6‑姜酚基于调控ACSL4/xCT/GPX4途径抑制铁死亡干预动脉粥样硬化形成机制研究

Exploring the mechanism of 6‑gingerol inhibiting ferroptosis to interfere with the formation of atherosclerosis by regulating ACSL4 / xCT / GPX4 pathway

摘要

目的 探讨6‑姜酚（6‑gingerol，6‑G）调控酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）/溶质载体7家族成员11，SLC7A11（xCT）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抑制ApoE^{（‑/‑）}动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）小鼠铁死亡的作用及机制。 方法 6只普通饲料喂养C57BL/6J雄性小鼠为对照（Control，Con）组，按随机数字表法将18只SPF级别的ApoE^{（‑/‑）}小鼠分成AS模型（atherosclerosis Model，Mod）组，6‑G治疗（6‑Gingerol，6‑G）组，铁死亡抑制剂（Ferrostatin‑1，Fer‑1）组，每组6只。Con组喂养普通饲料，除Con组，其余组别均喂养高脂饲料，持续喂养10周，诱导构建AS动物模型。造模成功后，6‑G组给予20 mg/kg的6‑G灌胃处理，Fer‑1组给予1 mg/kg的Fer‑1腹腔注射，除Con组仍饲喂普通饲料外，其余组仍继续饲喂高脂饲料，继续喂养6周。全自动生化分析仪检测血脂水平，油红O染色法检测小鼠动脉组织粥样硬化水平，透射电子显微镜观察各组主动脉线粒体超微形态结构改变，试剂盒检测Fe²⁺水平，ELISA法测定血清还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的水平。Western blot评估小鼠主动脉ACSL4、xCT和GPX4蛋白表达情况。 结果 与Con相比，Mod小鼠主动脉见明显脂质斑块附着，血清TC、TG、LDL‑C、Fe²⁺、MDA水平升高，HDL‑C、GSH水平降低（P<0.01），主动脉组织ACSL4蛋白表达明显上升，GPX4、xCT表达明显下降（P<0.01），线粒体结构形态损伤严重。与Mod组相比，6‑G组以及Fer‑1组小鼠治疗后主动脉脂质斑块沉积减少，血清TC、TG、LDL‑C、Fe²⁺、MDA水平降低，HDL‑C、GSH水平升高，差异具有统计学意义（P<0.05），主动脉组织ACSL4蛋白表达降低，GPX4、xCT的蛋白表达量明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），线粒体结构趋近正常。 结论 6‑姜酚可以减轻动脉粥样硬化水平，其作用机制可能是通过调节ACSL4/xCT/GPX4途径抑制铁死亡和脂质过氧化发挥对主动脉的保护作用。

Abstract

Objective To investigate the influence and underlying mechanisms of 6‑gingerol（6‑G） in suppressing ferroptosis in ApoE^{（‑/‑）} atherosclerotic mice by modulating the ACSL4 （Acyl‑CoA synthetase 4 ） /xCT （solute carrier 7 family member 11， SLC7A11）/GPX4 （glutathione peroxidase 4） signaling pathway. Methods A total of 6 male C57BL/6J mice were placed on a normal diet to serve as the control group （Con）. A total of 18 SPF grade ApoE^{（‑/‑）} mice were randomly assigned to the AS model group （Atherosclerosis Model group，Mod）， the 6‑G treatment group （6‑Gingerol group，6‑G）， and the Ferrostatin‑1 group （Ferrostatin‑1 group，Fer‑1）， with 6 mice allocated to group. The Con group continued with a normal diet， while all other groups were subjected to a high‑fat diet for a duration of 10 weeks to establish the AS animal model. Upon successful modeling， the 6‑G group received 20 mg/kg of 6‑G via gavage， while the Fer‑1 group was administered 1 mg/kg^/ of Fer‑1 through intraperitoneal injection. Apart from the Con group， which consumed a normal diet， the other groups remained on the high‑fat diet for an additional 6 weeks. Blood lipid profiles were assessed using an automatic biochemical analyzer， while atherosclerosis levels in the mice were evaluated through oil red O staining. The ultra‑structural alterations of aortic mitochondria across all groups were examined using a transmission electron microscope. Fe²⁺ levels was detected using a reagent kit， while serum levels of GSH and MDA were quantified via ELISA.The protein levels of ACSL4， xCT， and GPX4 in the aortic tissues of the mice from each group were determined through Western blot analysis. Results Compared to the Con group， the aortic tissues of Mod mice exhibited significant lipid plaque accumulation， along with elevated serum levels of TC，TG， LDL‑C， Fe²⁺， and MDA was increased and HDL‑C and GSH levels was decreased （P<0.01）. The expression of ACSL4 protein in the aortic tissue was notably elevated， whereas the expression of GPX4 and xCT proteins was significantly reduced （P<0.01）. Additionally， mitochondrial structure and morphology were severely compromised. Compare to the Mod group， both the 6‑G group and the Fer‑1 group exhibited a reduction in aortic lipid plaque accumulation following treatment. There was a notable decrease in the levels of serum TC， TG， LDL‑C， Fe²⁺， and MDA， while levels of HDL‑C and GSH were found to be elevated， with significant differences observed（P<0.05）. Additionally， there was a down‑regulation of ACSL4 protein expression， while GPX4 and xCT protein expressions were up‑regulated， also showing significant differences （P<0.05）， with mitochondrial structures nearing normalcy. Conclusion 6‑gingerol can mitigate the level of atherosclerosis， potentially through the modulation of the ACSL4/xCT/GPX4 pathway， which mediates the suppression of ferroptosis and lipid peroxidation， providing protection to the aorta.

