脐带间充质干细胞外泌体处理后子宫内膜间质细胞的转录组分析

Transcriptomic analysis of human endometrial stromal cells treated with umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes

摘要

目的 揭示脐带间充质干细胞外泌体与子宫内膜间质细胞相互作用的调控机制，为子宫内膜损伤修复的干细胞疗法提供理论依据。 方法 采用转录组测序技术全面分析脐带间充质干细胞外泌体对子宫内膜间质细胞的转录组影响，通过GO分析、KEGG分析及GSEA分析，对比脐带间充质干细胞外泌体处理前后子宫内膜间质细胞的基因表达谱，筛选显著差异表达基因与信号通路；进一步通过蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络分析结合实时反转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription，qRT-PCR）验证，筛选出脐带间充质干细胞外泌体处理后子宫内膜间质细胞中上调的核心枢纽基因。 结果 共筛选出102个显著差异表达基因；GO、KEGG及GSEA分析显示，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路及白细胞介素（interleukin，IL）-6/Janus激酶（Janus kinase，Jak）-信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路显著上调；PPI网络分析结合qRT-PCR验证结果结果显示，IL-6、趋化因子配体（chemokine ligand，CXCL）8、IL-1B、CXCL1及趋化因子2（chemokine 2，CCL2）这5个差异表达基因在显著上调，这些可能是脐带间充质干细胞外泌体促进损伤子宫内膜修复的关键靶基因。 结论 脐带间充质干细胞外泌体通过调控TNF、NF-κB及IL-6/Jak-STAT等信号通路及IL-6、CXCL8、IL-1B、CXCL1及CCL2等关键靶基因促进子宫内膜基间质细胞增殖及损伤子宫内膜修复，本研究结果为宫腔粘连的干细胞治疗提供了新靶点与新方向。

Abstract

Objective To reveal the regulatory mechanisms underlying the interaction between umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes （UCMSC-exos） and endometrial stromal cells （ESCs）， and to provide a theoretical basis for stem cell-based therapy for endometrial repair. Methods Transcriptome sequencing technology was employed to comprehensively analyze the transcriptomic impact of UCMSC-exos on ESCs. Using Gene Ontology （GO） analysis， Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） analysis， and Gene Set Enrichment Analysis （GSEA）， the gene expression profiles of ESCs before and after treatment with UCMSC-exos were compared， and significantly differentially expressed genes and signaling pathways were screened. Furthermore， protein-protein interaction （PPI） network analysis combined with validation by real-time reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to identify core hub genes that were upregulated in ESCs after treatment with UCMSC-exos. Results A total of 102 significantly differentially expressed genes were identified. GO， KEGG， and GSEA analyses revealed that the tumor necrosis factor （TNF） signaling pathway， nuclear factor kappa-B （NF-κB） signaling pathway， and interleukin （IL）-6/Janus kinase （Jak）-Signal Transducer and Activator of Transcription （STAT） signaling pathway were significantly upregulated. PPI network analysis combined with qRT-PCR validation results indicated that five differentially expressed genes， namely IL-6， Chemokine ligand （CXCL） 8， IL-1B， CXCL1， and Chemokine 2 （CCL2）， were significantly upregulated. These genes might be key target genes for UCMSC-exos in promoting the repair of injured endometrium. Conclusion UCMSC-exos promote the proliferation of ESCs and the repair of injured endometrium by regulating signaling pathways including TNF signaling pathway， NF-kappa B signaling pathway and IL-6/Jak-STAT pathway， as well as key target genes such as IL-6， CXCL8， IL-1B， CXCL1， and CCL2. The findings of this study provide novel targets and new directions for stem cell-based therapy for intrauterine adhesions.

