依达拉奉右莰醇对CRS小鼠焦虑抑郁行为的影响和机制研究

Research on the impact and mechanism of edaravone dexborneol on anxiety and depression behaviors in CRS mice

摘要

目的 探讨依达拉奉右莰醇（edaravone dexborneol，EDB）对慢性约束性应激（chronic restraint stress，CRS）小鼠焦虑抑郁行为的改善作用及其潜在机制。 方法 将雄性C57BL/6小鼠随机分配为4组（n=8）：对照（Control）组、慢性约束性应激（CRS）组、EDB［CRS+EDB（5 mg/kg）］组，EDB［CRS+EDB（10 mg/kg）］组。通过约束应激小鼠每天4 h，连续21 d，诱导抑郁模型。采用旷场实验、悬尾实验、强迫游泳实验评估小鼠焦虑抑郁行为；qPCR检测GSDMD、IL‑1β、AKT、p62、Beclin1、LC3Ⅱ mRNA表达；Western blot检测p‑AKT、p‑AMPK、p62、Beclin1、LC3B、GSDMD、GSDMD‑N、Pro‑IL‑1β、IL‑1β、BDNF蛋白表达；免疫荧光观察海马神经元特异性核蛋白（NeuN）表达并计数。 结果 旷场实验中CRS组小鼠运动总距离、中心区停留时间、平均运动速度均明显低于Control组（P<0.05），EDB给药各组运动总距离、中心区停留时间、平均运动速度均高于CRS组（P<0.05）；悬尾试验和强迫游泳实验中CRS组小鼠不动时间明显高于Control组（P<0.05），EDB各组不动时间明显低于CRS组（P<0.05）；qPCR结果显示，与Control组相比，CRS组GSDMD、IL‑1β、p62 mRNA表达增加，Beclin1、LC3Ⅱ mRNA表达减少（P<0.05）；与CRS组相比，EDB各组GSDMD、IL‑1β、p62 mRNA表达减少，Beclin1、LC3Ⅱ mRNA表达增加（P<0.05）；Western blot结果显示，与Control组相比，CRS组p‑AKT、p62、GSDMD、GSDMD‑N、Pro‑IL‑1β、IL‑1β表达增加，p‑AMPK、Beclin1、LC3B、BDNF表达减少（P<0.05）；与CRS组相比，EDB各组p‑AKT、p62、GSDMD、GSDMD‑N、Pro‑IL‑1β、IL‑1β表达减少，p‑AMPK、Beclin1、LC3B、BDNF表达增加（P<0.05）；免疫荧光结果显示，海马CA1、CA3、DG区CRS组NeuN数量较Control组明显减少（P<0.05），EDB各组NeuN数量较CRS组明显增加（P<0.05）。 结论 EDB可能通过AKT/AMPK通路调节细胞自噬，抑制焦亡及炎症反应，减轻神经元的损伤，改善CRS诱导的小鼠焦虑抑郁行为。