Graphical abstract

关键词

6‑姜酚 / 动脉粥样硬化 / 铁死亡 / ACSL4/xCT/GPX4通路 / 脂质过氧化

Key words

6‑gingerol / Atherosclerosis / Ferroptosis / ACSL4/xCT/GPX4 pathway / Lipid peroxidation

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）为脂质代谢功能失调引起的内皮细胞损伤和异常炎症反应^［1］，其主要特征为大、中型动脉血管内皮大量的脂质过氧化产物和铁沉积导致的大量脂质斑块聚积^［2］，是高血压、心肌梗死、不稳定型心绞痛等多种心血管疾病的主要病理基础^［3］。铁死亡（Ferroptosis）是一种独特的细胞死亡，以二价铁的过度沉积为基石，与脂质氢过氧化物大量产生密切相关^［4］，不同于细胞凋亡、焦亡、坏死，其经典特征是线粒体结构改变、铁过度蓄积以及细胞膜不受限制的脂质过氧化^［5］。铁过载与AS的发病机制密切相关。越来越多研究证据证实，铁死亡发生时血管内皮细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量增加，诱发脂质过氧化反应，血管内皮细胞受损，促进AS病变的形成^［6］。相关研究证实，阻断血管内皮细胞铁死亡的发生、发展有望成为治疗动脉粥样硬化的潜在靶点^［7］。6‑姜酚（6‑gingerol，6‑G）作为一种酚酮，具有抗炎^［8］、抗氧化、抗凋亡、神经保护^［9］、抗血管生成、降血脂、抗肿瘤^［10］作用等多种药理学特性。本课题组前期有研究表明，6‑G可通过逆转脂质谱和抑制炎性细胞因子的表达对动脉粥样硬化起到了较好的治疗作用^［11］。此外，基于铁死亡相关通路，既往证实xCT/GPX4可调控铁死亡^［12］，大川芎方通过调节ACSL4/GPX4信号通路拮抗铁死亡来减轻脂质过氧化损伤和神经元损伤^［13］。但6‑G是否通过调控ACSL4、xCT、GPX4抑制铁死亡改善动脉粥样硬化尚不明确。基于以上发现，本研究从铁死亡角度出发，通过建立高脂饮食（high-fat diet，HFD）诱导的载脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE^{（‑/‑）}）小鼠动脉硬化模型，分别接受6‑G和Fer‑1治疗，旨在探讨6‑G是否可以调控酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）/溶质载体7家族成员11（SLC7A11，xCT）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）途径抑制铁死亡和脂质过氧化，从而缓解动脉硬化的进展，并深入研究其可能的治疗作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂与仪器

铁死亡抑制剂（Ferrostatin‑1） （货号GLP‑GC10380‑5mg，美国GlpBio有限公司）；6‑G（货号MCE‑HY‑14615，美国GlpBio有限公司）；GPX4、ACSL4、xCT、β‑actin抗体（货号DF6701、DF12141、DF12509、AF7018，Affinity公司）；羊抗兔HRP抗体（EARTHOX，E030120‑01）；BCA蛋白提取试剂盒（货号P0012，上海碧云天）；Fe²⁺微量法检测试剂盒（货号BC5415，北京Solarbio公司）； 丙二醛（Malondialdehyde，MDA和还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）试剂盒（货号A003‑1、A006‑2‑1，南京建成生物）；油红试剂盒（货号S191015，吉加生物公司），一步法凝胶试剂盒（货号PG212，雅酶）。实验中所有设备由及仪器由辽宁中医药大学实验室提供。

