基于周期阻滞和氧化‑抗氧化失衡研究槟榔碱致小鼠骨髓细胞DNA损伤的机制

Mechanism of DNA damage in mouse bone marrow cells induced by arecoline based on cycle arrest and oxidation antioxidant imbalance

摘要

目的 研究槟榔碱（arecoline，ARC）体内对小鼠骨髓细胞DNA的损伤作用，并探讨其作用机制。 方法 采用单细胞凝胶电泳实验分析ARC对小鼠骨髓细胞DNA损伤作用。采用流式细胞术、DCFH‑DA荧光染色、罗丹明123染色等方法对小鼠骨髓细胞的细胞周期，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondial dehyde，MDA）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量，线粒体膜电位（Δψm），p53蛋白含量进行分析。 结果 给予ARC1/2 LD₅₀剂量可引起小鼠骨髓细胞DNA损伤，与空白组相比拖尾现象较严重。随着ARC给药剂量的增加，G₀/G₁期的细胞比例明显增加（P<0.01），使骨髓细胞周期停滞在G₀/G₁期。ARC作用小鼠骨髓细胞后，SOD活性和GSH含量明显降低（P<0.01），MDA和ROS含量明显升高（P<0.01），并且随着ARC浓度增加，Δψm明显降低（P<0.01）。ARC给药组骨髓细胞内p53蛋白含量随给药剂量的增加而明显升高（P<0.01），呈一定的剂量依赖关系。 结论 ARC能造成小鼠骨髓细胞DNA损伤，可增加p53蛋白表达诱导小鼠骨髓细胞周期阻滞在G₀/G₁期，引起Δψm降低，ROS增加，脂质过氧化增强，抗氧化功能受到严重损害，氧化和抗氧化失衡，这些是ARC引起小鼠骨髓细胞DNA损伤的机制。

Abstract

Objective To study the DNA damage effect of arecoline （ARC） on mouse bone marrow cells in vivo， and to explore its mechanism. Methods Single cell gel electrophoresis was used to analyze the DNA damage effect of ARC on mouse bone marrow cells. Flow cytometry， DCFH‑DA fluorescence staining， and Rhodamine 123 staining were used to analyze the cell cycle， superoxide dismutase（SOD） activity，glutathione（GSH），malondial dehyde（MDA），and reactive oxygen species（ROS） content， mitochondrial transmembrane potential （Δψm） and p53 protein content of mouse bone marrow cells. Results ARC， at a dose of 1/2 LD₅₀， could induce DNA damage in mouse bone marrow cells. The difference was significant compared to the negative control group. Cell cycle changed observably in a dose‑dependent manner when exposed to ARC. The percentage of cells in G₀/G₁ phase was significantly increased （P<0.01）， and ARC caused G₀/G₁ phases′ cell cycle arrest in mouse bone marrow cells. After the administration of ARC， SOD activity and GSH content were significantly decreased （P<0.01）， MDA and ROS contents were significantly increased （P<0.01）. Furthermore， the Δψm was significantly reduced with increasing dose（P<0.01）. The protein levels of p53 in mouse bone marrow cells was increased in a dose‑dependent manner after ARC treatment （P<0.01）. Conclusion ARC can cause DNA damage of mouse bone marrow cells， increase the expression of p53 protein causing cell cycle arrest in the G₀/G₁ phase， decrease Δψm， increase ROS in mouse bone marrow cells， enhance lipid peroxidation， severely damage cellular antioxidant function，and lead to the imbalance of oxidation and antioxidation. These are the mechanisms of DNA damage in mouse bone marrow cells caused by ARC.

Graphical abstract

关键词

槟榔碱 / 骨髓细胞 / DNA损伤 / G₀/G₁期阻滞 / 氧化‑抗氧化失衡

Key words

Arecoline / Bone marrow cell / DNA damage / G₀/G₁ phase arrest / Imbalance of oxidation‑antioxidation