Abstract

Objective To investigate the effects of edaravone borneol （EDB） on anxiety and depressive behaviors in chronic restraint stress （CRS） mice and its potential mechanisms. Methods Male C57BL/6 mice were randomly assigned to 4 groups （n=8）： Control group， Chronic restraint stress （CRS） group， EDB［CRS+EDB（5 mg/kg）］ group， and EDB［CRS+EDB（10 mg/kg）］ group. The depression model was induced by restraining the mice for 4 hours daily for 21 consecutive days. Anxiety and depressive behaviors were assessed using the open field test， tail suspension test， and forced swimming test. qPCR was used to detect the expression of GSDMD， IL‑1β， AKT， p62， Beclin1， and LC3Ⅱ mRNA. Western blot was employed to measure the protein expression of p‑AKT， p‑AMPK， p62， Beclin1， LC3B， GSDMD， GSDMD‑N， Pro‑IL‑1β， IL‑1β， and BDNF. Immunofluorescence was used to observe and count the expression of the neuronal‑specific nuclear protein （NeuN） in the hippocampus. Results In the open field test， the total distance travelled， time spent in the center zone， and average speed of movement in CRS mice were significantly lower than those in the Control group （P<0.05）， while these parameters were higher in EDB‑treated groups compared to the CRS group （P<0.05）. In the tail suspension and forced swimming tests， the immobility time in CRS mice was significantly longer than that in the Control group （P<0.05）， while it was shorter in EDB‑treated groups compared to the CRS group （P<0.05）. qPCR results showed that compared to the Control group， the expression of GSDMD， IL‑1β， and p62 mRNA increased， while the expression of Beclin1 and LC3Ⅱ mRNA decreased in the CRS group （P<0.05）. Compared to the CRS group， the expression of GSDMD， IL‑1β， and p62 mRNA decreased， while the expression of Beclin1 and LC3Ⅱ mRNA increased in EDB‑treated groups （P<0.05）. Western blot results indicated that compared to the Control group， the expression of p‑AKT， p62， GSDMD， GSDMD‑N， Pro‑IL‑1β， and IL‑1β increased， while the expression of p‑AMPK， Beclin1， LC3B， and BDNF decreased in the CRS group （P<0.05）. Compared to the CRS group， the expression of p‑AKT， p62， GSDMD， GSDMD‑N， Pro‑IL‑1β， and IL‑1β decreased， while the expression of p‑AMPK， Beclin1， LC3B， and BDNF increased in EDB‑treated groups （P<0.05）. Immunofluorescence results showed that the number of NeuN in the CA1， CA3， and DG regions of the hippocampus was significantly lower in the CRS group than in the Control group （P<0.05）， while it was significantly higher in EDB‑treated groups compared to the CRS group （P<0.05）. Conclusion EDB may improve anxiety and depressive behaviors in CRS‑induced mice by regulating autophagy through the AKT/AMPK pathway， inhibiting pyroptosis and inflammatory responses， and reducing neuronal damage.

Graphical abstract

关键词

依达拉奉右莰醇 / 焦虑抑郁 / 慢性约束应激 / 自噬 / 焦亡 / 神经元特异性核蛋白（NeuN）

Key words

Edaravone dexborneol / Anxiety and Depression / Chronic Restraint Stress / Autophagy / Pyroptosis / NeuN

抑郁症是一种复杂的情绪障碍，其特征为持续而广泛的情绪低落和兴趣减退，影响个体的感觉、思维和行为^［1］。尽管目前已有诸多抗抑郁药物，但通常需要长期用药，并且起效慢，副作用严重，只有约三分之一患者从中受益，因此更加深入了解抑郁症的生物学基础^［2］，开发更加快速安全有效的抗抑郁药物具有重要价值。抑郁症的发病机制涉及多条复杂的分子途径，其中包括线粒体功能障碍和炎症过程的失调，这些因素均可能加剧抑郁症的发展。炎症反应可以影响大脑内神经递质的稳态，增强应激反应，进而导致神经元及脑区功能的进一步损害^［3］。传统的抗抑郁药被认为具有抗炎作用，与抑郁症的治疗反应可能部分依赖于其免疫表型^［4］。细胞焦亡又称细胞炎性坏死，一种由Gasdermin D（GSDMD）激活引发的细胞程序性坏死过程，导致细胞不断膨胀直至细胞膜破裂以及细胞内容物的释放，进而激活强烈的炎症反应^［5］。研究表明，抑郁症的特征性表现为神经元结构改变和功能损伤，过度的炎症反应可能导致神经元死亡，激活线粒体自噬能够抑制细胞焦亡和炎症反应，维持神经元的稳态，从而改善抑郁^［6］。因此通过调节细胞自噬以抑制炎症反应，可能是抑郁症治疗的潜在药物靶点之一。

