ACC通过调控GluN2B/CaMKⅡ信号通路改善精神分裂症模型小鼠的认知功能障碍

ACC improves cognitive dysfunction in schizophrenia model mice by regulating the GluN2B/CaMKⅡ signaling pathway

摘要

目的 探讨1‑氨基环丙烷羧酸（1‑aminocyclopropanecarboxylic acid，ACC）对地卓西平马来酸盐（MK801）诱导的精神分裂症（schizophrenia，SCZ）模型小鼠行为学异常的作用及分子机制。 方法 将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、SCZ模型组、ACC干预组。通过腹腔注射MK801建立精神分裂症模型，采用旷场实验和新物体识别实验评估小鼠行为学改变；Western blot检测小鼠海马GluN2B、CaMKⅡ及p‑CaMKⅡ （Thr305）蛋白表达水平；运用分子对接技术分析ACC与GluN2B‑NMDAR的结合特性。 结果 行为学分析显示，ACC可特异性改善MK801诱发的自主活动亢进，并明显逆转新物体识别记忆损伤。分子机制研究表明，ACC干预能上调MK801模型组降低的GluN2B表达，恢复CaMKⅡ磷酸化水平。分子对接显示ACC与GluN2B‑NMDAR具有稳定结合。 结论 ACC可能通过调控GluN2B/CaMKⅡ信号通路改善精神分裂症模型小鼠的认知功能障碍。

Abstract

Objective To investigate the effects of 1‑aminocyclopropanecarboxylic acid （ACC） on behavioral abnormalities and the underlying molecular mechanisms in a schizophrenia（SCZ） model induced by dizocilpine maleate （MK801） in mice. Methods Eight‑week‑old male C57BL/6J mice were randomly divided into 3 groups： the normal control group， the SCZ model group， and the ACC intervention group. The schizophrenia model was established via intraperitoneal injection of MK801. Behavioral changes were evaluated using the open field test and the novel object recognition test. Western blot was utilized to assess the expression levels of GluN2B， CaMKⅡ， and p‑CaMKⅡ （Thr305） proteins in the hippocampus. Additionally， molecular docking studies were conducted to explore the binding characteristics between ACC and GluN2B subunit of the N‑methyl‑D‑aspartate receptor （NMDAR）. Results Behavioral assessments revealed that ACC specifically alleviated MK801‑induced hyperlocomotion and significantly improved novel object recognition memory deficits. Molecular analyses demonstrated that ACC treatments upregulated the MK801‑induced downregulation of GluN2B expression and restored CaMKⅡ phosphorylation levels. Furthermore， molecular docking results indicated stable binding between ACC and GluN2B‑NMDAR. Conclusion ACC may enhance cognitive function in schizophrenia model mice by modulating the GluN2B/CaMKⅡ signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

精神分裂症 / 行为学实验 / 地卓西平马来酸盐 / N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体 / 认知功能障碍

Key words

Schizophrenia / Behavioral tests / Dizocilpine maleate / N‑methyl‑D‑aspartate receptor / Cognitive dysfunction

精神分裂症（schizophrenia，SCZ）是一种具有遗传倾向的复杂多维综合征，表现为阳性症状、阴性症状及认知缺陷^［1］。尽管第二代抗精神病药物通过多巴胺D2受体拮抗可有效控制幻觉妄想等阳性症状，但其对阴性症状和认知障碍的改善有限^［2，3］，且长期用药会出现锥体外系反应、代谢紊乱等不良反应^［4，5］。因此，开发兼具多靶点调控特性与安全性优势的新型治疗策略，是当前SCZ研究的关键方向。近年研究发现，SCZ患者前额叶‑边缘系统存在N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体（N‑methyl‑D‑aspartate receptor,NMDAR）功能低下及突触可塑性损伤，提示谷氨酸能神经传递异常在认知缺陷发生中起关键作用^［6］。其中，NMDAR亚基GluN2B通过调控钙离子（Ca²⁺）/钙调蛋白（CaM）‑Ca²⁺/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）级联反应，介导PSD95依赖的AMPA受体（AMPAR）膜转运，进而影响突触长时程增强（LTP）与认知功能^［7］。这为靶向NMDAR信号重塑突触可塑性提供了理论依据。

