基于ctDNA与肠道微生态的中晚期非小细胞肺癌靶向及免疫治疗耐药机制研究

Study on the mechanism of resisance to targeted therapy and immune therapy in advanced non-small cell lung cancer based on ctDNA and gut microbiota

摘要

目的 针对中晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）靶向治疗和免疫治疗中普遍存在的原发或获得性耐药问题，通过整合外周血循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测与肠道微生态分析，系统探索不同治疗方案下的耐药机制，筛选耐药相关分子靶点与微生物标志物，构建多维度耐药预测模型，优化临床个体化治疗方案并验证其有效性与安全性。 方法 选取2022年1月—2024年12月在多家合作单位收治的中晚期NSCLC患者600例作为研究对象，其中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变阳性患者 100 例（EGFR-TKI靶向治疗组）、EGFR 阴性患者 200 例（免疫治疗组），另 300 例用于临床验证。采用基因测序技术检测肿瘤组织、外周血ctDNA的基因突变谱，通过核糖核酸测序（ribonucleic acid sequencing，RNA-seq）分析肿瘤微环境特征，利用16S扩增子测序解析肠道微生物群落结构。结合临床资料与随访数据总生存期（overall survival，OS）、无进展生存期（progression-free survival，PFS），对比分析原发性耐药组与获得性耐药组在基因变异、肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）、肠道微生物多样性等方面的差异，筛选耐药关键靶点与微生物群落，构建耐药预测模型，并在临床验证队列中评估新治疗方案的疗效。 结果 靶向治疗组100例患者中，原发性耐药23例（23.0%），获得性耐药77例（77.0%）。原发性耐药组中位PFS为1.8个月（95%CI：1.2~2.4个月），获得性耐药组为10.5个月（95%CI：8.6~12.4个月）（P<0.001）。ctDNA检测与组织活检的基因一致性达82.3%。获得性耐药组中EGFR T790M、EGFR C797S突变发生率显著高于原发性耐药组；间质上皮转化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）扩增、大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）突变发生率显著低于原发性耐药组（P<0.05）。免疫治疗组 200 例患者中，原发性耐药85例（42.5%），获得性耐药115例（57.5%）。原发性耐药组中位PFS为2.3个月，获得性耐药组为8.6个月（P<0.001）。获得性耐药组血液肿瘤突变负荷（blood tumor mutational burden，bTMB）水平显著高于原发性耐药组（P<0.001）；人类白细胞抗原杂合性缺失（human leukocyte antigen loss of heterozygosity，HLA LOH）发生率显著低于原发性耐药组（P<0.05）。肠道微生态方面，原发性耐药组微生物α多样性显著低于获得性耐药组，原发性耐药组中门水平拟杆菌门丰度升高、厚壁菌门丰度降低，属水平双歧杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属丰度降低、拟杆菌属丰度升高（均P<0.001）。共筛选出3个核心耐药分子靶点［EGFR C797S、MET、程序性死亡配体 1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）］与3组特征性肠道微生物群落（耐药抑制型：双歧杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属；耐药促进型：拟杆菌属）。基于上述标志物构建的多维度耐药预测模型曲线下面积（area under curve，AUC）值为0.895（95%CI：0.852~0.938），敏感度86.2%，特异度83.5%。基于上述发现优化的治疗方案在300例临床验证队列中，客观缓解率为47.6%，疾病控制率为82.3%，中位PFS为9.8个月，中位OS为21.5个月；3级及以上不良反应发生率为8.7%，安全性良好。 结论 ctDNA中的特定基因突变与肠道微生态的群落失衡共同介导了中晚期NSCLC的治疗耐药，基于多组学数据构建的耐药预测模型与优化治疗方案具有重要的临床应用价值，为实现患者个体化治疗提供了新的理论依据与技术支撑。