依达拉奉右莰醇（edaravone dexborneol，EDB）是一种新型神经保护剂，具有抗炎、抗氧化、清除自由基的多重作用，根据2024年2月《美国医学会杂志·神经病学》上发表的3期临床研究TASTE‑SL的主要结果，该药物在急性缺血性脑卒中的治疗中显示出良好的安全性与有效性，能够明显改善治疗后神经功能恢复及独立生活能力^［7］。在实验性缺血再灌注动物模型研究中，EDB激活Nrf‑2/HO‑1/GPX4轴抑制铁死亡，保护血脑屏障免受破坏，进而发挥神经保护作用^［8］。此外，在阿尔茨海默病动物模型和细胞培养模型中，EDB能够抑制神经炎症，并减轻TNF‑α诱导的神经元坏死^［9］。这些发现表明EDB在急性脑卒中及神经退行性疾病中的疗效确切，除此之外，最新研究表明EDB能够减轻缺血再灌注大鼠焦虑抑郁行为，增加卒中后大鼠自主活动和探索过程，减少紧张、不安行为^［10］，然而，其在抑郁症中作用及其具体分子机制尚未完全阐明。鉴于EDB的抗炎特性对神经元的保护作用，以及炎症与焦虑抑郁之间的双向关系，EDB在治疗抑郁症方面潜力具有很强的开发价值。因此，假设EDB可能通过促进自噬以抑制焦亡介导的炎症反应，改善神经元的损伤，从而发挥抗焦虑抑郁作用。本研究构建慢性约束性应激（chronic restraint stress，CRS）小鼠抑郁模型，旨在探究EDB的抗焦虑抑郁作用及其潜在分子机制，为EDB在抑郁症中的治疗提供新的见解和方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究采用雄性C57BL/6小鼠（6~8周龄，体重20~22 g），来自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：NO.SCXK（辽）2020‑0001。采用雄性小鼠做实验，以避开雌激素对抑郁症的影响。本研究在SPF动物房中进行，室内环境为20~22 ℃，相对湿度50%~60%，光照暗循环12 h。本研究得到了郑州市中心医院伦理学委员会的许可，伦理审批号：ZXYY2024179。

1.2 主要试剂与抗体

EDB溶液（江苏，先声，国药准字H20200007）；Trizol试剂（美国，Invitrogen，15596018CN），Plus All‑in‑one 1st SrandcDNA Synthesis SuperMix （gDNA Purge）（中国，Novoprotein，E047‑01B），SYBR qPCR SuperMix Plus（中国，Novoprotein，EO96‑01A ）；Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液（上海，EpiZyme，PS105S），转膜缓冲液（上海，EpiZyme，PS109S），TBS/Tween缓冲液（上海，EpiZyme，PS103S），脱脂奶粉（上海，EpiZyme，PS112L）；Triton X‑100（上海，Beyotime，P0096）；兔抗p‑AKT、兔抗p‑AMPK、兔抗p62、兔抗Beclin1、兔抗LC3B、兔抗IL‑1β（美国，Cell Signaling Technology，货号依次为4060、2535、5114、3738、2775、12703），兔抗GSDMD（美国，Abcam，ab219800），兔抗脑源性神经营养因子（BDNF）（美国，Abcam，ab108319），兔抗神经元特异性核蛋白（NeuN）（美国，Abcam，ab177487），HRP标记二抗山羊抗小鼠IgG、HRP标记二抗山羊抗兔IgG（上海，EpiZyme，货号依次为LF101、LF102），Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG（H+L）（上海，Beyotime，货号分别为A0473、A0423）。

1.3 实验动物的分组及抑郁模型的建立

实验前给雄性C57BL/6小鼠称重，随机分为4组，分别为对照（Control）组，慢性约束性应激（CRS）组，依达拉奉右莰醇5 mg/kg ［CRS+EDB（5 mg/kg）］组，依达拉奉右莰醇10 mg/kg［CRS+EDB（10 mg/kg）］组，每组8只。在正式实验前，将小鼠于养殖房适应1周，12 h昼夜循环，自由饮水和摄食。实验开始除对照组外，其余各组小鼠置于50 mL离心管所做的束缚管中，离心管前部提前烫制出气孔，以供小鼠自由呼吸，每天束缚4 h期间各组小鼠均禁食禁水，共持续4周。EDB（5 mg/kg和10 mg/kg）组束缚前半小时给予腹腔注射EDB，对照组和CRS组腹腔注射生理盐水。

1.4 旷场实验

将小鼠放置在一个50 cm×50 cm×40 cm的黑色不透光实验箱内，底部平均分为25个小方格，中间9个方格作为中心区域。ANY‑Maze动物行为分析系统自动记录每只小鼠5 min的运动轨迹，检测数据包括总运动距离、平均运动速度、中心区停留时间等。注意每次实验时应从同一位置将动物放入测试箱中央，每只小鼠测试完毕后要用75%酒精擦拭装置并清理排泄物，再进行下一只测试^［11］。

1.5 悬尾实验

使用胶带将小鼠尾巴（距尾尖约1 cm处）轻轻固定于悬尾架上，确保小鼠头部朝下，与底面保持约30 cm的距离。记录6 min内最后4 min小鼠的不动时间。小鼠的不动时间越长，表明抑郁程度越严重。维持相对恒定的实验室环境，包括光照、温度和湿度等参数^［12］。

