慢性乙型病毒性肝炎肠道菌群综合指标与血小板及肝纤维化的相关性研究

A study on the correlation of comprehensive gut microbiota indicators with platelets and liver fibrosis in chronic hepatitis B

摘要

目的 探讨慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）肠道菌群综合指标与血小板（platelet，PLT）及肝纤维化的分层关联，阐明乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）阳性/高病毒载量亚组的特异性关联模式（本研究为横断面相关性分析，不构成因果结论，机制推测有待进一步验证），为CHB肝纤维化的临床评估提供参考。 方法 选取2022年8月—2024年5月在河北中石油中心医院未接受抗病毒治疗CHB患者111例，按HBeAg状态分为阳性组（42例）与阴性组（69例）。收集患者临床资料，检测肝功能、血常规、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸载量（hepatitis B virus DNA，HBV DNA）及肝脏硬度值（liver stiffness measurement，LSM）等，按HBeAg状态及病毒载量分层分析PLT与LSM关联。通过16S rRNA测序分析患者粪便样本肠道菌群，基于功能权重构建菌群综合指标［Index=0.5×中心对数比变换（centered log-ratio transformation，CLR）（普雷沃菌属）+0.3×CLR（拟杆菌属）+0.2×CLR（粪杆菌属），反映核心菌属功能协同效应］，采用Spearman相关分析该指标与临床指标相关性。 结果 2组基线资料具有可比性（P＞0.05）。实验室指标分析显示，HBeAg阳性组HBV DNA载量及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆汁酸（total bile acid，TBA）水平显著高于阴性组（均P<0.05）；其余肝功能、血常规指标及LSM比较差异无统计学意义（P＞0.05）。分层分析证实，PLT与LSM的负相关仅存在于HBeAg阳性/高病毒载量亚组（r_s=-0.328和-0.570，P<0.05），其余亚组未显示明显相关性（P>0.05）。16S rRNA测序结果显示，2组优势菌属一致，单一优势菌属丰度差异无统计学意义（P>0.05）。Index在全队列中仅与PLT呈负相关（r_s=-0.370，P=0.024），与其余指标未显示明显相关性（P>0.05）。 结论 HBeAg阳性/高病毒载量的CHB患者中，PLT与LSM显著负相关，提示该亚组PLT或可作为肝纤维化潜在评估指标。Index与PLT特异性负相关，单一菌属无差异，表明肠道菌群整体结构而非单个菌属与PLT减少相关。肠道菌群、PLT、肝纤维化三者存在分层关联特征，可为该亚群肝纤维化的精准评估提供新思路。

Abstract

Objective To investigate the stratified associations of comprehensive gut microbiota indicators with platelet （PLT） and liver fibrosis in patients with chronic hepatitis B （CHB）， and to elucidate the specific correlation patterns within subgroups defined by hepatitis B e antigen （HBeAg） positivity/high viral load （as a cross-sectional correlation analysis， this study does not establish causality， and mechanistic speculations require further validation）， so as to provide references for the clinical assessment of liver fibrosis in CHB. Methods A total of 111 untreated CHB patients from August 2022 to May 2024 at Hebei PetroChina Central Hospital in Langfang， were selected and divided into HBeAg-positive group （n=42） and HBeAg-negative group （n=69） according to HBeAg status. Clinical data， liver function parameters， complete blood counts （CBC）， hepatitis B virus DNA （HBV DNA） levels， and liver stiffness measurements （LSM） were collected. The association between PLT and LSM was analyzed across strata defined by HBeAg status and viral load. Gut microbiota composition was profiled using 16S rRNA sequencing. A comprehensive microbiota index was constructed based on functional weights ［Index=0.5×centered log-ratio transformation （CLR） of Prevotella+0.3×CLR of Bacteroides + 0.2×CLR of Faecalibacterium， reflecting the functional synergistic effect of core bacterial genera］. Spearman correlation analysis was employed to assess the association between this index and clinical indicators. Results Baseline data were comparable between the two groups （P>0.05）. Laboratory analysis showed that the HBeAg-positive group had significantly higher levels of HBV DNA， alkaline phosphatase （ALP）， and total bile acid （TBA） compared with the HBeAg-negative group （all P＜0.05）. No significant differences were observed in liver function parameters， routine blood test， or LSM （P>0.05）. Stratified analysis revealed a significant negative correlation between PLT and LSM exclusively in the HBeAg-positive/high viral load subgroup （r_s=-0.328 and -0.570 respectively； P＜0.05）， which was not evident in other subgroups （P>0.05）. 16S rRNA sequencing indicated consistent dominant genera between the two groups， with no significant differences in the abundance of individual dominant genera （P>0.05）. Notably， the comprehensive microbiota index correlated significantly only with PLT levels across the entire cohort （r_s=-0.370， P=0.024）， but not with other clinical indicators （P>0.05）. Conclusion In CHB patients with HBeAg positivity or high viral load， PLT exhibits a significant negative correlation with LSM， suggesting that PLT may serve as a potential biomarker for assessing liver fibrosis in this specific subgroup. The specific inverse correlation between the index and PLT—despite the absence of differences in single genera—indicates that alterations in the overall gut microbiota structure， rather than individual taxa， are associated with thrombocytopenia. These findings reveal a stratified association pattern among gut microbiota， PLT， and liver fibrosis， offering novel insights for the precise evaluation of liver fibrosis in this patient population.

