水平、血脂水平，保护肝功能，并改善肝脏脂质沉积，其潜在的作用机制可能是通过激活AMPK介导的ACC/CPT1A的信号通路，调控肝脏脂肪酸代谢和抗氧化应激，达到对NAFLD的治疗效果。本研究发现AB4在NAFLD的治疗中具有潜在价值，为白头翁的开发、利用及推广提供了理论依据。

作者贡献度说明：

蒋鸣：完成实验与指标检测、数据分析、检索文献、撰写论文；田冲冲：设计实验、论文修改、最后校审。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

江苏省盐城市卫生健康委员会2023年度医学科研立项项目(YK2023032)