IFITM3对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞功能影响的研究

Study on the effect of IFITM3 on synovial fibroblast function in rheumatoid arthritis

摘要

目的 初步探讨IFITM3对类风湿关节炎（RA）滑膜成纤维细胞功能的影响。 方法 构建RA‑FLSs体外细胞模型，通过Western blot检测RA‑FLSs中IFITM3的蛋白表达差异；将实验分为Control组、脂多糖（LPS）组、LPS+siNC组、LPS+siIFITM3组、LPS+siIFITM3+C16‑PAF组。采用Transwell试验和划痕试验分别观察RA‑FLSs侵袭和迁移能力的变化；ELISA检测TNF‑α、IL‑1、IL‑6水平；流式细胞术检测RA‑FLSs凋亡情况；CCK8检测细胞增殖能力；用实时荧光定量PCR检测IFITM3、Bax、Bcl‑2 mRNA的表达；Western blot检测IFITM3、MEK、ERK、p‑ERK1/2、MMP9、Bax、Bcl‑2在蛋白水平的表达；在LPS+siIFITM3组，使用C16‑PAF激活MER/ERK信号通路，用CCK8检测细胞增殖能力。 结果 在本研究中，LPS处理的RA‑FLSs中IFITM3表达水平升高（P<0.05）。与LPS+siNC组比较，LPS+siIFITM3组RA‑FLSs细胞迁移能力、侵袭能力降低，炎症因子IL‑1、IL‑6表达降低，细胞凋亡率增加（P<0.05），同时细胞增殖活性降低；细胞中Bax表达增多，Bcl‑2、p‑ERK、MMP9蛋白表达减少（P<0.05）。与LPS+siIFITM3组比较，LPS+si‑IFITM3+C16‑PAF组RA‑FLSs增殖活性升高（P<0.05）。 结论 下调IFITM3可抑制RA‑FLSs迁移侵袭能力和炎症因子IL‑1、IL‑6的表达，抑制增殖、促进凋亡；其调控增殖机制可能与MEK/ERK信号激活水平有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of IFITM3 on the function of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis. Methods In vitro cell models of RA‑FLSs were constructed， and the protein expression differences of IFITM3 in RA‑FLSs were detected by Western blot. The experiments were divided into the Control group， the LPS group， the LPS+siNC group， the LPS+siIFITM3 group， and the LPS+siIFITM3+C16‑PAF group. Transwell test and scratch test were used to observe the changes in the invasion and migration ability of RA‑FLSs， respectively. The levels of TNF‑α， IL‑1 and IL‑6 were detected by ELISA. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of RA‑FLSs. CCK8 was used to detect cell proliferation. The mRNA expressions of IFITM3， Bax and Bcl‑2 were detected by real‑time PCR. Western blot was used to detect the protein expressions of IFITM3， MEK， ERK， p‑ERK1/2， MMP9， Bax and Bcl‑2. In the IFITM3 siRNA panel， the MER/ERK signaling pathway was activated with C16‑PAF， and cell proliferation was detected with CCK8. Results In this study， the expression level of IFITM3 in LPS‑treated RA‑FLSs was increased （P <0.05）. Compared to the LPS group and the LPS+siNC group， the migration ability and invasion ability of RA‑FLSs cells in the LPS+siIFITM3 group decreased， the apoptosis rate increased， the expression of inflammatory cytokines IL‑1， IL‑6 decreased， and the cell proliferation activity decreased （P<0.05）. The expression of Bax increased and the expression of Bcl‑2， p‑ERK and MMP9 decreased （P<0.05）. Compared to the LPS+siIFITM3 group， the proliferative activity of RA‑FLSs in the LPS+si‑IFITM3+C16‑PAF group was increased （P<0.05）. Conclusion Down‑regulation of IFITM3 can inhibit the migration and invasion ability of RA‑FLSs， the expression of inflammatory cytokines IL‑1 and IL‑6， inhibit proliferation and promote apoptosis. The mechanism of regulation of proliferation may be related to the level of MEK/ERK signal activation.