1.1.2 小鼠购买及饲养

本研究采用SPF级6~8周龄ApoE^{（‑/‑）}雄性小鼠18只，普通饲料喂养C57BL/6J雄性小鼠6只，体质量为（19±3） g。购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（苏）2021‑0013。所有小鼠饲养于辽宁中医药大学动物实验中心SPF级实验动物室，实验单位使用许可证号SYXK（辽）2019‑0004，光照循环12 h，恒温20~24 ℃，相对湿度60%~70%。小鼠自由饮水和进食饲料。本实验研究经辽宁中医药大学伦理委员会已批准审核通过［伦理号2025CS（DW）‑006‑01］，并严格遵守伦理委员会的相关规定。

1.2 小鼠造模及标本采集

对照（Control，Con）组6只普通饲料喂养C57BL/6J雄性小鼠，18只SPF级ApoE^{（‑/‑）}小鼠以高脂饲料自由适应性喂养一周，上述18只小鼠共持续喂养10周制备AS模型。随后用随机数字表法将18只ApoE^{（‑/‑）}小鼠随机分为3组：AS模型（Atherosclerosis Model，Mod）组、6‑G治疗（6‑Gingerol，6‑G）组、铁死亡抑制剂（Ferrostatin‑1，Fer‑1）组，每组各6只。6‑G按20 mg/kg进行灌胃，Fer‑1按照1 mg/kg行腹腔注射操作，Con组及Mod组给予等量生理盐水，共喂养6周并做记录。1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射对小鼠处死，取眼眶血并迅速分离主动脉，一部分在4%多聚甲醛固定下贮存，另一部分在-80 ℃冰箱冻存，供后续用于实验。

1.2.1 血浆脂质谱浓度水平检测

全自动生化分析仪测定总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（hgh density lipoprotcin cholesterol，HDL‑C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotcin cholesterol，LDL‑C）水平。

1.2.2 油红O染色测定血管斑块面积大小及脂质沉积情况

取主动脉根部横切面，采用4%多聚甲醛固定冰冻切片，将切片插入染色架上放入烤箱37 ℃烤片2 h，将切片提前12 h配制，用油红O染色液染6 min，60%异丙醇分化，水洗后苏木素染色5 min，水洗到切片无色，切片入分化液中3 s后快速水洗，入返蓝液中3 s快速水洗，将切片上多余的水用滤纸擦干后用甘油明胶封片，封片后在显微镜下观察病变面积和斑块大小图像。

1.2.3 透射电镜下观察线粒体细胞形态的改变

小鼠麻醉后取出小鼠主动脉，确定取材部位，取组织体积约为1 mm³，浸入电镜固定液4 ℃固定2~4 h。缓冲液漂洗、脱水，每次15 min。组织脱水后包埋剂包埋、切片。铀铅双染色，切片室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察。

1.2.4 试剂盒检测Fe²⁺、GSH和MDA的水平

根据制造商说明，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠主动脉组织中GSH和MDA的水平。使用亚铁离子检测试剂盒评估血清亚铁离子水平。

1.2.5 Western blot评估小鼠主动脉ACSL4、xCT和GPX4蛋白表达情况

取各组小鼠主动脉约20 mg，在RIPA裂解液下充分裂解，12 000 r/min，20 min，4 ℃离心取上清，BCA测蛋白浓度。根据SDS‑PAGE凝胶配制试剂盒说明书进行制胶并分离蛋白（彩色上胶80 V，30 min；下层胶120 V，60 min），恒流200 mA将蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h， 4℃摇床孵育β‑actin（1∶10 000）、ACSL4（1∶1 000）、xCT（1∶1 000）、GPX4（1∶1 000）抗体过夜。室温摇床孵育羊抗兔HRP抗体（1∶50 000）1 h，1×TBST清洗。在ECL化学发光液下用天能化学发光仪对条带曝光，ImageJ测条带数值。

1.3 统计学处理

数据分析应用SPSS25.0软件，计量数据结果以\overline{x}\pm s表示，满足正态分布、方差齐用独立样本t检验，P<0.05为有统计学差异，作图采用软件Prism10.1.2。

2 结果

2.1 6‑G治疗对高脂饲料喂养的AS小鼠血脂水平影响

与喂食标准饲料的Con组比较，Mod组血清TC、TG、LDL‑C水平明显上调，HDL‑C水平下调（P<0.01）；与Mod组比较，6‑G和Fer‑1治疗后血清TC、TG、LDL‑C水平明显回落，HDL‑C水平回升（P<0.01）。见图1。