Graphical abstract

关键词

阴道闭锁 / 脐带间充质干细胞外泌体 / 子宫内膜间质细胞 doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2026.06.006

Key words

gynatresia / umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes / endometrial stromal cells

宫腔粘连（intrauterine adhesions，IUA）又称Asherman综合征，是宫腔操作及手术、感染及子宫先天畸形等因素导致子宫内膜基底层受损，进而引发子宫内膜纤维化、宫腔及宫颈管闭锁的一类疾病，临床表现包括经量减少、继发闭经、痛经、不孕及不良妊娠结局等^［1］。目前IUA的主要治疗策略为宫腔镜下宫腔粘连分离术，以恢复宫腔正常解剖形态，同时辅以放置宫内节育器或球囊、口服人工周期等手段预防再粘连，促进子宫内膜生长^［2］。但常规治疗难以有效重建子宫内膜功能与结构、恢复患者生育能力，因此研发安全有效的IUA治疗新方案已成为临床的迫切需求。近年来，脐带间充质干细胞外泌体（umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes，UCMSC-exos）作为再生医学与干细胞治疗领域的新兴方向，因其在多种疾病治疗中展现出潜在价值而备受关注^［3］。本团队前期研究^［4-5］表明，子宫内膜间质细胞（human endometrial stromal cells，ESCs）是子宫内膜损伤修复的关键细胞，参与多种妇科疾病的发生发展，也是UCMSC-exos发挥治疗作用的重要靶细胞。然而，UCMSC-exos与 ESCs相互作用的分子机制尚不明确，而该机制的阐明对研发更有效的子宫内膜修复再生的干细胞治疗方案至关重要。基于此，本研究采用转录组测序技术全面解析UCMSC-exos对ESCs的全转录组影响，通过对比UCMSC-exos处理前后子宫内膜间质细胞的基因表达谱，筛选并鉴定差异表达的关键基因与信号通路，这不仅有助于深入理解 UCMSC-exos与ESCs相互作用机制，也可为研发损伤子宫内膜再生及IUA治疗的新方法提供实验依据与理论基础。

1 资料与方法

1.1 ESCs的原代培养与鉴定

原代ESCs取自新鲜子宫内膜标本，培养与鉴定方法参照本团队前期方法^［4］。将组织剪至<1 mm³，用3~5倍体积的0.2%I型胶原酶（含0.005%脱氧核糖核酸酶）37 ℃振荡消化1 h，依次经100 μm、40 μm细胞筛过滤分离ESCs，接种于培养皿，用含10%胎牛血清、1% 双抗的DMEM/F12培养基培养。采用免疫荧光法检测ESCs特异性标志物Vimentin（Proteintech）和Pan-cytokeratin（Santa Cruz），鉴定ESCs并验证其纯度^［4］，选取传代不超过5代的ESCs进行后续实验。

本研究经医院医学伦理委员会批准通过（批准文号：21JCQNJC01760）。

1.2 UCMSC-exos的分离

UCMSCs由北京市脐血库提供，取第2代UCMSCs鉴定成脂、成骨分化能力与免疫表型^［4］。选取4~10代UCMSCs，培养至细胞融合度70%~80%，更换为去除外泌体的胎牛血清培养基（100 000×g 4 ℃超速离心过夜制备），继续培养36~48 h收集细胞培养上清。采用差速超速离心法分离纯化UCMSCs细胞培养上清外泌体^［6］，具体方法如下：4 ℃条件下，300×g离心10 min、2 000×g离心10 min、10 000×g离心30 min去除死细胞与碎片；100 000×g离心（beckman coulter，SW32Ti转子）70 min收集外泌体沉淀，无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤后再次超速离心，沉淀重悬于100~200 μL PBS，分装后-80 ℃保存备用。

1.3 UCMSC-exos的鉴定与摄取实验

采用BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Scientific）按说明书测定外泌体总蛋白浓度，定量外泌体浓度。采用纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）（德国Particle Metrix，ZetaView系统）检测外泌体粒径。采用Western blot检测外泌体特异性标志物 TSG101、Alix、CD63（均为美国 Abcam）。采用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）（日本日立，HT7700）观察外泌体形态。