Graphical abstract

关键词

乙型肝炎，慢性 / 肠道菌群 / 血小板 / 肝纤维化 doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2026.06.005

Key words

hepatitis B， chronic / gut microbiota / platelets / liver fibrosis

慢性乙型肝炎病毒（chronic hepatitis B，CHB）是全球亟待攻克的重大公共卫生挑战，由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持续感染导致。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）数据^［1］显示，2019年全球一般人群乙肝表面抗原流行率达3.8%，年新发HBV感染病例约150万例，累计慢性HBV感染者已达2.96亿，每年因HBV感染相关并发症（包括肝衰竭、肝硬化及肝细胞癌）死亡的人数高达82万。慢性HBV感染持续进展会逐步引发肝硬化、肝癌等严重结局，给社会医疗体系及患者家庭带来沉重的负担。《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》^［2］明确提出，CHB可依据乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）表达状态分为HBeAg阳性与HBeAg阴性两类。作为HBV复制的核心血清学标志物，HBeAg状态直接反映病毒复制活性与疾病预后；HBeAg阳性通常伴随高病毒载量、活跃的肝脏炎症，且肝纤维化、肝硬化进展风险显著升高；而HBeAg血清学转化后，病毒复制多受抑制，临床结局明显改善。二者显著的疾病表型差异提示，HBeAg状态不同的CHB在临床特征与疾病进程上存在明显区别。因此深入解析其特异性分子与病理特征，是实现CHB精准管理的关键前提。近年来，“肠―肝轴”在慢性肝病进展中的调控作用已成为研究热点。肠道菌群失调可通过破坏肠道屏障完整性、促进细菌及内毒素易位，激活肝脏局部免疫炎症反应，最终加剧肝损伤与纤维化进程^［3］。已有研究^［4］显示CHB患者存在肠道菌群紊乱，且菌群结构改变与疾病严重程度密切相关，例如肝硬化伴腹水患者厚壁菌门丰度显著降低、变形菌门丰度升高，肠杆菌科细菌丰度与Child-Pugh评分呈正相关。然而，现有研究仍存在明显缺口：一方面，关于HBeAg表达差异是否会导致肠道菌群呈现特异性特征，相关研究尚为匮乏；另一方面，多数研究聚焦于菌群整体多样性或单一菌属的孤立变化，缺乏从“核心菌群功能协同”角度出发，探讨其与CHB关键临床表现（尤其不同病毒复制状态下）的特异性关联。中心对数比变换（centered log-ratio transformation，CLR）^［5］等组成型数据校正方法的应用，为基于核心菌属构建综合功能指标提供了可能——通过整合关键菌属的相对优势特征，构建能够反映菌群功能群落整体状态的综合指数，不仅能克服单一菌属分析的局限性，也更贴近“肠―肝轴”中菌群协同调控慢性肝病关键指标的关联提供了新的视角。慢性肝病患者中血小板（platelet，PLT）减少症的患病率较高，其中慢性肝炎阶段为6%~16%，进展至肝硬化期可高达78%^［6］。在慢性乙型肝炎人群中，PLT减少的发生率随肝纤维化进展和肝功能恶化逐渐升高，PLT计数与肝纤维化严重程度、Child-Pugh评分呈显著负相关，多项研究证实其是肝纤维化进展的独立预测指标。基于上述研究背景与现有缺口，本研究提出核心假设：CHB患者肠道菌群整体结构可能与PLT水平存在关联，而PLT水平与肝纤维化进程的关联可能受病毒复制状态调控，肠―肝轴可能参与上述过程。为验证该相关性假设，本研究创新性构建反映核心优势菌属协同作用的肠道菌群综合指标（Index），分析其与PLT的关联；并探讨HBeAg状态及病毒载量对PLT与肝纤维化关联的影响，明确三者在CHB患者中的分层相关特征，为CHB肝纤维化的临床评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究采用横断面研究设计，选取2022年8月—2024年5月河北中石油中心医院门诊及住院CHB患者111例作为研究对象。根据HBeAg状态分为阳性组与阴性组，HBeAg阳性组共42例，其中男性27例，女性15例；年龄35.5~44.75岁，中位年龄38（9.3）岁；HBeAg阴性组共69例，其中男性30例、女性39例；年龄36~51岁，中位年龄43（15.0）岁。纳入标准：①年龄18~65岁；②符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》的CHB诊断标准；③入组前6个月内未接受过任何抗病毒治疗。排除标准：①入组前1个月内服用过可能影响肠道菌群的相关药物，包括抗菌药物、益生元、益生菌、合生元、质子泵抑制剂、抗乙型肝炎病毒药物及促胃肠道动力药物等；②合并其他肝脏相关疾病，包括其他病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化或肝癌；③合并全身性基础疾病或严重器质性疾病，包括糖尿病、炎症性肠病、恶性肿瘤、严重心脑血管疾病、肾功能不全及免疫缺陷病等；④处于妊娠或哺乳期的女性患者。