地卓西平马来酸盐（MK801）是NMDAR的特异性拮抗剂，可在啮齿类动物模型中诱发过度运动行为，并导致多个认知领域的功能障碍^［8，9］。1‑氨基环丙烷羧酸（1‑aminocyclopropanecarboxylic acid，ACC）作为NMDAR甘氨酸位点的部分激动剂，可增强NMDAR功能。研究显示，ACC能明显改善SCZ模型动物的物体识别记忆与认知灵活性^［10］。不过，ACC发挥作用的具体分子机制尚不明确。本研究通过给予MK801构建小鼠急性SCZ模型，再灌胃给予SCZ模型小鼠ACC，旨在探讨ACC对SCZ模型小鼠的具体影响及其潜在作用机制，为优化精神分裂症治疗方案提供实验和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级健康雄性C57BL/6J小鼠，8周龄，体重20~25 g，购自广州市研成生物科技有限公司［合格证号 SYXK（琼）2022—0013］。所有动物饲养于SPF级动物房，环境温度维持在（21±2） ℃，相对湿度（55±5）%，采用12 h/12 h明暗循环光照周期，自由摄食饮水，适应性饲养1周后再进行实验。动物实验根据国际医学科学组织理事会概述的国际生物医学研究动物实验指南准则进行，实验方案经海南医学院动物伦理委员会审批通过，编号：HYLL‑2021‑097。

1.2 模型建立与药物处理

将小鼠随机分为3组（n=6）：正常对照（Control）组、SCZ模型（MK801）组、ACC干预（MK801+ACC）组。MK801（MCE，货号HY‑15084）用生理盐水配制，SCZ模型组和ACC干预组小鼠单次腹腔注射0.5 mg/kg MK801建立精神分裂症阳性症状模型。ACC（麦克林，货号C12778991）用生理盐水配制成500 μmol/L的溶液，ACC干预组小鼠连续7 d灌胃给药（10 mL/kg），每日1次。于第8天进行行为学测试前2 h再次灌胃给药，并于行为测试前15 min腹腔注射MK801（0.5 mg/kg）。

1.3 行为学测试

1.3.1 旷场实验

采用旷场实验评估小鼠的自发活动性和焦虑样行为，与正常小鼠相比，MK801诱导的SCZ小鼠运动量明显上升，增加约280%^［9］。实验装置为40 cm×40 cm×40 cm的方形旷场箱，将小鼠轻柔放置于旷场中央，使用视频跟踪系统（Smart v3.0，Panlab Co.）记录5 min内小鼠的运动轨迹。每只小鼠测试结束后，用75%乙醇彻底清洁旷场箱，以消除气味干扰。

1.3.2 新物体识别实验

新物体识别实验分为训练期和测试期两个阶段，采用开放行为实验箱进行。训练期：将两个相同物体（A1和A2）对称放置于实验箱相邻两角，距离箱壁5 cm。将小鼠背向物体放入箱中，自由探索5 min。6 h后进行测试期：将物体A2替换为新物体B，记录小鼠5 min内探索物体A1和B的时间。计算辨别指数（discrimination index，DI）：DI = （TB-TA1）/（TA1 + TB），其中TA1为探索熟悉物体A1的时间，TB为探索新物体B的时间。DI值反映小鼠的认知记忆能力，数值越低表明认知功能受损越严重。每只小鼠测试结束后，用75%乙醇彻底清洁实验箱和物体，以消除气味干扰。实验过程中请确保小鼠在放入实验箱前无法看到物体和实验条件的一致性。

1.4 蛋白质免疫印迹分析

采用含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取小鼠海马组织总蛋白。通过BCA法测定蛋白浓度并均一化，加入上样缓冲液后于100 ℃金属浴变性10 min。使用SDS‑PAGE胶进行电泳分离，随后将蛋白转印至硝酸纤维素膜。室温下以5%脱脂牛奶封闭2 h后，分别加入以下一抗：GluN2B（1∶1 000）、CaMKⅡ（1∶5 000）、p‑CaMKⅡ（Thr305位点，1∶1 000）及β‑actin（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。次日经TBST洗膜3次（每次10 min），加入HRP标记二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST洗膜3次（每次10 min），ECL显影后通过ImageJ软件分析条带灰度值。目的蛋白相对表达量计算公式为：目标蛋白灰度值/β‑actin内参灰度值。