参照本团队前期方法^［4］进行UCMSC-exos摄取实验：采用红色荧光染料PKH26（美国Sigma-Aldrich）按说明书对UCMSC-exos进行标记。将标记后的外泌体加入接种于共聚焦培养皿的亚融合状态ESCs中，37 ℃孵育24 h。用4%多聚甲醛固定细胞10 min，分别采用Actin-Tracker Green（中国上海碧云天）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美国Sigma-Aldrich）对ESCs的细胞骨架和细胞核进行染色，采用激光扫描共聚焦显微镜（德国Leica，TCS SP5）观察ESCs对UCMSC-exos的摄取情况并采集图像。

1.4 RNA 提取与转录组测序

6孔板每孔接种2×10⁵个ESCs，贴壁后分为对照组与UCMSC-exos处理组（20 mg/L，处理24 h）。Trizol（美国Thermo Scientific）法提取总RNA，Nanodrop（美国Thermo Scientific）与BioAnalyzer（美国Agilent）质控：浓度≥200 mg/L、总量≥10 μg、RNA 完整性指数（RNA Integrity Number，RIN）≥8.0的样本用于测序。经Oligo（dT）磁珠富集mRNA，片段化后构建cDNA文库，DNBSEQ平台测序，测序深度设置为≥10×，确保转录组中每个碱基的平均覆盖次数≥10次。采用SOAP nuke过滤软件对测序所得的raw reads进行质控，包括去除包含接头的reads、未知碱基N含量＞5%的reads以及低质量的reads（低质量值定义为低10的碱基占该reads总碱基数的比例＞20%的reads）。进一步采用Bowtie2比对参考基因组，RSEM计算FPKM，DESeq2筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），FDR校正P值（Q值）≤0.05且|log₂FC|>1。

1.5 基于GO、KEGG及GSEA的功能注释与富集分析

将所有DEGs映射至GO数据库，以FDR校正后P值（Q值）≤0.05为阈值，筛选显著富集的GO条目，并将其分为生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3个亚组。同时，将DEGs映射至KEGG数据库，以FDR校正后P值（Q值）≤0.05为阈值，筛选显著富集的KEGG信号通路。

作为差异表达分析的补充，采用美国博德研究所的GSEA 3.0 软件（http：//software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），选取分子特征数据库（MSigDB 6.2版）中的经典基因集（Hallmarks）作为参考基因集，将标准化富集分数（normalized enrichment score，NES）>1、NOM p-val<0.05且FDR<0.25 的基因集定义为显著富集基因集。

1.6 蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）

网络构建与核心枢纽基因筛选　采用在线相互作用基因检索工具STRING数据库（http：//www.string-db.org/，11.0版）^［7］，分析UCMSC-exos 处理组与对照组DEGs的蛋白质―蛋白质相互作用（PPI）关系；选取组合评分>0.4的DEGs对构建PPI网络，通过Cytoscape软件（3.7.1版，http：//www.cytoscape.org）^［8］进行可视化；利用cytoHubba插件基于节点度值筛选核心枢纽基因，选取度值前5的基因为关键核心基因。

1.7 实时反转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription，qRT-PCR）验证核心枢纽基因

以GAPDH为内参，采用qRT-PCR验证5个核心枢纽基因的表达水平，以证实DEGs分析结果的可靠性，核心枢纽基因引物序列见表1。提取20 mg/L UCMSC-exos处理24 h及未处理的ESCs总RNA，按前述方法制备cDNA，采用FastKing反转录试剂盒（含 gDNase，中国天根生化科技公司），将2 μg总RNA反转录为单链cDNA，采用SuperReal 预混液试剂盒（SYBR Green，中国天根生化科技公司）进行qRT-PCR，通过罗氏Light Cycler 480II仪器进行检测和数据计算，每个样本设3个复孔用于统计分析，采用 2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.8 统计学方法

应用SPSS 23.0与GraphPad Prism 8统计软件分析数据。正态分布的计量资料以\overline{x}±s表示，比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