本研究已通过河北中石油中心医院伦理委员会审查批准（批准文号：2022013014）。所有研究对象均在充分了解本研究目的、流程及潜在风险后，自愿签署书面知情同意书，研究过程全程保护患者隐私。

1.2 临床资料

1.2.1 临床资料与实验室检测

收集研究对象人口学资料及临床基线信息。所有受试者均于清晨空腹状态下采集外周静脉血，严格按照实验室标准操作规程完成标本处理与检测。采用全自动血液分析仪完成血常规检测，检测指标包括白细胞（white blood cell，WBC）、中性粒细胞（neutrophil，Neu）、红细胞（red blood cell，RBC）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、PLT。采用全自动生化分析仪检测肝功能相关指标，具体包括丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）、γ-谷氨酰转移酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、直接胆红素（direct bilirubin，DBIL）、总胆汁酸（total bile acid，TBA）。采用化学发光法检测乙型肝炎病毒血清学标志物（包含HBeAg）；采用荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸载量（hepatitis B virus DNA，HBV DNA）。

1.2.2 肝脏硬度检测

采用FibroScan® 502瞬时弹性成像系统检测肝脏硬度，由固定资深医师按照统一操作、统一流程规范操作，选用M型探头（探头频率3.5 MHz），检测前患者空腹并取仰卧位。参照国际通用质控标准，所有检测均满足以下质控要求：有效检测次数≥10次，检测成功率≥60%，且肝脏硬度值四分位数间距与中位数比值（QR/M）≤0.30。对未达上述质控标准者予以重新检测，仍不达标者视为无效结果予以剔除。最终以肝脏硬度测量值中位数作为肝脏硬度值（liver stiffness measurement，LSM），用于肝纤维化程度评估。

1.2.3 粪便标本采集与肠道菌群测序分析

收集患者新鲜粪便标本，为减少药物及饮食对肠道菌群结构的干扰，标本采集要求与研究纳入及排除标准一致：采集前1个月内未使用抗菌药物、益生元/益生菌、抗病毒药物、质子泵抑制剂及促胃肠动力药物；采集前1周内保持日常清淡饮食，避免高脂、高纤维等特殊饮食。采用E.Z.N.A.Stool DNA Kit（Omega Bio-tek，USA）提取粪便样本基因组DNA，使用Nanodrop 2000分光光度计检测DNA浓度与纯度，合格样本于-20 ℃条件下保存备用。以细菌16S rRNA基因V3–V4高变区为扩增靶区域，采用带有8 bp barcode的通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）与806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）进行PCR扩增。扩增体系总体积25 μL，包含30 ng DNA模板、上下游引物各1 μL、BSA 3 μL、2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL及ddH₂O 5.5 μL。扩增程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s、55 ℃退火50 s、72 ℃延伸45 s，共28个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后，使用Agencourt AMPure XP试剂盒进行纯化；采用NEB Next Ultra Ⅱ DNA Library Prep Kit构建测序文库，经Agilent 2100 Bioanalyzer与实时荧光定量PCR进行文库质量质控。质检合格后，在Illumina测序平台采用PE250/PE300模式完成高通量测序。对下机原始数据依次进行样本拆分、序列拼接、低质量数据过滤及嵌合体去除。以97%序列相似性为阈值将高质量序列聚类为操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU），基于Silva 138数据库完成物种分类注释。最终提取属水平物种相对丰度数据，并选取相对丰度排名前三的优势菌属用于后续统计分析。