1.6 强迫游泳实验

将小鼠轻柔地放置在15 cm×20 cm×30 cm透明的圆柱型水槽中，水温22~24 ℃，防止动物的头部被浸入水下及站立时无法接触到底部，记录6 min内最后4 min小鼠的不动时间。整个实验过程确保实验室的安静，以避免外界因素对实验结果的影响^［12］。

1.7 脑组织样本的制备

行为学测试完成后，对小鼠进行麻醉，部分小鼠经心脏灌注PBS后开颅提取海马组织，液氮快速冷冻，留取qPCR、Western blot样本，-80 ℃保存以备后续应用。剩余小鼠麻醉后使用4%多聚甲醛（PFA）进行心脏灌流并提取脑组织，后续冰冻切片后，进行免疫荧光实验。

1.8 qPCR

使用Trizol试剂提取RNA，随后根据Novoprotein公司说明书步骤，反转录2000 ng RNA，总体积20 μL。随后取引物上下游共1 μL（2 μmol/L），cDNA模板4 μL（10 ng/μL），2×SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL进行定量PCR，以GAPDH作为内参基因进行统一化对照，记录各基因的CT值，随后采用2^-ΔΔCT的计算方法统计数据。实验中所采用的qPCR引物见表1。

1.9 Western blot

将小鼠海马组织加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液中，提取蛋白，BCA法测蛋白浓度；电泳：浓缩胶90 V 15 min，分离胶120 V 60 min，根据蛋白分子量大小调整时间；转膜：由下层至上层为黑色泡沫，滤纸，胶块，PVDF膜，滤纸，黑色泡沫，220 mA，70 min，根据蛋白分子量的大小调整时间；封闭：5%脱脂奶粉（1×TBST配置）封闭，室温1~2 h；一抗：4 ℃ 12~16 h；洗膜：1×TBST洗3次，10 min/次，摇床室温；二抗：室温孵育60 min；洗膜：1×TBST洗3次，10 min/次，摇床室温；显色：ECL显色法显色，保存图片，分析整理数据。

1.10 免疫荧光染色

取先前样本采集的脑组织的冰冻切片（10 mm），PBS洗3次，0.3%triton X‑100破膜；10%驴血清封闭1~2 h；用抗体稀释液稀释一抗4 ℃孵育过夜；PBS洗一抗3遍/5 min；PBS配制二抗，将样品与Alexa Fluor荧光标记的二抗在室温下避光孵育1 h；然后用Hoechst进行细胞核染色15 min，抗淬灭封片剂封片；使用共聚焦显微镜获取并采集图像，进行数据分析。

1.11 统计学处理

统计分析和图表制作用SPSS 25.0、GraphPad Prism 9.0软件。计量数据用\overline{x}\pm s表示，多组之间的比较用单因素方差分析（AVONA），方差齐时两组相比采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhane检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EDB改善CRS诱导的小鼠焦虑抑郁样行为

在旷场实验中，4周造模结束后CRS组相比Control组运动能力明显减弱，运动总距离、中心区停留时间和平均运动速度明显减少，不动时间明显增加（P<0.05）；EDB给药各组相比CORT组运动总距离、中心区停留时间、平均运动速度均明显提高，不动时间明显减少（P<0.05）。在悬尾实验和强迫游泳实验中，CRS组相比Control组小鼠不动时间明显延长（P<0.05）；EDB给药各组相比CRS组小鼠不动时间均明显降低（P<0.05），这些现象和数据表明EDB可以改善小鼠焦虑抑郁行为。见表2、3。

2.2 EDB对自噬和焦亡相关mRNA表达的影响

qPCR结果显示，相比于Control组，CRS组小鼠海马GSDMD、IL‑1β、p62 mRNA表达升高，Beclin1、LC3Ⅱ mRNA表达降低（P<0.05）；相比于CRS组，CRS+EDB（5 mg/kg）组GSDMD、p62 mRNA差异无统计学意义（P>0.05），IL‑1β mRNA表达降低，LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表达升高（P<0.05），CRS+EDB（10 mg/kg）组GSDMD、IL‑1β、p62 mRNA表达降低，Beclin1、LC3Ⅱ mRNA表达升高（P<0.05）。见表4。