1.5 分子对接验证

为探究ACC与NMDAR的结合特性，采用AutoDock Tools 1.5.7进行分子对接。受体蛋白NMDAR晶体结构（PDB ID∶ 8VUV）源自RCSB数据库，配体ACC三维结构（PubChem CID∶ 535）从PubChem数据库下载。最终结合构象通过PyMol 2.6.0软件可视化。

1.6 统计学处理

实验数据以\overline{x}\pm s表示（n≥3）。多组间比较使用GraphPad Prism 8.0软件进行单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey多重检验法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ACC对精神分裂症模型小鼠行为特征的影响

2.1.1 ACC改善MK801诱导的运动功能亢进

通过旷场实验评估ACC对MK801诱导的精神分裂症模型小鼠自主运动的影响。与对照组相比，模型组小鼠在5 min测试中表现出总运动距离（P<0.01）、边缘区运动距离（P<0.01）、总运动时间（P<0.001）和边缘区运动时间（P<0.05）明显增加，而总停留时间（P<0.001）和边缘区停留时间（P<0.001）明显减少，见图1。尽管模型组中央区探索距离（P=0.128 8）、探索时间（P=0.101 2）和停留时间（P=0.934 3）呈现上升趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。ACC干预明显逆转上述行为异常。与模型组相比，MK801+ACC组总运动距离（P<0.01）、边缘区运动距离（P<0.01）、总运动时间（P<0.05）和边缘区运动时间（P< 0.05）明显减少，总停留时间明显增加（P<0.05）。ACC处理使中央区运动距离（P=0.7 967）较模型组减少，中央区停留时间（P=0.2 137）和边缘区停留时间（P=0.064 6）增加，但组间差异无统计学意义（P>0.05）。这些结果表明，ACC能特异性拮抗MK801诱导的自主活动亢进，并可能通过调节空间探索行为发挥神经保护作用。

2.1.2 ACC改善MK801诱导的认知障碍

为探究ACC对精神分裂症模型小鼠认知功能的影响，本研究采用新物体识别实验进行行为学评估。与正常对照组相比，MK801诱导的精神分裂症模型组表现出明显降低的新物体辨别指数（DI）（P<0.01），表明其存在明显的认知功能损伤。ACC给药（P<0.01）可明显逆转MK801诱导的认知障碍，使模型小鼠的DI恢复至正常水平，见图2。这些结果提示ACC具有逆转MK801引起的认知功能障碍的作用。

2.2 ACC调控GluN2B/CaMKⅡ信号通路机制

为阐明ACC改善MK801诱导行为学异常的具体分子机制，本研究基于文献提示ACC可能作为NMDAR变构调节剂的作用特征^［10］，检测了小鼠海马组织NMDAR下游信号通路关键蛋白表达水平。Western blot结果显示（图3），与正常对照组相比，MK801模型组小鼠海马GluN2B蛋白表达量明显降低（P<0.01），同时其CaMKⅡ磷酸化水平（pThr305位点）也呈现同步下降趋势（P<0.05）。ACC干预可明显逆转上述蛋白异常：治疗组中GluN2B（P<0.01）、pThr305（P<0.001）表达量较模型组明显升高。这些数据表明，ACC可通过恢复MK801诱导的GluN2B/CaMKⅡ信号通路抑制，发挥其对精神分裂症样症状的治疗作用。

2.3 ACC与GluN2B的分子相互作用

为阐明ACC改善精神分裂症样行为的分子机制，本研究基于前期发现的GluN2B/CaMKⅡ通路激活现象（图4）及文献报道的NMDAR配体特性^［10］，采用分子对接技术解析ACC与GluN2B的相互作用模式。ACC以高亲和力结合于GluN2B亚基的变构调节口袋（结合自由能ΔG=-2.88 kcal/mol），与HIS‑67、LYS‑68、ASN‑70及THR‑103形成4个稳定氢键，见图4。该结合位点可能影响了MK801竞争性拮抗区域的空间构想，提示ACC可能通过变构调节机制恢复NMDAR功能。此发现为ACC逆转MK801诱导的突触可塑性损伤提供了结构生物学依据。

3 讨论

SCZ作为一种多维度精神障碍疾病，其病理机制涉及多巴胺与谷氨酸系统的协同失调^［11］。尽管以多巴胺D2受体拮抗为核心的第二代抗精神病药物（如奥氮平）可部分缓解阳性症状，但其对认知缺陷及阴性症状的改善效能有限，且长期使用伴随代谢综合征等副作用^［8，12］。这一治疗困境凸显了从病理机制出发开发多靶点药物的必要性。这一现状凸显了开发兼具高效性与安全性的新型治疗策略的迫切需求。

