基于CASFISH的检测染色体脆性位点表达的方法

摘要

染色体脆性位点是染色体上易发生断裂的一些特殊区域。常见脆性位点（CFSs）是最主要的脆性位点类型，其稳定性与癌症密切相关。传统的CFSs稳定性检测技术具有诸多局限性，限制了该领域研究工作的发展。本研究意在建立一种基于CRISPR/dCas9介导的荧光原位杂交（CASFISH）检测技术，以期提高检测CFSs表达的灵敏度和易操作性。以16号染色体FRA16D两侧的2个重复序列为靶标设计并制备了单链向导核糖核酸（sgRNA），利用纯化的GST-dCas9-EGFP和GST-dCas9-mCherry融合蛋白在U2OS细胞中开展CASFISH检测。结果显示，sgRNA/dCas9探针可以识别FRA16D两侧的脱氧核糖核酸（DNA），在细胞中实现FRA16D的成像观测。在诱导的复制压力下，双色荧光探针也可以定量检测FRA16D的断裂情况。在此工作基础上进一步优化将为在活细胞内观测CFSs表达的动态过程，研究DNA复制过程中CFSs的稳定性等工作提供便利。

关键词

染色体脆性位点 / CFSs / CRISPR/dCas9介导的荧光原位杂交