2.2 6‑G治疗对HFD喂养的ApoE^{（‑/‑）}小鼠主动脉粥样硬化病理变化影响

油红O染色结果表明：Con组主动脉壁光滑半透明，无红色脂质斑块形成；与Con组相比，Mod组主动脉壁附着大量红色脂质斑块；经6‑G和Fer‑1治疗后主动脉壁斑块明显减小，结果见图2。

2.3 6‑G治疗对高脂饲料喂养的ApoE^{（‑/‑）}小鼠主动脉线粒体形态的改变

Con组血管内皮细胞线粒体形态正常，嵴连续完整、清晰；Mod组内皮细胞见线粒体体积缩小、膜增厚、嵴消失、线粒体内空泡化；6‑G组及Fer‑1组内皮细胞大部分线粒体形态较好、嵴完整清晰，少量线粒体膜破损、嵴减少或消失，结果见图3。

2.4 6‑G治疗对高脂饲料喂养的ApoE^{（‑/‑）}小鼠血清Fe²⁺含量影响

与喂食标准饲料的Con相比，Mod组血清Fe²⁺水平明显上调（P<0.01）；与Mod组比较，6‑G和Fer‑1治疗后血清Fe²⁺水平明显回落（P<0.01），见图4。

2.5 6‑G治疗对高脂饲料喂养的ApoE^{（‑/‑）}小鼠主动脉抗氧化能力的影响

与喂食标准饲料的Con相比，Mod组血清MDA水平升高（P<0.01），GSH水平降低（P<0.01）；与Mod组比较，6‑G和Fer‑1治疗后血清MDA水平明显回落（P<0.01），GSH水平回升（P<0.05）。见图5。

2.6 6‑G治疗对AS小鼠主动脉ACSL4、xCT和GPX4蛋白表达水平影响

与Con组对比，Mod组ACSL4蛋白表达上调xCT、GPX4蛋白下调（P<0.01）；与Mod组对比，6‑G组及Fer‑1组ACSL4表达回落而xCT、GPX4蛋白表达回升（P<0.05）。见图6。

3 讨论

在AS中，铁大量沉积触发脂质谱改变、血管通透、持续的内皮活化，并引起氧化分子改变，共同加剧斑块发展^［14］。血管内皮细胞的损伤和功能失调发生在铁过载的情况下，过量的二价铁催化Fenton反应并产生大量的ROS，加速脂质过氧化致使氧化还原失衡，血管内皮细胞功能受损，最后引起AS铁死亡的发生^{［15，16］}。MDA为脂质过氧化的终产物，其表达情况直接说明脂质过氧化损伤程度。有研究证实，通过控制铁死亡，阻止血管内皮细胞脂质过氧化，减轻血管内皮细胞功能障碍并延缓AS^［17］。

ACSL4/xCT/GPX4通路是铁死亡的核心调控网络，其通过协调脂质代谢、铁稳态及氧化还原平衡影响铁死亡进程。酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）是铁死亡经典通路的重要生物学因子，可以酰化多不饱和脂肪酸以影响铁死亡，其过表达促进脂质过氧化底物的产生并抑制GPX4的活性导致氧化还原系统失衡加剧铁死亡进程^［18］。有研究表明，黄连素（berberine，BBR）通过靶向抑制ACSL4减轻动脉粥样硬化血管内皮细胞的铁死亡^［19］。另有证据证实，天麻素抑制ACSL4/LPCAT3通路的同时增强xCT/GPX4轴，明显降低了铁积累和脂质过氧化，抑制ROS并改善线粒体膜结构和功能，使线粒体膜电位降低、ROS水平降低和线粒体嵴形成增加^［20］。xCT/GSH/GPX4是抑制铁死亡发生的关键通路之一^［21］。SLC7A11（xCT）是系统Xc^-发挥功能的主要亚基，通过调控细胞内外胱氨酸与谷氨酸的转运抑制逆向转运蛋白的活性，抗氧化剂GSH产生减少、GPX4活性减低加剧铁死亡^［22］。另有研究证实，干涉系统Xc^-基因调节GSH和GPX4活性，改善氨基酸代谢失常，在防治成骨细胞铁死亡诱导的骨质疏松症（osteoporosis，OP）发挥不可替代的作用^［23］。GPX4为还原脂质氢过氧化物的酶，通过催化其底物GSH将脂质过氧化物还原为无毒性的脂质醇以终止脂质过氧化反应进程，从而负向调控细胞铁死亡的发生过程^［24］。GPX4、ACSL4和SLC7A11水平的进一步分析证实，油酸（oleic acid，OA）可通过GPX4/ACSL4通路抑制SDC4表达，促进A549细胞和H1299细胞铁死亡^［25］。有研究发现，鹰嘴豆芽素A（biochanin A，BCA）可以直接降低细胞内Fe²⁺浓度抑制铁沉积并靶向NRF2/System XC^-/GPX4信号通路降低ROS和脂质‑ROS水平以抑制脂质过氧化^［26］。血管软化丸经激活Nrf2下游胱氨酸转运蛋白系统Xc^-，增加目标基因GPX4表达，重塑氧化还原稳态并中和脂质过氧化毒性反应抑止血管内皮细胞铁死亡进程^［27］。