槟榔碱（arecoline，ARC）化学名为N‑甲基‑1，2，5，6‑四氢烟酸甲酯^［1］，是一种M、N受体激动剂，对中枢神经系统有拟胆碱作用，也可作为合成其它M受体激动剂的原料^［2］。ARC有乙酰胆碱类似机制，可以透过血脑屏障，刺激副交感神经使中枢抑制。一定量的ARC可以补充乙酰胆碱的不足，促使机体兴奋，从而产生抗疲劳和抗抑郁的作用^［3，4］。国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）在《柳叶刀‑肿瘤学》发表了对槟榔主要活性成分——ARC致癌性的主要评估结论，基于有力的机制研究证据，ARC被定为2B类致癌物——可能对人类致癌（动物试验证据或对人类致癌证据有限）^［5，6］。据研究，ARC经口给药和腹腔注射能诱发小鼠骨髓细胞微核，增加姐妹染色单体交换频率，而且影响细胞周期，使G₁期细胞比例升高^［7］。ARC可造成口腔鳞状细胞癌细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）升高和DNA损伤，G₂/M期阻滞和细胞凋亡^［8］。ARC通过调控氧化应激、细胞凋亡和DNA损伤相关基因表达，增强线虫体内ROS水平，诱导其神经毒性、发育毒性和生殖毒性^［9］。ARC可通过抑制小鼠抗氧化作用引起肝功能受损，低剂量ARC可阻滞脾淋巴细胞周期，高剂量可引起凋亡，从而产生免疫抑制^［10］。

本论文着重探究ARC作用后是否对小鼠骨髓细胞DNA造成损伤，以及对小鼠骨髓细胞的细胞周期，骨髓细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondial dehyde，MDA）、ROS含量，骨髓细胞内线粒体膜电位（mitochondrial transmem brane potential，Δψm）及p53蛋白含量造成影响，揭示ARC造成小鼠骨髓细胞DNA损伤的机制。不同于其他研究机制，本文通过分析ARC给药后小鼠体内抗氧化功能及自由基的变化，揭示ARC是否破坏机体的氧化/抗氧化平衡而导致DNA的过氧化损伤，并以此为切入点，探究造成骨髓细胞DNA受损的机制。同时，本文着眼于ARC对G₁期DNA损伤的检查点p53含量的影响，以确认激活p53蛋白造成的周期阻滞是否与DNA损伤修复有关，明确ARC导致DNA损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 动物

昆明种小鼠（SCXK（黑）2023-001），购于哈尔滨医科大学动物中心。

1.2 仪器

流式细胞仪（Beckman‑Coulter公司），光学显微镜、CKX‑41‑32荧光倒置显微镜、C‑4040ZOOM型数码相机（Olympus公司），电泳槽（美国伯乐公司），LD4‑2A型台式低速离心机（北京医用离心机厂），Sartorius BS110S型万分之一电子天平（德国），752紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.3 药品与试剂

氢溴酸槟榔碱（98%，批号：P1045954，美国Sigma公司）、正常熔点琼脂糖（批号：A2929‑25G，美国Sigma公司）、低熔点琼脂糖（批号：A9414‑5G，美国Sigma公司）、溴化丙啶（PI，批号：P4170，美国Sigma公司）、罗丹明（Rhodamine 123，批号：252433，美国Sigma公司），Tris（三羟甲基氨基甲烷，批号：GC208001，Servicebio）、环磷酰胺（CP，批号：H32024654，江苏恒瑞医药股份有限公司）、TritonX‑100（批号：T8200，索莱宝）、RNaes（批号：R4875，Sigma）、柠檬酸三钠（批号：20230527，上海试一化学试剂有限公司）、多聚甲醛（批号：20230118，天津市化学试剂研究所）、牛血清白蛋白（BSA，批号：9048‑46‑8，上海华舜生物工程有限公司）、SOD（批号：20230524，南京建成生物工程研究所）、GSH（批号：20230315，南京建成生物工程研究所）、MDA（批号：20230107，南京建成生物工程研究所）、2′‑7′二氯荧光黄双乙酸钠（DCFH‑DA，批号：S0035M，北京碧云天生物技术有限公司），其它试剂无水乙醇、Na₂EDTA、NaCl、KCl、Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaOH、二甲基亚砜为化学纯。