Abstract

Objective To address the common problem of primary or acquired resistance in patients with advanced non-small cell lung cancer （NSCLC） receiving epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor （EGFR-TKI） targeted therapy and immunotherapy， this study systematically explored the mechanisms of resistance under different treatment strategies by integrating peripheral blood circulating tumor DNA （ctDNA） detection with gut microecological analysis， identified resistance-related molecular targets and microbial biomarkers， constructed a multidimensional resistance prediction model， optimized individualized clinical treatment strategies， and validated their efficacy and safety. Methods A total of 600 patients with advanced NSCLC treated at multiple collaborating centers from January 2022 to December 2024 were enrolled. Among them， 100 patients with positive epidermal growth factor receptor （EGFR） mutations were assigned to the EGFR-TKI targeted therapy group， 200 EGFR-negative patients were assigned to the immunotherapy group， and an additional 300 patients were included for clinical validation. Gene sequencing was performed to detect mutation profiles in tumor tissues and peripheral blood ctDNA. Ribonucleic acid sequencing （RNA-seq） was used to analyze features of the tumor microenvironment， and 16S amplicon sequencing was used to characterize the structure of the gut microbial community. Combined with clinical data and follow-up outcomes， including overall survival （OS） and progression-free survival （PFS）， differences between the primary resistance group and the acquired resistance group were compared in terms of gene alterations， tumor mutational burden （TMB）， microsatellite instability （MSI）， and gut microbial diversity. Key resistance-related targets and microbial communities were identified， a resistance prediction model was established， and the efficacy of the new treatment strategy was evaluated in the clinical validation cohort. Results Among the 100 patients in the targeted therapy group， 23 （23.0%） had primary resistance and 77 （77.0%） had acquired resistance. The median PFS was 1.8 months （95%CI： 1.2―2.4 months） in the primary resistance group and 10.5 months （95%CI： 8.6―12.4 months） in the acquired resistance group （P<0.001）. The concordance rate between ctDNA testing and tissue biopsy was 82.3%. The frequencies of EGFR T790M and EGFR C797S mutations were significantly higher in the acquired resistance group than in the primary resistance group， whereas the frequencies of mesenchymal-epithelial transition factor （MET） amplification and Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog （KRAS） mutation were significantly lower than those in the primary resistance group （P<0.05）. Among the 200 patients in the immunotherapy group， 85 （42.5%） had primary resistance and 115 （57.5%） had acquired resistance. The median PFS was 2.3 months in the primary resistance group and 8.6 months in the acquired resistance group （P<0.001）. Blood tumor mutational burden （bTMB） was significantly higher in the acquired resistance group than in the primary resistance group （P<0.001）， whereas the incidence of human leukocyte antigen loss of heterozygosity （HLA LOH） was significantly lower （P<0.05）. In terms of gut microecology， microbial alpha diversity was significantly lower in the primary resistance group than in the acquired resistance group. At the phylum level， the abundance of Bacteroidetes was increased and that of Firmicutes was decreased in the primary resistance group. At the genus level， the abundances of Bifidobacterium and Akkermansia muciniphila were decreased， whereas the abundance of Bacteroides was increased （all P<0.001）. Three core resistance-related molecular targets ［EGFR C797S， MET， and programmed cell death ligand 1 （PD-L1）］ and three characteristic gut microbial groups were identified， including resistance-suppressing taxa （Bifidobacterium and Akkermansia muciniphila） and a resistance-promoting taxon （Bacteroides）. The multidimensional resistance prediction model based on these biomarkers achieved an area under the ROC curve （AUC） of 0.895 （95%CI： 0.852―0.938）， with a sensitivity of 86.2% and a specificity of 83.5%. In the 300-patient clinical validation cohort， the optimized treatment strategy achieved an objective response rate of 47.6%， a disease control rate of 82.3%， a median PFS of 9.8 months， and a median OS of 21.5 months. The incidence of grade 3 or higher adverse events was 8.7%， indicating good safety. Conclusion Specific gene mutations detected in ctDNA and dysbiosis of the gut microecological community jointly mediate treatment resistance in advanced NSCLC. The resistance prediction model and optimized treatment strategy constructed based on multi-omics data have important clinical application value and provide a new theoretical basis and technical support for individualized treatment.

Graphical abstract

关键词

癌，非小细胞肺 / 循环肿瘤 DNA / 抗药性，多药 doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2026.06.002

Key words

carcinoma， non-small-cell lung / circulating tumor DNA / drug resistance， multiple

肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总数的80%~85%，超过60%的患者确诊时已处于中晚期，失去手术根治机会^［1］。随着精准医疗发展，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）靶向治疗与免疫治疗已成为中晚期NSCLC核心治疗手段，显著改善患者生存预后^［2］。但治疗耐药严重制约疗效，EGFR-TKI治疗中10%~20%患者存在原发性耐药，其余多在6~18个月出现获得性耐药；免疫治疗仅20%~40%患者敏感，多数患者存在原发或获得性耐药^［3］。目前耐药研究多集中于单一组学层面，循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测多聚焦单一基因突变，缺乏多靶点协同分析^［4-5］；肠道微生态研究多局限于免疫治疗，与靶向治疗耐药关联不明，且未关注二者协同作用^［6］。现有预测模型多基于单一指标，预测效能有限，缺乏个体化方案优化与临床验证。本研究整合ctDNA检测、肿瘤微环境分析与肠道微生态测序，系统解析中晚期NSCLC靶向及免疫治疗耐药机制，明确基因突变与菌群失衡作用，筛选核心耐药标志物并构建预测模型，优化临床方案并验证有效性与安全性，为耐药预警和个体化治疗提供新理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2022年1月—2024年12月在多家合作单位就诊的中晚期NSCLC患者600例，所有患者均经病理组织学或细胞学确诊为NSCLC，TNM分期为ⅢB~Ⅳ期。根据EGFR基因状态与治疗方案分为3组：EGFR-TKI靶向治疗组（n=100）：EGFR基因敏感突变（19外显子缺失、21外显子L858R突变等），接受EGFR-TKI治疗（一代：吉非替尼、厄洛替尼；二代：阿法替尼、达克替尼；三代：奥西替尼、伏美替尼、阿美替尼）；免疫治疗组（n=200）：EGFR基因野生型，无ALK、ROS1等驱动基因突变，接受免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICI）治疗，可联合或不联合化疗；临床验证组（n=300）：符合中晚期NSCLC诊断标准，经筛选后纳入基于本研究耐药机制优化的治疗方案，包括靶向联合抗血管治疗、免疫联合化疗+微生物制剂等。

纳入标准：①年龄18~75岁；②病理确诊为NSCLC，TNM分期ⅢB~Ⅳ期；③EGFR-TKI靶向治疗组需经组织或血液检测证实存在EGFR敏感突变，免疫治疗组需证实无驱动基因突变；④东部肿瘤协作组体力状态评分0~2分；⑤预计生存期≥3个月；⑥肝肾功能、血常规等主要器官功能基本正常，能够耐受研究相关治疗与检测。排除标准：①合并其他恶性肿瘤病史；②存在严重的心肺、肝、肾、造血系统等基础疾病，无法耐受治疗或检测；③活动性感染（如肺炎、肝炎等）、自身免疫性疾病病史或正在接受免疫抑制剂治疗；④妊娠或哺乳期女性；⑤既往接受过靶向治疗或免疫治疗者。

本研究经河北医科大学第四医院伦理委员会批准通过（批准文号：2021KY133）。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料与样本收集

通过电子病历系统收集所有患者的一般临床资料，包括性别、年龄、吸烟史、病理诊断及免疫组织化学结果、肿瘤分期、治疗方案等；采用RECIST 1.1标准评估治疗效果，分为完全缓解（complete response，CR）、部分缓解（partial response，PR）、疾病稳定（stable disease，SD）和疾病进展（progression disease，PD）。样本收集包括：基线样本（治疗前采集肿瘤组织样本，同时采集外周血10 mL、粪便样本5 g）；治疗中样本（EGFR-TKI靶向治疗组患者用药2个月时采集外周血10 mL，免疫治疗组患者用药3个月时采集外周血10 mL）；疾病进展样本（出现疾病进展时，再次采集外周血10 mL与粪便样本5 g）。样本处理：外周血采集后2 h内离心分离血浆与外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），血浆用于ctDNA提取；肿瘤组织样本分为2个部分，一部分用于病理检测，另一部分迅速置于-80 ℃冷冻保存；粪便样本采集后立即置于无菌冻存管中，-80 ℃冷冻保存。

1.2.2 分组标准

根据治疗效果与疾病进展情况，将EGFR-TKI靶向治疗组与免疫治疗组患者进一步分为原发性耐药组与获得性耐药组，原发性耐药组：治疗2个周期后疗效评价为PD，或治疗1个月内出现疾病快速进展；获得性耐药组：治疗初期达到CR、PR或SD疗效持续≥6个月，但在后续治疗过程中出现疾病进展。

1.2.3 核酸提取与测序

基因组DNA提取采用Qiagen基因组DNA提取试剂盒，ctDNA提取采用Thermo Fisher Scientific ctDNA提取试剂盒，RNA提取采用TaKaRa RNA提取试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。基因测序：对肿瘤组织基因组DNA、PBMC基因组DNA与ctDNA进行测序，构建测序文库后采用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行高通量测序，测序数据经质量控制后进行体细胞突变检测等分析。RNA-seq测序：对肿瘤组织总RNA进行双端测序，数据经质量控制后进行基因表达定量、差异表达基因筛选等分析。16S扩增子测序：采用16S rRNA基因V3~V4区特异性引物对粪便样本中的微生物DNA进行PCR扩增，扩增产物经验证后进行高通量测序，数据经处理后进行OTU聚类分析、物种分类注释等。