1.3 肠道菌群数据检测

采用TBtools软件进行整理与可视化分析。基于所有慢乙肝患者肠道菌群测序结果，筛选相对丰度位居前三位的菌属（粪杆菌属、拟杆菌属、普雷沃菌属）纳入后续分析，并以箱线图展示其相对丰度分布，以中位数描述集中趋势，四分位距反映离散程度。为消除微生物组数据的成分偏倚，对上述3种菌属的相对丰度进行CLR转换^［5］后，再按上述方法进行组间差异比较。

基于全队列中上述3种优势菌属的相对丰度，参考曹海涛^［7］提出的基于功能重要性的加权分配策略，采用预设权重（0.5∶0.3∶0.2），对经CLR转换后的菌属丰度构建肠道菌群综合指标（Index），计算公式为：Index=0.5×CLR（普雷沃菌属）+0.3×CLR（拟杆菌属）+0.2×CLR（粪杆菌属），该权重设置依据各菌属在肠道代谢及免疫调节中的预设功能重要性进行分配。

采用Spearman等级相关分析肠道菌群综合指标（Index）与各临床指标的相关性，计算其系数及对应的P值。同时根据HBeAg状态、HBV DNA载量进行分层，在各亚组内行亚组分析，探讨PLT水平与LSM的相关性。

1.4 统计学方法

应用SPSS 25.0统计软件分析数据。计量资料先进行正态性检验：符合正态分布的以\overline{x}±s表示，组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布者以M（QR）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以例数（%）表示，组间比较用χ²检验或Fisher确切概率法。采用Spearman等级相关分析肠道菌群综合指标（Index）与各临床指标的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

2.1 患者基线特征与临床指标比较

本研究共纳入CHB患者111例，其中HBeAg阳性组42例（37.84%），HBeAg阴性组69例（62.16%）。2组患者年龄、性别构成比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。2组临床指标比较结果见表1。HBeAg阳性组血清HBV DNA载量、TBA、ALP水平均显著高于HBeAg阴性组，差异有统计学意义（P＜0.001或P<0.05）。2组ALT、AST、PLT、LSM等指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 肠道菌群相对丰度比较

2.2.1 2组核心优势菌属（丰度前三）的构成与分布特征

肠道菌群相对丰度分析显示，111例样本中共检测到501个菌属，经丰度排序，粪杆菌属、拟杆菌属、普雷沃菌属位列前三，构成了本研究队列的核心优势菌群。进一步的分布特征分析显示，普雷沃菌属的相对丰度水平最高，为50.40（18.38）；拟杆菌属丰度次之，为35.93（30.24）；粪杆菌属的丰度水平最低，11.35（7.98）。见图1。

2.2.2 肠道菌群特征分析

依据HBeAg状态及病毒载量水平（以6 lg kU/L为临界值，分为≥6 lg kU/L组与＜6 lg kU/L组）对所有患者进行分组，通过CLR转换后，分别比较各组间普雷沃菌属、拟杆菌属、粪杆菌属的丰度。结果显示，上述3种菌属在不同分组间的丰度比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2，3。

2.2.3 菌群综合指标（Index）与临床指标的相关性分析

核心菌属的综合临床关联价值结果显示，肠道菌群综合指标（Index）与PLT在全队列中呈显著负相关（r_s=-0.370， P=0.024）；而与ALT（r_s=-0.109）、AST（r_s=-0.036）、LSM（r_s=-0.051）、HBV DNA（r_s=-0.312）等其余临床指标均未检测到显著相关性（P＞0.05），提示菌群综合指标（Index）与PLT指标的关联性最为显著。