1.4 方法

1.4.1 实验动物给药及骨髓细胞的制备

实验中采用30只雄性小鼠，随机分成3组：空白组（生理盐水组，control group）、阳性对照组（环磷酰胺，CP group，40 mg/kg）、ARC给药组，根据国家药品监督管理局发布《药物遗传毒性研究技术指导原则》^［11］和预实验结果确定最大给药剂量1/2 LD₅₀：40 mg/kg），每组10只。ARC组和空白组连续给药14 d，环磷酰胺组采用30 h给药法。小鼠末次给药后禁食处死，取股骨，提骨髓，过滤离心，清洗后制成细胞悬液。余下实验动物给药分组如下：60只雄性小鼠随机分6组，空白组、阳性对照组及ARC不同给药剂量组，根据国家药品监督管理局发布《药物遗传毒性研究技术指导原则》^［11］和预实验结果，以剂量应优选能覆盖产生最大毒性到少/无毒性的剂量范围为原则，确定ARC给药剂量组分别是1/16 LD₅₀（5 mg/kg）、1/8 LD₅₀（10 mg/kg）、1/4 LD₅₀（20 mg/kg）、1/2 LD₅₀（40 mg/kg），每组10只，给药方式同上。本论文所有实验动物方案由哈尔滨商业大学实验动物伦理委员会审核通过，批准号：HSDYXY‑20230014。

1.4.2 单细胞凝胶电泳实验

骨髓细胞制成琼脂糖玻片，浸入细胞裂解液充分裂解，取出载玻片PBS清洗，于水平电泳槽中，倒入碱性电泳缓冲液电泳，后取出清洗，溴化乙啶染色，染色荧光显微镜下观察照相。

1.4.3 PI单染法

各组取细胞悬液加入PI染液避光染色，流式细胞仪检测，激发和发射波波长为488 nm和630 nm。选取10 000个细胞进行统计学分析。

1.4.4 化学比色法和荧光强度测定法

SOD（羟胺法）、GSH（化学比色法）、MDA（化学比色法）测定均按试剂盒说明书操作，测定其吸光度。ROS测定用DCFH‑DA荧光染液染色，加入PBS后离心，PBS重悬细胞，过滤后流式细胞仪检测。

1.4.5 Δψm的测定

取骨髓细胞悬液，罗丹明123染液染色37 ℃孵育30 min，流式细胞仪测定。

1.4.6 p53蛋白含量的测定

骨髓细胞悬液离心，多聚甲醛固定4 ℃过夜。离心后加Tritonx‑100透化，用含BAS的PBS清洗后离心弃上清，样品加入兔抗小鼠p53（1∶50）孵育，同型对照不加一抗。清洗离心后加FITC标记的羊抗兔抗体（1∶200）孵育。洗涤离心，PBS重悬细胞后过滤，流式细胞仪检测并记录荧光强度，得到p53蛋白含量变化。

1.5 统计学处理

采用SPSS 21.0软件对数据进行分析处理。计量数据采用\overline{x}\pm s表示，多样本组间均数比较采用单因素方差分析（One‑Way ANOVA）和LSD多重比较分析法进行。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ARC对小鼠骨髓细胞DNA损伤作用

单细胞凝胶电泳结果显示，空白组在电泳图谱上仅出现荧光团，细胞无拖尾现象，细胞保持球形；而ARC1/2 LD₅₀组和CP组观察到特征性彗星尾，拖尾现象比空白组明显。ARC组与CP组相比，拖尾更明显，尾长也较长，说明ARC引起DNA断裂，明显造成小鼠骨髓细胞DNA损伤。见图1。

2.2 ARC对小鼠骨髓细胞细胞周期的作用

腹腔注射ARC 2周后，小鼠骨髓细胞周期已受到影响。给药组小鼠骨髓细胞与空白组相比，G₀/G₁期细胞比率随ARC浓度的递增而明显增加（P<0.01），S期和G₂/M期细胞比率有明显降低（P<0.01）。见表1、图2。

2.3 ARC对小鼠骨髓细胞内SOD活性和GSH、MDA、ROS含量的影响

ARC给药2周后，与空白组比较，随着药物浓度的升高，各剂量组SOD活性、GSH含量差异具有统计学意义（P<0.01），MDA含量明显升高（P<0.01）。见表2。

用流式细胞仪测得小鼠骨髓细胞内的荧光强度反映相应ROS生成量，随着ARC浓度的增加，ROS水平也逐渐增加。与空白组比较，1/16 LD₅₀ARC给药组细胞ROS水平明显升高（P<0.05），1/8 LD₅₀、1/4 LD₅₀、1/2 LD₅₀ARC给药组细胞ROS水平明显升高（P<0.01），1/2 LD₅₀ ARC组ROS水平增加最明显（P<0.01）。见表2。