2.3 EDB对CRS诱导的小鼠海马自噬相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，相比于Control组，CRS组小鼠海马p‑AKT、p62蛋白表达升高，p‑AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ表达降低（P<0.05）；相比于CRS组，CRS+EDB（5 mg/kg）组p‑AKT差异无统计学意义（P>0.05），p62表达降低，p‑AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ表达升高（P<0.05），CRS+EDB（10 mg/kg）组p‑AKT、p62表达降低，p‑AMPK、Beclin1、LC3Ⅱ表达升高（P<0.05）。见图1。

2.4 EDB对CRS诱导的小鼠海马焦亡相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，相比于Control组，CRS组小鼠海马GSDMD、GSDMD‑N、Pro‑IL‑1β、IL‑1β表达升高（P<0.05）；相比于CRS组，CRS+EDB（5 mg/kg）组GSDMD差异无统计学意义（P>0.05），GSDMD‑N、Pro‑IL‑1β、IL‑1β表达降低（P<0.05），CRS+EDB（10 mg/kg）组GSDMD、GSDMD‑N、Pro‑IL‑1β、IL‑1β表达降低（P<0.05）。见图2。

2.5 EDB对CRS诱导的小鼠海马BDNF、NeuN的影响

Western blot结果显示，相比于Control组，CRS组小鼠海马BDNF表达降低（P<0.05）；相比于CRS组，EDB给药各组BDNF表达升高（P<0.05）。免疫荧光结果显示，相比于Control组，CRS组小鼠海马CA1、CA3、DG区NeuN阳性细胞数量减少（P<0.05）；相比于CRS组，EDB给药各组海马CA1、CA3、DG区NeuN阳性细胞数量增加（P<0.05）。见图3。

3 讨论

抑郁症是目前最普遍的精神障碍之一，不仅对患者本人的生活质量、社会功能和身体健康造成严重影响，还给家庭、社会和经济带来沉重的负担^［13］。其病理机制涉及生物化学、遗传学、神经再生、环境因素、炎症反应以及心理学等多个领域，这些因素相互作用，共同影响抑郁症的发生和发展^［14］。因此建立一种表型稳定、操作简便的抑郁症动物模型对于揭示其发病机制及开发抗抑郁药物至关重要。CRS诱导C57BL/6小鼠焦虑抑郁样行为，已被多篇研究证实为一种可靠且广泛应用的动物抑郁模型^{［15，16］}。研究表明，CRS处理的小鼠在旷场实验、强迫游泳实验、悬尾实验中自发活动明显减少，不动时间明显增加^{［17，18］}。与文献中研究结果一致，本研究通过对小鼠连续4周约束应激处理，并通过行为学检测发现CRS组小鼠旷场实验中运动总距离、平均运动速度、中心区停留时间均明显降低，不动时间明显延长，以及悬尾试验和强迫游泳实验中不动时间明显增加；而EDB给药各组在上述行为学实验中表现出运动总距离、平均运动速度、中心区停留时间均明显升高，且不动时间明显减少，从而证实了EDB的抗焦虑抑郁作用。然而，本研究仅验证了CRS诱导的小鼠抑郁模型，后续将采用更多抑郁模型来验证结论的普适性。

自噬是一种通过溶酶体机制分解细胞自身结构的过程，对于维持细胞内稳态、应对营养缺乏、清除受损细胞器和异常蛋白等具有重要作用^［19］。自噬受AKT/AMPK信号通路调控，该通路在能量感应和细胞应激反应中发挥核心作用，通过直接磷酸化ULK1来调节自噬^［20］。Beclin1是自噬过程中的关键蛋白，参与多种细胞器的运输途径，包括内吞作用，对神经元的存活至关重要^［21］。LC3是自噬过程的标志物，参与自噬小体的形成。在内质网膜包裹蛋白质或某些细胞器形成自噬体时，LC3‑Ⅰ转变为LC3‑Ⅱ，促使自噬体与溶酶体融合，完成自噬体内物质的降解^［22］。近期研究表明，自噬在情绪障碍如抑郁症中也发挥着关键作用，速效抗抑郁剂如氯胺酮已被证明能够诱导大脑中的自噬，抑制炎症，减少氧化应激，从而实现神经保护^［23］。Beclin1、LC3‑Ⅱ的高表达能够改善LPS诱导的小鼠抑郁行为，而使用自噬抑制剂3‑MA处理导致Beclin1、LC3‑Ⅱ的表达下调，自噬功能障碍，进而加重小鼠抑郁行为^［24］。与文献报道一致，本研究中CRS组小鼠Beclin1、LC3‑Ⅱ mRNA和蛋白表达降低，自噬受到抑制；EDB给药各组Beclin1、LC3‑Ⅱ mRNA和蛋白表达升高，自噬增强。此外，CRS组小鼠p62、p‑AKT表达升高，p‑AMPK表达降低，而EDB给药组逆转了这种现象，表明EDB可能通过AKT/AMPK信号通路激活自噬，从而改善CRS诱导的小鼠焦虑抑郁行为。