Graphical abstract

关键词

类风湿关节炎（RA） / 滑膜成纤维细胞 / 脂多糖（LPS） / 增殖

Key words

Rheumatoid arthritis / Synovial fibroblasts / LPS / Proliferation

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）是一种常见的慢性全身性自身免疫性疾病，以滑膜炎为特征，导致关节软骨和骨的破坏^［1］。在RA中，关节边界的滑膜衬里层变成大量的“滑膜”组织，富含成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast‑like synoviocytes，FLS）。研究表明RA‑FLSs表现出肿瘤样特性，通过调控凋亡相关蛋白Bcl‑2、Bax的水平，抑制细胞其凋亡；通过调节MEK/ERK信号通路促进细胞增殖。同时它们还分泌大量的促炎细胞因子TNF‑α、IL‑1、IL‑6，引起局部和全身炎症。更重要的是，RA‑FLSs能够增加基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）的产生，如MMP2、MMP9等，并直接侵入邻近的关节软骨^［2］。因此，靶向RA‑FLSs代表了RA治疗的潜在策略。目前RA的治疗已经进入生物靶向治疗的时代，疗效明显提高，但仍然有部分RA患者病情不能长期有效控制，考虑与其发病机制的多样性及不确定性有关，亟待挖掘具有治疗价值的候选靶点。干扰素诱导跨膜蛋白3是属于IFITM基因家族中非常重要的一员，在调节细胞分化、凋亡、免疫细胞调节等方面发挥重要作用，可以被Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导^［3］。近年来，发现IFITM3蛋白在原发性干燥综合征、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中的表达上调^［4，5］。Park等^［6］研究发现IFITM3基因多态性可能与RA的易感性有关，表明IFITM3可能是RA发病机制相关的候选基因。

课题组在预实验中发现IFITM3蛋白在RA中高表达，提示IFITM3可能参与RA的发生和发展过程。本研究RA‑FLSs为研究对象，通过体外实验观察沉默IFITM3后对RA‑FLSs的侵袭、迁移、凋亡、增殖、炎症因子TNF‑α、IL‑1、IL‑6表达的影响，为IFITM3在RA中的作用及机制进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HFLS‑RA（深圳华拓生物），胰蛋白酶（武汉普诺赛），胎牛血清和DMEM培养基（VivaCell），细胞冻存液（武汉普诺赛），RNA提取试剂盒（湖南艾科瑞），逆转录试剂（日本TaKaRa），qRT⁃PCR试剂（武汉塞维尔），si‑NC、si‑IFITM3（上海吉玛基因），引物序列（上海生工生物），IFITM3抗体（武汉三鹰），Bcl‑2、Bax、MEK1/2、山羊抗兔IgG二级抗体（华安），ERK1/2、MMP9（万类生物），p‑ERK（北京义翘神州），基质胶（美国康宁），CCK8试剂盒（碧云天），C16‑PAF（MCE公司），细胞凋亡试剂盒（杭州联科）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞模型

采用LPS（1 μg/mL）刺激RA‑FLSs^［7‑9］，本研究中发现在LPS处理24 h时FLSs的IFITM3表达增加，故采用LPS（1 μg/mL）24 h条件诱导FLSs。

1.2.2 细胞转染与分组

将实验分为正常组（Control组，未LPS处理，未转染细胞，常规培养）、LPS组（LPS处理，未转染细胞）、LPS+siNC组（空载体siRNA转染组后，加入LPS处理）、LPS+siIFITM3组（转染siIFITM3后，加入LPS处理）、LPS+siIFITM3+C16⁃PAF组（转染siIFITM3后，加入LPS和MER/ERK信号通路激活剂C16⁃PAF处理）；转染：设计合成siIFITM3正义5'‑CACUGUC CAAACCUUCUUCTT‑3'和反义5'‐GAAGAAGG UUUGGACAGUGTT‐3'，siNC正义5'‐UUCUCC GAACGUGUCACGUTT‑3'和反义5'‐ACGUGAC ACGUUCGGAGAATT‑3'；将细胞以2×10⁵~3×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，根据说明书将合成的siRNA用转染试剂（GP‐transfect‑Mate）转染到目标细胞中。验证：在转染24 h和48 h，收集细胞样品，分别通过qRT‑PCR、Western blot检测IFITM3的表达水平。

1.2.3 检测细胞迁移和侵袭情况

迁移实验：在超净工作台上，用记号笔在六孔板背面均匀划线；用10 μL枪尖垂直于记号笔标记的直线在孔板内划痕，用PBS清洗，在0 、24 h时进行显微镜下观察采图，后使用ImageJ软件对愈合面积进行统计；侵袭实验：将1∶8比例Matrigel基质胶与无血清DMEM培养基混合，包被小室过夜；用基础培养基稀释细胞密度为2×10⁵个/mL；Transwell小室上室中加入200 μL细胞悬液，下室内加入600 μL 15%FBS的DMEM完全培养基，在37 ℃培养箱中培养24 h；进行固定染色，观察拍照，每个样本随机计数10个视野，将平均值统计分析。