1.2.4 临床随访

所有患者从治疗开始后进行定期随访，随访方式包括门诊随访、电话随访等，随访周期为：治疗前3个月每4周随访1次，3~12个月每8周随访1次，1年后每12周随访1次，直至患者死亡或研究结束。随访内容包括体格检查、血常规、血生化、肿瘤标志物检测、影像学检查、不良反应发生情况记录。主要随访终点为无进展生存期（progress free survival，PFS）与总生存期（overall survival，OS）。

1.2.5 临床验证方案

基于耐药机制研究结果，筛选核心耐药靶点与微生物标志物，优化临床治疗方案，在300例临床验证组患者中开展单臂临床试验。根据患者的ctDNA检测结果与肠道微生态特征制定个体化治疗方案，主要有效性指标为客观缓解率（objective response rate，ORR）与PFS，次要有效性指标为疾病控制率（disease control rate，DCR）、OS，安全性指标为治疗相关不良反应发生率。

1.3 统计学方法

应用SPSS 26.0统计软件与R 4.2.0软件分析数据。正态分布的计量资料以\overline{x}±s表示，比较采用t检验、单因素方差分析；计数资料以例数（%）表示，比较采用χ²检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，生存曲线比较采用Log-rank检验；多因素分析采用Cox比例风险回归模型；相关性分析采用Pearson相关或Spearman相关分析；耐药预测模型构建采用LASSO回归分析与受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

2.1 研究对象基线特征

本研究共纳入中晚期NSCLC患者600例，其中EGFR-TKI靶向治疗组100例、免疫治疗组200例、临床验证组300例。3组在性别、年龄、吸烟史、肿瘤分期、病理类型、东部肿瘤协作组评分等基线特征方面差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 EGFR-TKI靶向治疗耐药机制分析

2.2.1 临床疗效比较

EGFR-TKI靶向治疗组100例患者中，原发性耐药组23例（23.0%），获得性耐药组77例（77.0%）。原发性耐药组的中位PFS为1.8个月（95%CI：1.2~2.4个月），获得性耐药组患者的中位PFS为10.5个月（95%CI：8.6~12.4个月），2组比较差异有统计学意义（Log-rank χ²=89.632，P<0.001）（图1）。

2.2.2 基因突变特征

基因测序结果显示，EGFR-TKI靶向治疗组肿瘤组织与ctDNA的基因检测一致性为82.3%（82/100）。获得性耐药组中EGFR T790M和EGFR C797S突变发生率显著高于发性耐药组，MET扩增、KRAS突变发生率显著低于原发性耐药组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。典型获得性耐药患者治疗前ctDNA检测仅见EGFR 19外显子缺失，疾病进展时新增T790M突变（图2，3）。

2.3 免疫治疗耐药机制分析

2.3.1 临床疗效比较

免疫治疗组200例患者中，原发性耐药组85例（42.5%），获得性耐药组115例（57.5%）。原发性耐药组的中位PFS为2.3个月（95%CI：1.8~2.8个月），获得性耐药组的中位PFS为8.6个月（95%CI：7.5~9.7个月），差异有统计学意义（Log-rank χ²=98.745，P<0.001）（图4）。

2.3.2 ctDNA相关指标

免疫治疗组患者ctDNA检测结果显示，获得性耐药组bTMB水平和PD-L1表达阳性率显著高于原发性耐药组，人类白细胞抗原杂合性缺失（human leukocyte antigen loss of heterozygosity，HLA LOH）发生率显著低于原发性耐药组，差异有统计学意义（P<0.001），见表3。获得性耐药组疾病进展时，JAK2、STAT3、TNF、IL6R、NFKB1等炎症通路相关基因的突变发生率显著升高，肿瘤新生抗原相关基因的突变频率显著降低（P<0.05）（图5）。