2.2.4 不同病毒复制状态下PLT与肝脏硬度的关联分析

菌群综合指标（Index）与PLT存在显著相关性，且PLT是临床中与肝纤维化密切相关的经典指标，因此本研究进一步结合乙肝复制相关表型（HBeAg状态、HBV DNA载量）进行分层分析，来揭示病毒复制状态对PLT与LSM二者关联的调控作用，结果显示在HBeAg阳性组及高病毒载量组（HBV DNA≥6 lg kU/L）中，PLT与LSM呈显著负相关（分别为r_s=-0.328、-0.570，均P＜0.001）；而在HBeAg阴性组及低病毒载量组（HBV DNA<6 lg kU/L）中，PLT与LSM无相关性（P>0.05），提示PLT与肝脏硬度的负向关联与病毒复制状态存在特异性关联。见表4。

3 讨　　论

3.1 研究背景与核心切入点

CHB是全球重大公共卫生挑战，尽管乙肝疫苗普及与高效抗病毒药物应用显著改善了疾病防控现状，但仍存在未被满足的临床需求，尤其是早期肝损伤标志物挖掘、病毒复制水平相关临床关联及肠道菌群介导的肠―肝轴调控机制研究，对优化CHB管理具有重要意义。本研究观察到，HBeAg阳性组HBV DNA载量、ALP及TBA水平均显著升高，其中HBV DNA载量增高与吴清艳等^［8］关于HBeAg作为CHB病毒高复制标志性表型的结论一致，ALP水平与病毒复制活跃程度的关联符合任才月等^［9］报道，TBA升高亦与既往乙肝相关肝损伤进程研究^［10-11］相符，提示TBA或可作为CHB肝损伤评估的潜在参考指标。上述指标异常可能与机体代谢状态及肠道微生态特征相关，而现有研究已提示肠道菌群特征与肝脏生化指标、纤维化进程存在关联。

基于此，为克服单一菌属研究局限，本研究聚焦“肠道微生态―血小板―肝纤维化”潜在关联通路，构建核心菌群综合指标，结合HBeAg状态与HBV DNA载量分层，探索不同病毒复制状态下各指标关联特征，为CHB精准评估提供新视角。

3.2 肠―肝轴在慢乙肝病理进程中的核心作用

肠―肝轴作为肠道与肝脏间的双向交流通路，通过胆管、门静脉及体循整合饮食、遗传、环境等多重信号，在CHB的病理进展中发挥关键调控作用。CHB相关肝损伤可通过门脉高压引发肠道淤血、缺血缺氧，同时导致肠道蠕动减弱、胆汁分泌减少及胆汁酸谱失衡，进而诱发肠道菌群失调；菌群紊乱进一步破坏肠黏膜屏障完整性，引发内毒素血症，通过肠―肝轴持续激活肝脏免疫炎症反应，加速CHB向肝硬化、肝癌演进，形成“肝损伤→菌群失调→炎症放大→肝纤维化加重”的恶性循环^［12］。这一病理过程提示，CHB相关肠道菌群失调不仅是肝损伤的伴随现象，更通过塑造肝脏炎性微环境，成为推动慢性肝病进展的重要病理环节 ^［13］，而炎性微环境的持续存在，亦是CHB向肝纤维化演进的核心驱动因素。

3.3 研究设计依据与核心发现

基于上述理论基础，本研究聚焦未接受抗病毒治疗的CHB患者，围绕“肠道菌群―血小板―肝纤维化”的关联展开探索，研究设计与核心发现如下。​

3.3.1 分组依据与数据预处理

考虑到队列数据的非正态分布特征（HBeAg阳性组P25=6.65、阴性组P75=6.17），结合CHB高病毒载量的公认界点^［14］，本研究选取6 lg kU/L作为HBV DNA分组临界值，既保证了各亚组样本量充足，又能精准对应病毒活跃复制与肝损伤进展的病理状态，与后续观察到的PLT-LSM负相关的病理基础相契合。同时，参照Jing等^［5］的方法，采用CLR转换预处理微生物组数据，有效减轻闭合效应并保留物种间的相对关系，为菌群分析的可靠性提供保障。