2.4 ARC对小鼠骨髓细胞内Δψm的影响

用流式细胞仪检测经罗丹明123染色的细胞，经ARC给药的小鼠骨髓细胞中Δψm明显降低（P<0.01），呈一定的剂量依赖关系，结果说明ARC可以降低小鼠骨髓细胞内Δψm。见表3。

2.5 ARC对小鼠骨髓细胞p53蛋白含量的影响

腹腔注射ARC两周后，小鼠骨髓细胞中p53蛋白含量有不同程度的变化，与空白组相比，1/16 LD₅₀ ARC剂量组p53蛋白含量明显增加（P<0.05），其余剂量组随着ARC浓度的增加，p53蛋白含量明显增多，与空白组比较差异具有统计学意义（P<0.01），1/2 LD₅₀ ARC剂量组p53含量最高且高于CP组，作用明显（P<0.01）。见表3。

3 讨论

IARC在《柳叶刀‑肿瘤学》发表了对槟榔主要活性成分——ARC致癌性的主要评估结论。基于有力的机制研究证据，ARC被定为2B类致癌物——可能对人类致癌（动物试验证据或对人类致癌证据有限）^［14］。基于此，针对ARC对于骨髓细胞的遗传毒性研究具有重要的研究价值。

单细胞凝胶电泳，又称彗星实验，是有核细胞DNA损害的检测方法，用于检测单个哺乳类细胞DNA断裂^［15］。受损的DNA在碱性电泳液中双链解螺旋变为单链，单链断裂的小分子在凝胶分子筛中向阳极迁移，形成拖尾形如彗星状图像。决定断裂DNA电泳行为的关键因素是DNA超螺旋的松散，DNA受损断片增多，在彗星尾中出现的DNA就越多^{［16，17］}。本实验给予小鼠1/2 LD₅₀ ARC，发现给药组彗星拖尾现象较空白组明显严重，说明ARC可引起骨髓细胞DNA受损，DNA断裂片断增多。实验结果为ARC引起的DNA损伤提供了形态学证据，表明了1/2 LD₅₀剂量的ARC可引起骨髓细胞DNA损伤。

流式细胞术是对单细胞或生物微粒进行高速分析的新技术，可对悬浮中细胞及颗粒性物质进行快速测量^{［18，19］}。在毒理学研究中将流式细胞仪应用于细胞周期及细胞凋亡的检测，流式细胞术是细胞周期检测最有效的常用方法^［20］。细胞周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的完整过程，细胞周期不同阶段DNA含量不同^{［21，22］}。流式细胞术结果显示，ARC作用后小鼠骨髓细胞G₀/G₁期细胞比率明显增加（P<0.01）的同时，S期和G₂/M期细胞比率明显降低（P<0.01），说明ARC使骨髓细胞停滞在G₀/G₁期，影响了S期DNA的合成，从而减少进入G₂/M期细胞数。进入S期细胞的减少会使有丝分裂和细胞增殖数量降低，从而抑制骨髓细胞的生长，这些不仅是DNA受损的表现，也为DNA修复提供时间。骨髓细胞周期的变化进一步验证了ARC对DNA的损伤作用。

MDA是脂质过氧化反应链终止阶段产生的小分子产物，具有很强的氧化作用，能够引起细胞损伤、老化和死亡^［23］。ROS是真核细胞有氧呼吸时的产物，随氧化代谢活动产生^［24］。适量的ROS是维持细胞生长和机体抗感染所必需的，但过量的ROS可对机体造成病理生理损害，损伤细胞的DNA和RNA，导致细胞基因的改变或突变^［25］。本实验结果表明，ARC可使骨髓细胞MDA、ROS过量产生，过量的自由基会攻击DNA分子，引起包括DNA分子单双链断裂等各种损伤而导致包括肿瘤在内的多种疾病。因此MDA、ROS的过量产生是ARC引起DNA损伤的机制之一。机体内与氧化损伤相关的SOD是超氧阴离子的特异酶，它能催化2个O^2‑的歧化反应，生成H₂O₂和分子氧，是活性最强的自由基清除剂之一^［26］。GSH是人体细胞最丰富的抗氧化剂，两分子GSH脱氢后转化为氧化型的谷胱甘肽（Dxidized glutathione，GSSG），在此转化过程阻止羟基自由基等产生^［27］。本实验发现ARC给药后，细胞内总SOD活力和GSH含量降低，ROS、MDA含量增加，说明ARC给药后小鼠的抗氧化能力下降，抗氧化功能受到严重损害。同时自由基大量产生，脂质过氧化反应增强，导致脂质过氧化物终产物MDA含量不断增加。从而机体产生自由基与机体抗氧化系统之间的动态平衡被打破，自由基就会攻击核酸、蛋白质、多不饱和脂肪酸等生物大分子对机体组织造成过氧化损伤，最终导致细胞DNA损伤，更严重会引起基因突变，甚至癌变的发生。所以，ARC破坏机体的氧化/抗氧化平衡也是其导致DNA受损的机制之一。