2.1 ESCs与UCMSC-exos的原代培养与鉴定

原代ESCs呈短梭形、成纤维细胞样形态（图1A），免疫荧光双染色结果显示，ESCs 高表达间质细胞标志物Vimentin，不表达上皮细胞标志物Pan-cytokeratin，证实了原代ESCs的表型及纯度（图1B）。原代UCMSC呈长梭形成纤维细胞样形态，细胞生长融合后呈漩涡状排列（图1C）。诱导分化实验显示，UCMSC在成骨诱导培养基中可形成钙结节，茜素红染色阳性，在成脂诱导培养基中细胞质内可积聚脂滴，油红O染色阳性（图1D）。流式细胞术检测结果显示，UCMSC高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR（图1E），上述生物学特性均符合间充质干细胞的鉴定标准。

2.2 UCMSC-exos的鉴定与摄取

UCMSC-exos标志蛋白Alix、CD63、TSG101均阳性（图2A），TEM观察显示，纯化后的UCMSC-exos为单层膜包被的杯状囊泡，直径约100 nm（图2B），NTA结果显示，UCMSC-exos的粒径为52.6~218.8 nm，占检测样本的97.4%，粒径主峰为135.7 nm（图2C）。激光共聚焦显微镜观察显示，PKH26标记的UCMSC-exos 与ESCs共孵育24 h后，可被内化至ESCs细胞质中（图2D）。以上结果证实，从UCMSC细胞培养上清中分离的颗粒为UCMSC-exos，且可被ESCs摄取至细胞内。

2.3 UCMSC-exos处理后子宫内膜间质细胞的差异表达基因分析

转录组测序共获得24 972个mRNA。对UCMSC-exos处理组与对照组ESCs进行DEGs分析，以DESeq2为主要分析工具，筛选出Q值≤0.05且| log₂FC|>1的DEGs共102个，其中上调基因73个、下调基因29个，火山图结果见图3A。热图展示了所有DEGs的表达分布（图3B），提示UCMSC-exos处理后ESCs的基因表达发生显著改变。

2.4 差异表达基因的功能注释与分类

对102个DEGs进行GO功能富集分析，以反映UCMSC-exos处理后ESCs内基因表达的动态变化，结果将DEGs分为BP、MF、CC 3个亚组（图4A~C），共筛选出135个显著富集的BP条目、5个MF条目和2个CC条目。前20个显著富集的BP条目包括细胞因子介导的信号通路、细胞增殖的正调控、细胞凋亡的负调控、细胞增殖的负调控、中性粒细胞趋化、趋化因子介导的信号通路、趋化作用等（图4A）；MF亚组的富集条目包括细胞因子活性、趋化因子活性、信号受体结合、生长因子活性、蛋白质结合（图4B）；CC亚组仅富集细胞外空间和细胞外区域两个条目（图4C）。KEGG 通路富集分析共筛选出37条显著富集的信号通路，包括 IL-17信号通路、细胞因子―细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、NOD样受体信号通路、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、Janus激酶（Jak）―信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路、FoxO信号通路等（图4D）。为进一步探究UCMSC-exos处理对ESCs基因表达的影响，采用50个经典 Hallmarks 基因集进行GSEA 分析。结果显示，UCMSC-exos处理组有17个基因集显著上调（NES>1、NOM p-val<0.05、FDR<0.25），对照组有9个基因集显著上调（NES>1、NOM p-val<0.05、FDR<0.25）；其中，TNF诱导的NF-κB调控基因（NES=2.964，NOM p-val=0，FDR q-value=0）（图4E）和IL-6通过STAT3上调的基因（NES=2.593，NOM p-val=0，FDR q-value=0）（图4F）在UCMSC-exos处理组显著上调，与KEGG分析结果一致。