3.3.2 菌群分析与综合指标构建

组间比较结果显示，无论基于HBeAg状态（阳性/阴性）还是HBV DNA载量（＜6 lg kU/L或≥6 lg kU/L）分组，前三位优势菌属（普雷沃菌属、拟杆菌属、粪杆菌属）的CLR转换丰度差异均无统计学意义（P＞0.05）。为挖掘单一菌属分析未发现的潜在交互作用，参考曹海涛^［7］提出的菌群功能加权分析策略，结合本横断面研究探索性属性，依据3种优势菌属的相对丰度分布及生物学功能差异进行差异化赋权。近期孟德尔随机化研究^［15］从因果层面证实，普雷沃菌属为CHB的风险因素，部分拟杆菌属具有保护作用，为本研究按功能重要性差异化赋权提供了依据。既往研究^［16-17］显示，普雷沃菌属参与多糖代谢与短链脂肪酸合成，在肠―肝轴炎症调控中占核心地位；拟杆菌属介导蛋白质及胆汁酸代谢，在肠道稳态中发挥重要作用；粪杆菌属主要参与黏膜免疫，功能贡献相对有限。另一项宏基因组研究^［18］亦证实，上述三菌属是CHB相关肝纤维化患者的核心肠道菌群，为构建本研究菌群综合指标提供了直接依据。基于上述菌属功能异质性与队列丰度特征，本研究优先聚焦核心功能菌、减少低贡献菌属干扰以提升结果可靠性，梯度设定权重并构建菌群综合指标（Index），公式为：Index=0.5×CLR（普雷沃菌属）+0.3×CLR（拟杆菌属）+0.2×CLR（粪杆菌属）。该权重设定聚焦肠道代谢（如短链脂肪酸合成）、免疫调节（如黏膜免疫激活）相关菌属，具备生物学合理性。为验证权重稳健性，开展等权重（0.33∶0.33∶0.33）敏感性分析，并对比无权重丰度总和模型与机器学习驱动的随机森林模型，结果显示等权重模型无法获得稳定结果，而0.5∶0.3∶0.2加权方案可更合理反映各菌属生物学贡献度，所得Index与关键临床指标的关联更稳定、更具生物学意义，最终选择该功能权重模型以平衡生物学合理性与统计有效性。

3.3.3 核心研究发现

本研究聚焦未接受抗病毒治疗的CHB患者，围绕“肠道菌群―血小板―肝纤维化”的关联展开探索，发现了2条相互独立但均受病毒复制状态调控的关联线索。

第一，构建了肠道菌群综合指标（Index），并揭示了其与PLT的特异性关联。为克服单一菌属研究的局限，本研究基于核心优势菌属构建了反映菌群整体结构的综合指标（Index）。结果显示，Index仅与PLT呈显著负相关，而与LSM无直接统计学关联。这一结果提示，肠道菌群的整体失调可能优先作用于PLT系统，而非直接导致肝纤维化表型的改变。值得注意的是，本研究观察到单一优势菌属丰度在不同分组间差异无统计学意义，这与Chen等^［19］的研究逻辑一致，即通过筛选与CHB病情进展相关的肠道菌群OTU构建诊断模型，发现菌群组合整体丰度变化与PLT呈负相关。这进一步支持了肠道菌群对宿主的影响是多菌属功能整合的结果，凸显了群落水平分析的重要价值。

第二，在特定病毒复制背景下，揭示了PLT与肝纤维化的分层关联特征。进一步的分层分析表明，PLT与LSM的负相关仅存在于HBeAg阳性或高病毒载量亚组中，而在HBeAg阴性/低载量组中无此关联。

综合上述发现，本研究提出一种受病毒复制状态调节的“肠―肝―血小板”关联模式：首先，在全体研究队列中，Index与PLT呈现显著负相关，且这种关联不依赖于HBeAg状态或病毒载量分组，提示肠道菌群整体结构对PLT水平的影响可能是普遍性的。其次，PLT与LSM的关联则表现出严格的“病毒复制依赖性”，仅存在于HBeAg阳性或高病毒载量亚组中。基于上述不同层级的关联特征（整体队列中的Index-PLT相关，以及特定亚组中的PLT-LSM相关），我们推测在病毒活跃复制的特定病理环境下，PLT可能是连接肠道微生态改变与肝纤维化进程的重要功能节点。需注意的是，HBeAg阳性/高病毒载量组常伴有更高的ALT水平，活动性炎症可能同时导致LSM假性升高与PLT减少，因此该关联未必反映菌群或病毒对肝纤维化的直接驱动作用。本研究中Index与LSM在全队列中缺乏直接相关性（r_s=―0.051，P>0.05），提示菌群、PLT与肝纤维化之间并非简单线性因果传导，而更可能为特定条件下的协同病理网络。