在本实验中，首先采用高脂饲料构建AS小鼠模型，在以铁死亡特异性抑制剂Fer‑1进行干预，评估ApoE^{（‑/‑）}小鼠中HFD诱导的AS中是否发生了铁死亡。研究结果显示，与Con组相比，Mod组脂质水平紊乱，动脉粥样硬化斑块明显增大，电镜下内皮细胞可见线粒体体积缩小、膜增厚、嵴消失、线粒体内空泡化；铁水平表达明显增高，抗氧化剂GSH减少、MDA产生增加，信号通路蛋白xCT和GPX4表达下降、ACSL4增加；与Mod组相比，Fer‑1组明显抑制血液中的脂质水平，明显减轻了HFD喂养的ApoE^{（‑/‑）}小鼠的动脉粥样硬化病变区域且电镜下内皮细胞大部分线粒体形态较好、嵴完整清晰、少量嵴消失以及Fer‑1的给药明显抑制了铁水平的表达，综合以上两部分结果说明铁死亡发生在HFD诱导的AS ApoE^{（‑/‑）}小鼠中，Fer‑1明显减轻AS的血脂异常和加重，有效地抑制了HFD诱导的AS ApoE^{（‑/‑）}小鼠铁死亡。此外，Fer‑1明显减轻抗氧化剂GSH的减少、MDA产生的增加，增强信号通路蛋白xCT和GPX4的表达并减少ACSL4。这说明Fer‑1缓解了脂质过氧化并调控了铁死亡ACSL4/xCT/GPX4通路。

生姜在古籍中有“行血痹”“破血滞痰凝”“解郁行血”“破血逐瘀”等记载，因其辛散的性质发挥活血化瘀之功用^［28］。在现代药理学中，6‑G是生姜中提取的的一种辛辣活性成分，在降血脂、抗血小板凝集、抗脂质过氧化、减轻氧化应激反应以及抗炎等方面发挥抗动脉粥样硬化作用^［29］。有学者指出，6‑G通过多途径、多靶点发挥抗动脉粥样硬化作用^{［30，31］}。本次实验中，与HFD喂养的ApoE^{（‑/‑）}小鼠相比，应用6‑G干预后，明显降低了血液中的脂质水平，小鼠动脉斑块明显减小、电镜下内皮细胞较多线粒体正常可见、少量线粒体膜未见增厚但有破损、嵴减少、铁水平表达明显降低，说明6‑G能减轻AS的血脂紊乱，缓解动脉粥样硬化斑块加重并抑制铁死亡发生。同时，6‑G增加了抗氧化剂GSH、减少MDA产生，信号通路蛋白xCT、GPX4的表达增加、ACSL4减少。此研究结果表明6‑G可以抑制脂质过氧化，并对通路信号蛋白的表达产生了明显的影响，并且此治疗过程中6‑G与Fer‑1治疗显示出相似的效果，提示6‑G可能通过调控ACSL4/xCT/GPX4通路减轻小鼠铁死亡水平和抑制脂质过氧化从而缓解动脉粥样硬化。

综上所述，本次研究通过动物实验初步验证，铁死亡参与AS病理过程，表现为脂质过氧化、线粒体损伤及ACSL4/xCT/GPX4通路异常。6‑G抑制铁死亡可能通过调控ACSL4/xCT/GPX4通路抑制的血管内皮中的脂质过氧化以重塑氧化还原稳态，同时改善血脂紊乱，双重抑制铁死亡和脂质过氧化来缓解AS。首次揭示6‑G通过多靶点协同调控铁死亡通路缓解AS，为天然药物防治心血管疾病提供新策略。

作者贡献度说明：

张曼：实验操作、数据处理、论文撰写与修改；王帅：论文选题和设计、论文指导、审阅与修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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