2.5 PPI网络分析及验证

为进一步明确DEGs的生物学关联性，采用STRING数据库构建DEGs的PPI网络，并通过Cytoscape软件可视化。结果显示，UCMSC-exos处理后ESCs的DEGs形成了复杂的相互作用网络（图5A），构建的PPI网络富集P值<1.0e-16，包含100个节点（枢纽基因）和319条边（相互作用关系），排名前5的核心枢纽基因为IL-6（度值=37）、CXCL8（度值=33）、IL-1B（度值=29）、CXCL1（度值=28）、CCL2（度值=28）。采用qRT-PCR检测上述5个核心枢纽基因的表达水平，以验证转录组测序及DEGs分析结果的可靠性。结果显示，UCMSC-exos处理后的ESCs中IL-6表达水平为6.306±0.870，CXCL8表达水平为42.827±8.967，IL-1B表达水平为6.980±0.837，CXCL1表达水平为37.163±12.055，CCL2表达水平为7.576±1.649；而对照组的IL-6表达水平为1.020±0.238，CXCL8表达水平为1.010±0.173，IL-1B表达水平为1.094±0.555，CXCL1表达水平为1.097±0.543，CCL2表达水平为1.009±0.172。2组相比，qRT-PCR的结果表明UCMSC-exos组中的5个核心枢纽基因的表达水平均显著上调，这与转录组测序结果一致（表2），也证实了转录组测序数据能可靠筛选出UCMSC-exos处理后ESCs中的潜在关键基因。

3 讨　　论

本研究采用转录组测序技术系统解析了UCMSC-exos处理后ESCs的分子特征，初步揭示了UCMSC-exos调控子宫内膜修复与再生的潜在分子机制。通过构建ESCs特异性DEGs表达谱，并结合GO、KEGG及GSEA分析，筛选出TNF信号通路、NF-κB信号通路、IL-6/Jak-STAT信号通路等显著富集的细胞信号通路。进一步通过PPI网络分析结果显示，IL-6、CXCL8、IL-1B、CXCL1、CCL2为核心枢纽基因，且在UCMSC-exos处理的ESCs中呈上调趋势。本研究报道了 UCMSC-exos处理后ESCs的mRNA转录组图谱，这在本领域中的相关研究中还鲜有报道。

MSC被认为是子宫内膜组织损伤及IUA形成后重建子宫内膜结构与功能的潜在治疗策略^［9-11］。然而MSC细胞治疗存在诸多局限性，如难以获得表型稳定的标准化细胞来源、大体积细胞易滞留于肺微血管引发输注毒性、易发生宿主免疫排斥、异位组织形成风险，且其致瘤性也仍存争议^［12］。近年研究结果显示，MSC-exos具有与其母细胞相似的功能，有望克服上述局限性。MSC-exos是MSC分泌的功能性囊泡，可重现MSC的生物学活性，有望成为MSC细胞治疗的替代方案。现有研究^{［4-5，13-17］}表明，MSC-exos可通过促进子宫内膜细胞增殖、抑制凋亡、减轻子宫内膜纤维化、逆转上皮―间质转化、抗炎、促进M2型巨噬细胞极化等多种途径，促进受损子宫内膜修复，提示MSC-exos在很大程度上发挥了其母细胞在损伤子宫内膜修复中的广谱治疗效果。但目前MSC-exos发挥治疗作用的分子机制尚未完全阐明，因此本研究旨在揭示该过程中的基因表达变化，为IUA的治疗提供新的思路与理论依据。

课题组前期研究结果显示，UCMSC-exos可呈剂量依赖性促进ESCs增殖，其最低有效浓度为20 mg/L，并在处理12 h后即可检测到促进细胞增殖的效应，且该效应可持续至60 h^［4-5］。因此，本研究采用20 mg/L UCMSC-exos处理ESCs 24 h，进行转录组测序分析，以期解析UCMSC-exos促进ESCs细胞增殖的分子机制。KEGG通路富集分析结果显示，DEGs不仅富集于细胞增殖相关通路，同时显著激活TNF、NF-κB、Jak-STAT信号通路，本研究结果显示与现有文献报道一致^［17-19］。