3.3.4 机制阐释

病毒复制状态、肠道菌群综合指标、PLT与肝纤维化的关联已有明确研究基础。吴清艳等^［8］证实HBeAg阳性患者肝功能损伤更显著，认为HBV持续感染与肝细胞损伤、坏死及肝纤维化启动密切相关，且病毒复制活跃水平与肝脏损伤、纤维化进展速率存在协同关联；这与Kim等^［20］提出的慢乙肝肝纤维化相关指标与病毒载量呈非线性、亚组依赖性关联的观点相契合。既往研究^［21］显示，PLT减少更多反映脾功能亢进及骨髓抑制，是肝纤维化进展的伴随标志物而非直接致病因素。本研究进一步细化了这一特征，发现Index与PLT的关联在全队列普遍存在，但PLT与LSM的显著关联仅在高病毒载量（≥6 lg kU/L）亚组中显现，这恰好解释了为何在整体人群中难以捕捉到病毒载量与肝纤维化的直接线性关联，而在特定高病毒负荷亚组中却能观察到PLT作为关键节点的内在联系。另有研究^［22］显示，HBeAg阳性状态与CHB患者中重度肝脏炎症、高肝纤维化风险（≥2级占比28.8%）及PLT、白蛋白等纤维化相关指标异常均存在关联。近期研究^［23］同样表明，CHB患者的肠道菌群结构差异与病毒学应答及肝纤维化进展密切相关（如拟杆菌属优势菌群与HBV DNA抑制相关，而布劳特菌属等菌群与纤维化进展相关）。结合本研究结果，HBeAg阳性/高病毒载量亚组中PLT与肝硬度的显著负相关，进一步提示在该特定病毒复制背景下，肠道菌群综合指标、PLT与肝纤维化三者之间存在紧密的共变关系。病毒复制状态可能通过重塑肠道微生态，经由PLT这一关键节点，间接参与肝纤维化相关病理过程，而非表现为肠道菌群对肝纤维化的直接驱动。同时，肝纤维化进展具有复杂性^［24］：58.6%HBeAg阴性低病毒载量患者仍存在明显肝组织损伤（G≥2和/或S≥2），病程中晚期炎性损伤累积是重要相关因素，表明其受病程阶段、免疫活化等多因素共同影响。

基于现有证据，提出一种受病毒复制状态调控的关联模式：在病毒活跃复制背景下，肠道菌群整体失调、PLT减少与肝纤维化进展三者之间存在共变关系，PLT可能是其中的重要关联节点，但是否为因果中介仍需纵向研究验证。具体可阐释为：HBV活跃复制与系统性及肝脏局部持续炎症存在关联，该状态下肠道屏障功能与微生态稳态或发生改变，肠―肝轴可能参与上述关联过程；紊乱的菌群环境与短链脂肪酸代谢改变、内毒素血症加重相关，或间接影响巨核细胞生成及PLT生存周期；同时，肝脏炎症与纤维化与PLT生成素合成减少、脾功能亢进相关，进一步加剧PLT减少。本研究提示，在病毒复制活跃期，肠道菌群紊乱可能与上述机制协同作用，放大PLT减少与肝纤维化的关联效应。