Δψm是一种能较灵敏地反映细胞毒性效应的指标^［28］。实验以罗丹明123为线粒体探针对活细胞进行荧光染色，荧光值的高低反映了Δψm的变化。实验发现ARC给药后，1/2 LD₅₀组可致骨髓细胞线粒体膜电位降至正常水平的50%以上，说明ARC可剂量依赖性地降低线粒体膜电位，使细胞功能受损。结合本实验和前期槟榔碱对小鼠骨髓细胞内Ca²⁺的影响实验，可以说明ARC可引起小鼠骨髓细胞内ROS水平和Ca²⁺浓度增加，Δψm降低。Ca²⁺浓度增加使Δψm降低，ATP合成减少，导致能量储备耗竭，从而增加ROS的产生。ATP耗竭，持续性的细胞内Ca²⁺升高以及ROS过量产生这3种关键性的生化紊乱使细胞DNA受损甚至是致死性打击。因此Δψm的降低也是ARC使骨髓细胞DNA受损的机制之一。

p53蛋白是一种由p53基因编码的与细胞分裂周期相关的核酸蛋白质。野生型p53蛋白是G₁期DNA损伤的检查点，如果DNA遭到破坏，p53蛋白能通过一定机制使DNA得以修复，如果修复失败，则p53蛋白能够通过“细胞编程死亡”而引发细胞自杀，阻止具有癌变倾向基因突变的细胞产生，从而起到抑癌作用^{［29，30］}。本实验利用流式细胞仪检测了ARC对p53蛋白含量的影响，结果随着ARC剂量的增加，p53蛋白含量逐渐升高（P<0.05）。当细胞DNA受损伤时，损伤信号将引起p53蛋白的积累和活化，使细胞周期停滞于G₁期，以便在DNA开始合成前对受损的DNA进行修复。因此，ARC引起的G₁期停滞与p53蛋白含量增加有关，也是ARC对DNA的损伤机制之一。

综上所述，形态学上观察到ARC对小鼠骨髓细胞DNA的损伤作用，可使骨髓细胞周期阻滞在G₀/G₁期，抑制了骨髓细胞的生长，DNA受损导致细胞周期停滞，以便使DNA修复。ARC可以使细胞内SOD活性、GSH含量下降，ROS、MDA含量增加，表明ARC会导致小鼠细胞抗氧化能力下降，ROS大量产生，脂质过氧化增强，机体内氧化/抗氧化平衡被打破，进而导致DNA损伤。ARC可以降低细胞内的Δψm，使ATP耗竭，使细胞功能受损，进而导致DNA受损，还能使细胞内p53蛋白含量明显增加，说明ARC作用后骨髓细胞DNA已经受到损伤，p53发挥了其“分子警察”作用，诱导细胞进入G₀/G₁期，抑制细胞增殖，以使损伤的DNA得以修复。以上为本论文揭示ARC造成DNA损伤的机制，其他机制将在后续研究工作中完善。

作者贡献度说明：

于蕾、于晶涵：文章撰写；马媛晗：完成实验，文章撰写；郎朗、龚艳朝：数据统计分析；宋辉、张小坡、张彩云和王正文：文章审核。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82060778)

海南省自然科学基金(820RC776)

海南省卫生健康科技创新联合项目(WSJK2024MS162)

黑龙江省中医药科研课题项目(ZHY2024‑098)