2.3.3 肠道微生态特征

16S扩增子测序结果显示，α多样性分析显示，获得性耐药组的Shannon指数（4.2±0.8）显著高于原发性耐药组（2.8±0.6）（t=12.845，P<0.001），Simpson指数（0.18±0.08）显著低于原发性耐药组（0.35±0.12）（t=11.273，P<0.001），差异有统计学意义，Shannon指数越高、Simpson指数越低表示微生物多样性越高。Beta多样性分析显示，2组肠道微生物群落聚类明显分离，差异有统计学意义（ANOSIM，R=0.382，P<0.001）（图6）。物种分类注释显示，门水平上，获得性耐药组拟杆菌门、变形菌门丰度低于原发性耐药组，厚壁菌门、放线菌门丰度高于原发性耐药组，差异有统计学意义（P<0.001）；属水平上，获得性耐药组双歧杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属、粪杆菌属丰度高于原发性耐药组，拟杆菌属丰度低于原发性耐药，差异有统计学意义（P<0.001），见表4。功能注释分析显示，原发性耐药组高表达：脂多糖合成、炎症反应相关通路； 获得性耐药组高表达：短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）合成相关通路：SCFA包括丁酸盐、丙酸盐、乙酸盐，具有抗炎和免疫调节作用 。原发性耐药组肠道微生物中与脂多糖合成、炎症反应相关的功能通路丰度显著升高，与SCFA合成相关的功能通路丰度显著降低（P<0.05）（图7）。

2.4 耐药标志物筛选与预测模型构建

2.4.1 耐药标志物筛选

为筛选免疫治疗耐药相关标志物，将200例免疫治疗组按治疗疗效分为敏感组和耐药组，敏感组为治疗后达到CR、PR或SD持续≥6个月，即获得性耐药患者；耐药组为对免疫治疗原发耐药患者。采用LASSO回归分析筛选出3个核心耐药分子靶点：EGFR C797S、MET、PD-L1，结果显示，耐药组中EGFR C797S、MET扩增的突变频率均显著高于敏感组，PD-L1阳性表达率显著低于敏感组，差异有统计学意义（P<0.001），见表5。通过差异菌群分析与相关性分析，筛选出2组肠道微生物标志物：耐药抑制型菌群（双歧杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属，丰度与免疫治疗疗效呈正相关（r=0.625、0.587，P<0.001）；耐药促进型菌群（拟杆菌属，丰度与免疫治疗疗效呈负相关（r=―0.532，P<0.001）。

2.4.2 多维度耐药预测模型

基于3个分子靶点与3种肠道微生物标志物，多维度模型纳入EGFR C797S突变、MET扩增、PD-L1表达、双歧杆菌属丰度、嗜黏蛋白阿克曼菌属丰度及拟杆菌属丰度。采用Logistic回归分析构建多维度耐药预测模型。ROC曲线分析显示，该模型的AUC值为0.895（95%CI：0.852~0.938），敏感度为86.2%，特异度为83.5%。单一标志物的预测效能分别为：EGFR C797S突变的AUC为0.682（敏感度58.8%，特异度77.4%），MET扩增的AUC为0.638（敏感度42.4%，特异度85.2%），PD-L1表达的AUC为0.712（敏感度67.8%，特异度74.6%），双歧杆菌属丰度的AUC为0.695（敏感度71.8%，特异度67.0%），嗜黏蛋白阿克曼菌属丰度的AUC为0.658（敏感度62.4%，特异度69.6%），拟杆菌属丰度的AUC为0.621（敏感度55.3%，特异度68.7%）。多维度模型的预测效能显著优于任一单一标志物（图8）。

2.5 临床验证结果

2.5.1 有效性评估

300例临床验证组中位随访时间为12.5个月，治疗效果评估显示：ORR为47.6%（143/300），其中CR为5.3%（16/300），PR为42.3%（127/300），SD为34.7%（104/300），PD为17.7%（53/300），DCR为82.3%（247/300）；中位PFS为9.8个月（95%CI：8.9~10.7个月），中位OS为21.5个月（95%CI：19.8~23.2个月）。亚组分析显示，靶向联合抗血管治疗组的中位PFS为11.2个月（95%CI：9.8~12.6个月），免疫联合化疗+微生物制剂组的中位PFS为8.5个月（95%CI：7.3~9.7个月），均显著优于传统治疗方案的历史数据（P<0.05）（图9）。

2.5.2 安全性评估

临床验证组治疗相关不良反应发生率为68.7%（206/300），其中3级及以上不良反应发生率为8.7%（26/300），主要包括高血压、腹泻、皮疹、免疫相关肺炎等，无治疗相关死亡事件发生。不良反应经对症治疗后均得到缓解或控制，患者耐受性良好，见表5。