1.2.4 ELISA检测TNF‑α、IL‑1、IL‑6

按照实验分组处理细胞，将处理后的细胞从培养箱中取出，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况

按照实验分组处理细胞，收集细胞，每管加入150 μL Binding Buffer重悬细胞；加入5 μL AnnexinV‑FITC染液和PI染液，充分混匀，避光孵育20 min；打开流式细胞仪，参数调定后进行检测。

1.2.6 CCK8检测RA‑FLSs增殖活性

按照实验分组处理细胞，配制为5×10⁵个/mL细胞悬液；每孔吸取100 μL细胞悬液加入96孔板；放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，分别每孔加入含10 μL CCK8试剂，于培养箱避光孵育2 h；酶标仪测量450 nm波长的吸光度值。

计算RA‑FLSs细胞增殖率=［（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）］×100%。

1.2.7 Western Blot检测

按照实验分组处理细胞，将处理后的细胞从培养箱中取出；加入含1%PMSF的预冷RIPA裂解液，4 ℃裂解30 min；收集细胞裂解液，12 000 r/min离心15 min，收集上清；BCA法测定蛋白浓度；按样品与上样缓冲液=4∶1的比例加入上样缓冲液，100 ℃ 10 min使蛋白充分变性；SDS‑PAGE凝胶电泳分离蛋白；进行转膜，封闭；一抗4 ℃条件下过夜；孵育二抗1 h；进行曝光显影；ImageJ软件进行灰度值分析。

1.2.8 qRT‑PCR检测

按照实验分组处理细胞，将处理后的细胞从培养箱中取出；按照RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，测RNA浓度；按试剂盒逆转录及PCR扩增，利用2^-ΔΔCT计算各组基因的相对表达量；结果使用SPSS软件分析。相关引物序列如下：GAPDH：上游（5'‑3'）：CAGGAGGCATTGCT GATGAT，下游（5'‑3'）：GAAGGCTGGGGCTCA TTT；IFITM3：上游（5'‑3'）：ACTGTCCAAACCT TCTTCTCTCC，下游（5'‑3'）：TCGCCAACCATC TTCCTGTC；Bcl‑2：上游（5'‑3'）：GGTGGGGTC ATGTGTGTGG，下游（5'‑3'）：CGGTTCAGGTA CTCAGTCATCC；Bax：上游（5'‑3'）：CCCGAGA GGTCTTTTTCCGAG，下游（5'‑3'）：CCAGCCC ATGATGGTTCTGAT。

1.3 统计学处理

采用Graph Pad Prism8.0软件分析数据，数据按照\overline{x}\pm s表示，两组间比较采用t检验，多组差异比较采用单因素方差，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 在不同LPS刺激时间下，RA‑FLSs的IFITM3表达情况

在LPS（1 μg/mL）刺激下，FLSs的IFITM3表达增加；尤其在LPS刺激24 h时，其表达量最大，差异具有统计学意义（P<0.05）。因此，后续实验采用1 μg/mL LPS刺激24 h（图1）。

2.2 转染后IFITM3的mRNA及蛋白水平表达的验证

与LPS+siNC组比较，LPS+siIFITM3组的IFITM3蛋白和mRNA（P<0.005）的相对表达量明显降低；同时LPS组和LPS+siNC组的IFITM3 mRNA和蛋白的相对表达量无明显差异（P>0.05），排除转染试剂等因素的影响。将该序列用于后续实验（图2）。

2.3 IFITM3对FLSs的迁移、侵袭影响

为了评估在LPS刺激下IFITM3对FLSs的迁移、侵袭影响，采用Transwell侵袭实验和伤口愈合实验对其进行测定。与Control相比，LPS组的FLSs的侵袭能力和迁移能力增加；相比于LPS+siNC组，LPS+siIFITM3的侵袭和迁移能力下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图3。表明IFITM3促进FLSs迁移、侵袭能力。

2.4 IFITM3对FLSs的炎症因子IL‑1、IL‑6、TNF‑α的影响

采用ELISA法测定各组细胞上清的IL‑1、IL‑6、TNF‑α表达情况，LPS刺激炎症因子IL‑1、IL‑6表达，差异具有统计学意义（P<0.05）。与LPS+siNC相比较，LPS+siIFITM3组的RA‑FLSs细胞炎症因子IL‑1、IL‑6产生减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图4。

2.5 IFITM3对FLSs的凋亡影响

与LPS+siNC组比较，LPS+siIFITM3组的RA‑FLSs细胞中细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义（P<0.001）。见图5A。细胞中Bax表达增多，Bcl‑2表达减少（P<0.05），提示IFITM3沉默诱导细胞凋亡。见图5B、C。