本研究取得以下发现：行为学实验显示，ACC特异性逆转了MK801诱导的自主活动亢进，并明显提升新物体识别辨别指数，反映ACC缓解了精神分裂的阳性症状且提高了认知能力；在分子机制层面，ACC处理使海马GluN2B表达恢复至正常水平，并上调p‑CaMKⅡ（Thr305）磷酸化水平，提示可能通过重建NMDAR介导的Ca²⁺内流，调控NMDAR‑CaMKⅡ信号轴发挥治疗效应；分子对接预测显示，ACC与NMDAR的可能结合位点位于配体结合结构域（LBD），进一步验证其可能通过调控甘氨酸/谷氨酸与受体的结合，进而影响Ca²⁺通道开放状态及下游信号传导^［13］。

基于NMDAR拮抗剂可诱发精神分裂症样症状的研究证据，谷氨酸假说指出NMDAR功能低下可能导致SCZ，表现出阳性、阴性及认知症状^{［14，15］}。作为异四聚体离子通道蛋白，NMDAR由两个必需GluN1亚基与两个GluN2亚基（2A‑2D）共同构成功能单元^［16］。有研究证实，海马GluN2B亚基对维持NMDAR通道功能、LTP及空间学习等认知功能具有关键作用^{［17‑19］}。Ca²⁺/ CaMKⅡ作为细胞内Ca²⁺信号的核心调控因子^［20］，通过多重机制参与突触可塑性的调节过程^［21］。具体而言，在海马CA3‑CA1突触的经典LTP形成中，NMDAR介导的Ca²⁺内流激活CaMKⅡ，后者通过增强AMPA受体电流诱导突触可塑性相关基因表达和神经突生长^［20］。值得注意的是，LTP的诱导需要Ca²⁺/CaM激活的CaMKⅡ，随后Thr286位点的自磷酸化使其获得Ca²⁺非依赖性自主活性以维持LTP；而Thr305位点的自磷酸化则通过负反馈机制调控激酶活性；Thr286/Thr305磷酸化与GluN2B形成动态调控网络，共同协调LTP与长时程抑制（LTD）的平衡^［22］。

本研究中ACC干预组GluN2B蛋白的表达水平恢复正常，介导Ca²⁺内流激活CaMKⅡ，后者通过增强AMPAR电流诱导突触可塑性相关基因表达和神经突生长，从而改善认知障碍。p‑CaMKⅡ（Thr305）的表达上调可能源于两方面机制：其一，LTP过程中p‑CaMKⅡ（Thr286）水平的升高促进了Thr305位点磷酸化；其二，LTP终止阶段Thr305位点的高表达可能通过触发LTD机制，防止神经元过度兴奋导致的细胞损伤。综上，本研究发现ACC通过增强NMDAR功能并调控CaMKⅡ磷酸化动态平衡，明显改善精神分裂症模型认知障碍。目前的药物治疗对于精神分裂症相关的认知障碍和阴性症状的治疗有限^［23］，因此了解与精神分裂症认知相关的分子机制极为重要，该发现为开发改善精神分裂症认知障碍的靶向NMDAR的低副作用疗法提供了新思路。

本研究证实ACC通过GluN2B/CaMKⅡ信号轴改善SCZ模型认知障碍，但其临床转化仍需解决以下问题：（1）需明确ACC对GluN2A等其他NMDAR亚基的调控作用；（2）需结合光遗传‑钙成像技术解析ACC对海马‑前额叶神经环路信息编码的影响；（3）补充在体LTP记录以直接关联突触可塑性与行为改善。

作者贡献度说明：

李振莹：实验操作、论文初稿的写作、数据分析和整理；王鹏、刘坤泽：动物饲养、文献收集；王杰、田梦思：实验技术指导；郭青云、温石磊、倪盼丽：实验条件保障；卢利方、冯仁军：项目构思者和负责人，实验设计，经费支持及论文审阅与修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省重点研发项目(ZDYF2022SHFZ310)

海南省自然科学基金项目(821MS0775)

海南省自然科学基金项目(823RC493)

海南省自然科学基金项目(821QN261)