3.3.5 研究局限性

本研究存在以下局限性：（1）未排除ALT作为混杂因素对LSM测量结果的潜在影响，本研究中HBeAg阳性组ALT均值为137 U/L，阴性组为72 U/L，虽差异无统计学意义（P=0.168），但临床炎症水平差异明显。既往研^［25］究显示，在CHB患者中，肝组织坏死性炎症是导致LSM与肝活检纤维化分期不一致的主要来源，活动性炎症可通过肝细胞水肿和炎性浸润导致LSM假性升高^［26-28］。此外，炎症亦可通过免疫介导机制导致PLT消耗或破坏增加。因此，HBeAg阳性/高病毒载量亚组中观察到的PLT-LSM负相关，可能主要由共同的炎症背景驱动，而非菌群或病毒复制直接介导^［29］。由于未能补充ALT作为协变量的偏相关分析或回归校正，也未按ALT水平（正常vs.升高）分层验证，无法明确PLT-LSM关联的独立性，这是本研究的重要局限。（2）对肠道菌群的混杂作用，ALT升高可通过肠—肝轴影响肠道菌群结构与功能（如改变胆汁酸代谢、增加肠道通透性等）^［30-32］，但本研究在探讨HBeAg状态与肠道菌群特征（包括Index与PLT的相关性）时，未将ALT纳入混杂因素控制，也未通过分层分析验证Index-PLT相关性在不同炎症状态下的稳定性，可能导致结果存在偏倚。未来研究需补充上述分析，以明确菌群与PLT的关联是否独立于ALT水平。（3）菌群综合指标权重缺乏充分验证，尽管Index的权重设定基于已有文献的功能学证据，但仍存在局限性，①权重基于预设功能，可能忽略菌属间的协同/拮抗作用^［33］；②未纳入未培养菌属及菌群代谢产物的影响；③本研究仅进行了基础的敏感性分析，未开展多维度分层或亚组敏感性分析，结果稳定性有待进一步验证。（4）本研究未设置健康对照组，因此无法明确本研究观察到的三种优势菌属分布及菌群综合指标（Index）特征，是CHB患者特有的微生态改变，还是正常人群中普遍存在的现象。未设置健康对照组的主要原因有2点，①研究核心目标，本研究的核心目的并非比较CHB患者与健康人群的菌群差异，而是聚焦于不同病毒复制状态（HBeAg阳性/阴性、HBV DNA高/低载量）CHB患者内部的肠道菌群、PLT与肝纤维化指标之间的关联特征。②客观条件限制，同期健康人群粪便标本采集难度较大，样本量难以与慢性乙型病毒性肝炎患者组匹配，易引入选择偏倚。未来研究可通过纳入健康对照组，进一步明确慢性乙型病毒性肝炎患者特异性的肠道菌群特征。（5）其他研究设计局限，本研究为横断面设计，无法明确肠道菌群紊乱、PLT减少与肝纤维化之间的因果关系；本研究为单中心小样本探索性研究，样本量有限，分层分析后样本规模进一步缩减，统计检验效能不足；为控制多重比较带来的Ⅰ类错误，本研究已对多组临床指标组间比较、菌群丰度分析及Index与多个临床指标的相关性分析结果，分别进行Bonferroni及FDR多重比较校正，校正后仅少量临床指标差异仍有统计学意义，其余分析结果差异均无统计学意义。故文中主要采用未校正的原始结果进行趋势探索，结论存在Ⅰ类错误风险，未来需扩大样本量开展多中心研究验证；肝纤维化评估采用瞬时弹性扫描，缺乏肝活检金标准作为对照，可能存在测量偏倚。

3.3.6 结论与临床意义

本研究围绕CHB患者HBeAg状态、病毒载量与ALP、胆汁酸的关联背景，基于肠—肝轴理论，首次通过功能权重构建肠道菌群综合指标，CHB患者Index与PLT计数在全队列中均存在相关性，PLT与肝纤维化程度具有关联；HBeAg阳性与高病毒载量协同存在时，与肝纤维化进展风险升高相关，这一相关性可能部分受该组患者活动性炎症（如ALT升高）的影响^［34-35］，提示在高病毒复制状态下，肠道微生态紊乱与宿主造血或PLT调控之间可能存在某种联系^［36］，但其具体机制尚需阐明。且在高病毒载量状态下，PLT与肝纤维化进程之间的潜在联系可能更为明显^［37］。需注意的是，本研究中Index与LSM无直接显著相关性（r_s=-0.05，P>0.05），因此Index-PLT相关性与PLT-LSM相关性应视为2个独立现象，而非线性因果通路。该发现深化了对肠―肝轴在CHB不同疾病阶段作用异质性的理解，从临床角度为CHB高危人群（尤其是HBeAg阳性、病毒载量升高者）的精准监测与干预提供了新思路，也为积极开展抗病毒治疗提供了理论依据：抗病毒治疗可抑制病毒复制，2025年EASL乙型肝炎病毒感染管理指南^［14］将“持续抑制HBV DNA（最好检测不到）”列为治疗首要目标，推测其可能通过改善肠―肝轴功能与肠道微生态相关^［38-39］，进而与PLT功能恢复、肝硬度进展减缓相关，但这一推测需纵向干预研究验证。这一关联特征为CHB肝纤维化的临床干预提供了潜在参考方向与研究靶点。未来研究需重点弥补上述局限性，通过补充混杂因素分析、权重敏感性验证及因果推断设计，进一步探讨菌群、PLT与肝纤维化之间的复杂关系及其临床转化潜力，为后续针对性干预策略的开发提供理论支撑。

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