细胞焦亡是由GSDMD家族蛋白裂解，释放N端，在细胞膜上产生孔洞，导致炎症产物IL‑1β释放而引发强烈的炎症反应^［25］。研究表明，GSDMD介导的焦亡在抑郁症的病理损伤中起着关键作用，GSDMD基因敲除能够改善慢性不可预知刺激诱导的小鼠焦虑抑郁行为，并降低焦亡相关蛋白表达，相反GSDMD‑N过表达则加重了GSDMD基因敲除小鼠的抑郁样行为^［26］。此外，通过激活线粒体自噬以抑制小胶质细胞焦亡，下调GSDMD‑N、IL‑1β的表达，减轻神经毒性反应，并改善小鼠抑郁样行为^［27］。与现有研究一致，本研究中CRS组小鼠GSDMD、IL‑1β mRNA和GSDMD、GSDMD‑N、Pro‑IL‑1β、IL‑1β蛋白表达升高，焦亡及炎症反应增强；EDB给药各组GSDMD、IL‑1β mRNA和GSDMD、GSDMD‑N、Pro‑IL‑1β、IL‑1β蛋白表达降低，焦亡及炎症反应减轻，并且呈剂量依赖性。证实EDB对CRS小鼠的抗焦亡及抗炎作用。

海马体是与学习、记忆和情绪调节密切相关的脑区。海马齿状回（DG）神经干细胞可持续产生新生神经元，这些神经元经历多个发育阶段。动物研究表明，慢性应激会损伤海马神经发生，而促进海马神经发生则可改善慢性应激诱导的抑郁行为^［28］。在抑郁症患者中，海马体积减小，这一现象与神经元的萎缩和死亡密切相关，研究发现，抑郁症患者海马体中的神经元数量减少，树突棘密度降低^［29］。此外，传统抗抑郁药氟西汀增加了新生神经元的数量和活动，从而缓解慢性不可预知性应激诱导的小鼠焦虑抑郁行为^［30］。BDNF在谷氨酸能和GABA能突触的生长、发育和可塑性中发挥重要作用，并通过调节神经元分化影响5‑HT和DA神经传递^［31］。BDNF水平的变化与抑郁症状相关，研究表明，抑郁症患者大脑中BDNF的表达水平明显降低，特别是在前额叶皮层和海马区域^［32］。有效的抗抑郁治疗可增加海马中BDNF的表达^［33］。与现有研究一致，本研究中CRS组小鼠海马BDNF蛋白表达降低，DG区NeuN标记神经元数量减少，并且在海马CA1、CA3区同样观察到NeuN标记神经元数量减少；而EDB给药各组海马BDNF的表达升高，以及CA1、CA3和DG区NeuN阳性细胞数量增加，并呈现剂量依赖性。表明EDB通过调节CRS小鼠海马BDNF、NeuN的表达，减轻神经元的损伤和死亡，从而改善小鼠的焦虑抑郁行为。

综上所述，EDB能够改善CRS诱导的小鼠焦虑抑郁行为，其分子机制可能与通过AKT/AMPK通路调控细胞自噬，抑制焦亡及炎症反应，改善BDNF的表达及神经元的损伤和死亡相关。

作者贡献度说明：

李文沛：实验设计、实验操作、数据整理、论文撰写与修改；胡琼琼、徐志强：技术指导、经费支持；李毅娣、付娟：统计分析；杨改清：项目管理、经费支持、论文审核。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

河南省自然科学基金青年科学基金项目(242300421515)

河南省高等学校重点科研项目(24A320029)

河南省医学科技公关计划省部共建项目(SB201903033)

河南省科技攻关项目(192102310082)