2.6 IFITM3对FLSs的增殖影响

在LPS刺激下RA‑FLSs的增殖能力增强（P<0.01）；转染后的LPS+siIFITM3组细胞增殖率与LPS+siNC组比较降低（P<0.001），差异具有统计学意义。本实验结果提示IFITM3对RA‑FLSs 的增殖存在促进作用。见图6。

2.7 IFITM3对RA‑FLS中MEK/ERK信号通路的作用

在RA中，有丝分裂的促分裂原活化蛋白激酶家族成员p38、ERK、JNK在RA滑膜组织中被活化，其中ERK1/2可对细胞外的有丝分裂原信号和生长因子发生效应，激活ERK1/2能阻止细胞死亡，促进细胞增殖。

Western blot结果显示，LPS刺激下的FLSs中p‑ERK1/2表达增加（P<0.01）。当沉默IFITM3时，FLSs中p‑ERK1/2表达降低（P<0.05）。提示IFITM3可能促进RA‑FLS中MEK/ERK信号通路激活水平。MMP9的表达降低。见图7A。

与LPS+siIFITM3组比较，LPS+siIFITM3+C16‑PAF组的RA‑FLSs增殖活性升高（P<0.01）。提示激活MEK/ERK信号通路逆转siIFITM3对RA‑FLS增殖作用。见图7B。

3 讨论

RA在全球成人人群中的发病率为0.5%~1.0%，主要表现为是滑膜过度增生、炎性单核细胞浸润和进行性骨软骨变性^［10］。FLSs作为滑膜组织中的主要细胞群，在RA患者免疫反应的发生和疾病进展中发挥着关键作用。大量证据表明，RA患者的FLSs具有类肿瘤细胞样的生长特性，包括迁移和侵袭能力增强、抗细胞凋亡以及快速增殖。FLSs的过度增殖增加了关节软骨分泌大量促炎细胞因子的能力，导致RA进展加剧。干扰素（Interferon， IFN），是机体自身免疫机制的产物。当病原体进入机体后，作为干扰素刺激的应答结果，干扰素刺激基因（IFN‑stimulated genes，ISGs）通过JAK‑STAT信号转导通路被表达，IFITM3就是这一类ISGs，在健康组织中普遍表达^［11］。因为IFN是炎症过程的中心介质，IFITM3在RA中的过表达是很有可能的。课题组前期发现IFITM3在RA中高表达，但关于对RA影响尚不明确。因此，本研究旨在揭示IFITM3对RA‑FLSs的侵袭、迁移、凋亡、炎症反应、增殖的影响并初步探讨影响增殖能力的分子机制。本研究结果证实了沉默IFITM3限制LPS诱导的RA‑FLSs的炎症反应，促进细胞凋亡，抑制细胞迁移侵袭、增殖能力，此外IFITM3对FLSs增殖影响可能与MEK/ERK信号通路有关。

在RA中，滑膜炎的持续发展与细胞因子水平的不平衡关系密切，主要表现为抗炎细胞因子产生不足和促炎细胞因子产生增加。这些促炎因子造成炎症免疫反应、滑膜细胞增殖及蛋白质水解，是能够引起关节炎症性反应和免疫应答的主要原因。尤其是促炎因子IL‑1β、IL‑6、TNF‑α在参与RA整个的病理过程中尤为关键^{［12，13］}。IL‑1β由炎性小体激活，参与炎症、免疫反应等多种生物学过程，还可以促进T细胞增生。IL‑6在RA疾病中高度表达，可以调节免疫反应、促进破骨细胞等作用，是调节性T细胞与Th17细胞之间平衡的主要调节因子^［14］。TNF‑α在与细胞表面Toll受体结合后，激活NF‑κB分子信号转导通路以及相关转录因子，引起炎症相关基因的表达^［15］。已有研究显示TNF‑α作用JNK/MAPK等信号通路，最终导致RA的炎症反应和病理损害^{［15，16］}。IL‑1β、IL‑6、TNF‑α等可使T细胞、B细胞等聚集在病变关节内，诱导滑膜细胞增殖，并且刺激滑膜细胞产生更多促炎因子，放大滑膜炎症反应。同时细胞因子的表达不平衡会刺激滑膜和软骨细胞产生黏附分子和MMPs，MMPs可以直接降解软骨和骨质以及促进血管翳对软骨的侵袭从而对关节造成损伤^［10］。在体外暴露于促炎细胞因子（TNF‑α和IFN‑γ）可以诱导细胞中的IFITM3表达，并与Casp1的表达有良好的相关性，提示IFITM3可能参与了细胞的炎症小体激活反应^［17］。有研究显示IFITM3可能通过调控JAK2/STAT3诱导炎性因子分泌^［18］。猜测IFITM3可能调控RA‑FLSs的炎症因子表达。本研究证实了IFITM3控制炎症因子IL‑1、IL‑6的产生，即LPS诱导FLSs细胞炎症，IFITM3沉默抑制这些炎症因子并减轻炎症。