TNF在子宫内膜细胞和白细胞中均有表达，且其表达水平随月经周期发生动态变化，可调控子宫内膜细胞的增殖、分化及免疫调节，因此TNF信号通路被认为参与平衡ESCs的增殖与生长停滞^［20］。此外，TNF及其调控的NF-κB下游基因可参与子宫内膜快速再生过程中的组织降解与更新，ESCs发挥促其有丝分裂作用、抑制凋亡，并对蜕膜化过程产生负向调控^［21］。同时，TNF还可促进子宫内膜血管生成及滋养层细胞侵袭，有利于胚胎着床^［22-23］。由此可见，TNF信号通路及NF-κB信号通路可通过上述多种机制加速子宫内膜再生。本研究中，PPI、KEGG及GSEA分析结果显示，CXCL1、IL-1B、CCL2、CXCL8、IL-6这5个核心枢纽基因的表达上调，促进了UCMSC-exos处理后ESCs中TNF信号通路和NF-κB信号通路的激活，进而加速ESCs增殖。

现有研究^［24-26］表明，IL-6及其下游Jak-STAT信号通路参与子宫内膜的多种生物学过程。首先，IL-6可在体内外促进ESCs的增殖与黏附，其作用机制可能与调控关键效应分子STAT3 的磷酸化并激活Jak-STAT信号通路有关。其次，Xu等^［27］研究结果显示，子宫内膜微环境中分泌的IL-6可通过Jak-STAT信号通路促进子宫内膜干细胞更新，这可能是其促进ESCs增殖的另一机制。此外，MSC分泌的IL-6还可通过激活Jak-STAT信号通路，逆转损伤子宫内膜纤维化、维持子宫内膜局部的免疫耐受、改善子宫内膜容受性，从而减轻子宫内膜损伤并促进其修复^［28-30］。本研究中，PPI、KEGG及GSEA分析结果显示，IL-6、CXCL1、IL-1B这3个核心枢纽基因显著上调，参与了UCMSC-exos处理后ESCs中IL-6/Jak-STAT通路的激活，这可能是UCMSC-exos促进子宫内膜再生的另一潜在机制。

为验证转录组测序结果的可靠性，本研究采用qRT-PCR对PPI筛选出的5个核心基因（IL-6、CXCL8、IL-1B、CXCL1、CCL2）进行验证，这些基因均参与TNF、NF-κB、IL-6/Jak-STAT信号通路的调控。结果不仅证实转录组测序数据真实可信，也为后续深入研究UCMSC-exos调控ESCs的分子机制提供了潜在靶点。

然而，本研究仍存在一定局限性。第一，本研究样本量有限，后续需扩大样本量开展深入研究；第二，ESCs为混合细胞群，由干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、周细胞等多个亚群组成，本研究未对各亚群进行单独分析，未来需针对ESCs不同细胞组分开展深入研究；第三，IL-6、CXCL8、IL-1B等上调基因参与TNF、NF-κB、IL-6/Jak-STAT等炎症反应关键信号通路^［31-33］，提示UCMSC-exos治疗IUA可能存在潜在炎症相关不良反应，后续需开展体内实验，进一步验证本研究筛选出的相关靶点及分子机制，并探索评估UCMSC-exos在损伤子宫内膜修复与再生过程中的促炎效应。

综上所述，本研究筛选出与UCMSC-exos处理ESCs相关的102个显著差异表达基因。GO、KEGG及GSEA分析结果显示，TNF信号通路、NF-κB信号通路、IL-6/Jak-STAT信号通路在UCMSC-exos处理的ESCs中呈上调趋势。PPI 网络分析结合qRT-PCR验证，筛选出5个（IL-6、CXCL8、IL-1B、CXCL1、CCL2）可能参与UCMSC-exos促进ESCs增殖的核心枢纽基因。本研究结果深化了UCMSC-exos加速子宫内膜损伤修复相关分子机制的理解，为IUA的干细胞治疗提供新靶点与新策略。

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基金资助

天津市自然科学基金(21JCQNJC01760)