3 讨　　论

本研究通过对100例EGFR阳性、200例EGFR阴性中晚期NSCLC患者的多组学分析及300例临床验证，系统揭示了靶向及免疫治疗的耐药机制，筛选出核心耐药标志物并构建了多维度预测模型，优化了临床治疗方案。EGFR-TKI可特异性结合EGFR酪氨酸激酶域，阻断下游信号通路抑制肿瘤增殖转移，对EGFR敏感突变患者客观缓解率达50%~80%；免疫治疗通过解除免疫抑制激活自身抗肿瘤免疫，为EGFR野生型患者带来新方向，5年生存率较传统化疗提升35倍^［7］。已知EGFR通路二次突变、旁路通路激活、TMB降低、HLA LOH、PD-L1等均为介导耐药的重要因素^［8］。研究^［9-12］显示双歧杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属等可提高ICI治疗效果，菌群失衡可能通过诱发慢性炎症、抑制抗肿瘤免疫介导免疫治疗耐药，但相关研究仍存在局限，难以满足临床精准预警需求。本研究结果显示，EGFR-TKI靶向治疗的原发性耐药发生率为23.0%，获得性耐药发生率为77.0%，与既往研究^［13］报道一致。获得性耐药组中，EGFR基因二次突变（T790M、C797S）是主要机制，T790M突变通过改变EGFR酪氨酸激酶域空间结构降低药物结合亲和力，C797S突变则破坏与三代TKI的共价结合位点，这与奥西替尼耐药机制的研究结论相符^［14-17］。原发性耐药组中，MET扩增与KRAS突变是关键驱动因素，MET扩增可激活PI3K-AKT通路绕过EGFR抑制，KRAS突变则通过RAS-RAF-MEK-ERK通路独立驱动肿瘤进展，同时肿瘤微环境中M2型巨噬细胞与CAF的高浸润形成免疫抑制性微环境，进一步加剧耐药^［18-20］。ctDNA与组织活检的基因一致性达82.3%，证实其可作为组织活检的有效补充，动态监测耐药突变的出现，为治疗方案调整提供依据^［21］。

免疫治疗组中，原发性耐药发生率为42.5%，获得性耐药发生率为57.5%，PD-L1水平与免疫治疗疗效密切相关，原发性耐药组bTMB显著低于获得性耐药组，PD-L1阳性患者治疗应答率更高。HLA LOH通过影响肿瘤新生抗原呈递介导原发性耐药^［22］，获得性耐药患者疾病进展时JAK2、STAT3等炎症通路基因突变升高，抑制T细胞活化并重塑免疫微环境^［23-24］。肠道微生态方面，原发性耐药组微生物多样性降低，双歧杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属等有益菌丰度下降，拟杆菌属丰度升高，有益菌可通过产生短链脂肪酸增强抗肿瘤免疫，而拟杆菌属可能通过脂多糖诱发慢性炎症抑制免疫，这一发现丰富了免疫治疗耐药的机制研究。

本研究筛选的3个分子靶点（EGFR C797S、MET、PD-L1）与3种肠道微生物标志物构建的预测模型AUC值达0.895，具有良好的预测效能。基于耐药机制优化的个体化治疗方案在300例临床验证中取得显著效果，ORR达47.6%，中位PFS延长至9.8个月，3级及以上不良反应发生率仅8.7%，安全性良好。靶向联合抗血管治疗、免疫联合化疗+微生物制剂等方案为耐药患者提供了新的治疗选择，与相关研究中联合治疗的优势一致。

本研究存在一定局限性：样本主要来源于河北省内医院，可能存在地域局限性；肠道微生态分析仅采用16S扩增子测序，未深入分析代谢产物；随访时间有限，需长期随访评估对总生存期的影响。未来需开展全国多中心临床试验，结合宏基因组测序与代谢组学技术，进一步优化预测模型，探索益生菌制剂、粪菌移植等肠道微生物干预手段及新型靶向药物的联合治疗策略，将ctDNA动态监测与肠道微生态分析纳入临床常规，实现中晚期NSCLC患者的全程个体化管理。

综上所述，ctDNA中的特定基因突变（如EGFR T790M、C797S突变，MET扩增，bTMB降低等）与肠道微生态的群落失衡（双歧杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属丰度降低，拟杆菌属丰度升高）共同介导了中晚期NSCLC的治疗耐药^［25-26］。基于多组学数据筛选的耐药标志物与构建的多维度预测模型具有良好的预测效能，优化后的个体化治疗方案在临床验证中表现出显著的有效性与安全性，为中晚期NSCLC患者的耐药预警与个体化治疗提供了新的理论依据与技术支撑。

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基金资助

河北省重点研发计划项目(21377703D)