小胶质细胞中不同启动子驱动外源基因表达效率比较

摘要

为了开发适用于腺相关病毒（AAV）载体的改造，并具备高度神经细胞组织特异性的启动子，以实现AAV基因治疗药物对神经系统的精准靶向。本研究将巨细胞病毒（CMV）、鸡β-肌动蛋白（CBA）和含有CMV与CBA的复合启动子（CBH）共3种强启动子分别装入AAV载体中，研究三者在小胶质细胞中驱动外源基因表达的能力。体外合成CMV、CBA和CBH启动子序列，并克隆在pSCAAVEGFP载体上，构建了pLMV-EGFP、pLBA-EGFP和pLBH-EGFP共3个真核表达载体，分别用于驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）的表达。通过HB101感受态细胞转化得到重组质粒，在测序验证后转染到小鼠小胶质（BV2）细胞中。转染48 h后，荧光显微镜观察细胞中EGFP的表达情况，流式细胞仪和聚合酶链式反应（PCR）法检测EGFP的表达效率。结果表明3种启动子均可在BV2细胞内驱动外源基因表达，但启动效率存在差异。pLMV-EGFP转染后的EGFP阳性细胞百分数为4.92%，明显高于另外2种启动子。荧光定量PCR的结果与流式细胞仪检测结果一致，CMV对应细胞中的EGFP表达量最高、CBA次之、CBH最低。因此，CMV启动子在AAV载体上对小胶质细胞的专一性更好，可作为优选启动子用于神经系统基因治疗新药的开发，同时该结果也可为后续探索更多毒性弱、成本低的AAV基因治疗药物提供参考。

关键词

CBH启动子 / CBA启动子 / CMV启动子 / 小胶质细胞 / EGFP