关于IFITM3功能的报道主要集中在IFITM3对肿瘤细胞的促进作用上。如在肝癌HCC细胞和口腔鳞状细胞癌中，IFITM3促进细胞增殖，抑制细胞凋亡等^{［19，20］}。阻断IFTIM3还可以减少许多癌细胞系的迁移侵袭，相反，短暂的IFITM3过表达增强MMP9的表达和活性从而增加了肿瘤细胞的迁移和侵袭，研究表明IFITM3可通过MAPK信号通路调控MMP9促进肝癌细胞的侵袭^［21］。Min等^［22］发现IFITM3通过ERK1/2信号通路上调c‑myc表达促进肝癌细胞增殖。而IFITM3的下调降低了CCND1和CDK4的表达，抑制了口腔鳞状细胞癌细胞的增殖^［20］。RA的突出特征是滑膜组织增生，其中FLS的活跃生长起着关键作用。与此同时，活化的FLSs产生介导软骨分解代谢的细胞因子和MMPs，对刺激信号诱导的凋亡具有抗性；因此，抑制FLS细胞的活化和增殖对控制RA的发生和发展具有重要意义。LPS刺激FLSs也可提高增殖、迁移侵袭能力以及抗凋亡作用。本研究对滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的分析结果表明，发现下调IFITM3抑制了LPS诱导的FLSs增殖增加，加速了细胞的凋亡。同时下调IFITM3后，其迁移侵袭能力也下降。关于IFITM3对FLSs功能影响的具体机制作用，需要在进一步的研究中进行更详细的验证。在本研究中，IFITM3对FLS细胞的作用与正常细胞作用相反，而与肿瘤细胞的作用结果是一致的。笔者推测IFIM3功能的差异可能与不同的细胞类型和个体差异有关。尤其在本研究中，考虑到由于缺乏凋亡而激活的FLS细胞参与了关节炎症和关节破坏，使用LPS模拟关节损伤状态后，FLS细胞作为RA的最终效应细胞，本研究结果很好地反映了沉默IFITM3可以减轻随后的炎症反应，下调IFITM3可能会削弱FLS细胞的异常活化，从而抑制RA诱导的损伤。

此外，由于MEK/ERK信号参与细胞增殖的调控，本研究对下调IFITM3处理进行了评价。滑膜成纤维细胞增殖减少通常伴随着MEK/ERK信号的抑制。目前研究表明，在RA中该信号通路可被激活，而激活p‑ERK由胞质入核后通过调节 ATF、NF‑κB、c‑Fos、c‑myc等转录因子。其中，NF‑κB所在的NF‑κB信号通路激活多种炎症细胞因子，如TNF‑α、IL‑1β、IL‑2、IL‑6等，TNF‑α、IL‑1β诱导ERK1/2的磷酸化，又进一步激活NF‑κB及其所在通路，由此形成了闭环通路，使局部组织中的炎症反应不断放大，造成炎症因子、炎症细胞的大量积累，通过作用于滑膜细胞，导致滑膜增生^［23］。本研究发现下调IFITM3可以抑制LPS诱导的FLSs增殖能力的增加，促进细胞凋亡，减少炎症因子的产生，这与抑制MEK/ERK信号一致。本研究通过使用MEK/ERK信号通路激活剂（C16‑PAF），发现C16‑PAF能逆转IFITM3下调后对FLSs的增殖作用。因此，对MEK/ERK信号的调控可能是IFITM3在LPS诱导的FLS细胞中增殖作用的机制之一。

综上所述，下调IFITM3具有抑制炎症因子和抑制类风湿的作用，这与FLS细胞活化有关，其增殖可能与调节MEK/ERK信号通路有关。本研究为IFITM3治疗RA的潜力提供了基础信息，但在进一步应用前需明确其在RA中的作用机制。

作者贡献度说明：

赵芳：设计实验并操作，数据分析，撰写论文；刘俊：设计实验；李星一，黄颖：论文修改；申婷婷，张云云：数据整理和分析；李龙：提供实验思路，监督管理。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82460321)