脾酪氨酸激酶抑制剂通过抑制脾酪氨酸激酶/核因子κB通路减轻香烟烟雾提取液诱导气道上皮炎症损伤的体外研究

A spleen tyrosine kinase inhibitor alleviates cigarette smoke extract-induced airway epithelial inflammatory injury via inhibition of the spleen tyrosine kinase/nuclear factor-κB pathway： An in vitro study

摘要

目的 探讨脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路在香烟烟雾提取液（cigarette smoke extract，CSE）诱导气道上皮炎症损伤中的作用，并观察SYK抑制剂R406的干预效果。 方法 采用THP-1来源巨噬样细胞与BEAS-2B细胞建立Transwell间接共培养模型，并通过CSE浓度筛选确定正式刺激条件。基础实验设置溶剂对照（vehicle，Veh）组、CSE组、R406组和CSE+R406组；进一步结合SYK过表达、SYK小干扰RNA敲低、p65核转位免疫荧光及NF-κB抑制剂BAY 11-7082对照实验，检测炎症因子表达、SYK/NF-κB通路活化、活性氧水平及细胞存活率。 结果 5% CSE处理24 h后，BEAS-2B细胞存活率降至（88.590±1.139）%，IL-8 mRNA升至9.332±0.584，故用于后续建模。与Veh组比较，CSE组炎症因子表达升高，p-SYK/SYK由0.31±0.03升至0.86±0.04，R406干预后降至0.63±0.04。SYK过表达进一步放大CSE诱导的炎症反应和NF-κB活化；SYK敲低则降低炎症因子表达及p-IκBα/IκBα、p-p65/p65水平。CSE使p65核/胞质荧光强度比值由0.142±0.023升至1.072±0.115，R406干预和SYK敲低后分别降至0.308±0.032和0.516±0.036。BAY 11-7082亦可降低CSE诱导的炎症因子mRNA表达。 结论 SYK/NF-κB通路参与CSE诱导的气道上皮炎症损伤过程。R406可减轻炎症反应、氧化应激和细胞活力损伤，其作用与抑制SYK/NF-κB轴活化有关。

Abstract

Objective To investigate the role of the spleen tyrosine kinase （SYK）/nuclear factor-κB （NF-κB） pathway in cigarette smoke extract （CSE）-induced airway epithelial inflammatory injury and to evaluate the intervention effect of the SYK inhibitor R406. Methods A Transwell indirect co-culture model of THP-1-derived macrophage-like cells and BEAS-2B cells was established， and the formal stimulation condition was determined by CSE concentration screening. The basic experiment included vehicle control （Veh）， CSE， R406 and CSE+R406 groups. SYK overexpression， small interfering RNA-mediated SYK knockdown， p65 nuclear translocation immunofluorescence， and an NF-κB inhibitor BAY 11-7082 control experiment were further performed to assess inflammatory cytokine expression， SYK/NF-κB pathway activation， reactive oxygen species （ROS） production and cell viability. Results After treatment with 5% CSE for 24 h， BEAS-2B cell viability decreased to （88.590±1.139）%， whereas IL-8 mRNA increased to 9.332±0.584； therefore， this condition was used for subsequent modeling. Compared with the Veh group， CSE increased inflammatory cytokine expression and elevated p-SYK/SYK from 0.31±0.03 to 0.86±0.04， which was reduced to 0.63±0.04 after R406 intervention. SYK overexpression further enhanced CSE-induced inflammation and NF-κB activation， whereas SYK knockdown reduced inflammatory cytokine expression and p-IκBα/IκBα and p-p65/p65 levels. CSE increased the p65 nuclear/cytoplasmic fluorescence intensity ratio from 0.142±0.023 to 1.072±0.115， which decreased to 0.308±0.032 after R406 intervention and to 0.516±0.036 after SYK knockdown. BAY 11-7082 also decreased CSE-induced inflammatory cytokine mRNA expression. Conclusion The SYK/NF-κB pathway participates in CSE-induced airway epithelial inflammatory injury. R406 alleviates inflammation， oxidative stress and cell viability impairment， and its effect is associated with suppression of the SYK/NF-κB axis.

Graphical abstract

关键词

气管疾病 / Syk激酶 / NF-κB / 烟草制品 doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2026.07.009

Key words

tracheal diseases / spleen tyrosine kinase / nuclear factor-κB / tobacco products

吸烟相关气道炎症是慢性阻塞性肺疾病发生发展的重要基础。香烟烟雾提取液（cigarette smoke extract，CSE）可诱导气道上皮细胞炎症反应、氧化应激和细胞活力下降^［1-3］。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）参与炎症信号转导，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是促炎因子表达的重要调控通路^［4-8］。本研究构建体外共培养模型，探讨SYK/NF-κB通路在CSE诱导气道上皮炎症损伤中的作用及脾酪氨酸激酶抑制剂R406的干预效应^［9-10］。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人支气管上皮细胞BEAS-2B、人单核细胞THP-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液购自武汉普诺赛生命科技有限公司。SYK抑制剂R406购自MedChemExpress公司，佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）购自MedChemExpress公司。人肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β） 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。总RNA提取试剂、RIPA裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、CCK-8（cell counting kit-8）试剂盒和活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。p-SYK、SYK、p-IκBα、IκBα、p-p65、p65、β-actin及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。0.4 μm Transwell小室购自Corning公司。主要仪器包括CO₂细胞培养箱、超净工作台、高速冷冻离心机、实时荧光定量PCR仪、酶标仪、电泳仪、转膜仪、凝胶成像系统和倒置显微镜。补充实验所用SYK小干扰RNA及阴性对照、NF-κB抑制剂BAY 11-7082、p65免疫荧光染色相关试剂用于后续机制验证。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

BEAS-2B细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素―链霉素的DMEM/F12培养基中，THP-1细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素―链霉素的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中常规培养。实验均选取对数生长期细胞进行处理。

1.2.2 THP-1细胞诱导分化

取生长状态良好的THP-1细胞，参照文献方法并结合预实验条件，加入PMA使其终浓度为100 nmol/L，连续诱导24 h，使THP-1细胞分化为巨噬样细胞^［11］。诱导结束后弃去含PMA培养基，换入新鲜完全培养基继续培养24 h后用于后续实验。

1.2.3 CSE制备

CSE参照文献方法并结合本研究条件制备^［2-3］。选用国产上海红双喜卷烟，焦油含量8 mg/支，烟气烟碱含量0.7 mg/支，一氧化碳含量10 mg/支。取4支卷烟产生的主流烟雾，经负压抽吸泵通入40 mL无血清培养基中，所得溶液定义为100% CSE。制备结束后，以氢氧化钠（NaOH）将pH调至约7.4，经0.22 μm滤膜过滤后现配现用。实验时以完全培养基稀释至5% CSE，连续处理细胞24 h。对照组加入等体积溶剂，所有处理体系中二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）终浓度均不超过0.1%。

1.2.4 细胞转染

人SYK编码序列克隆入pcDNA3.1（+）载体，空载体作为阴性对照。BEAS-2B细胞融合度达60%～70%时，按照转染试剂说明书进行转染。转染48 h后收集细胞，采用Western blot检测SYK蛋白表达，以验证过表达效率。

1.2.5 实验分组

基础实验分为溶剂对照（vehicle，Veh）组、CSE组、R406组和CSE+R406组。Veh组加入等体积溶剂；CSE组给予5% CSE处理24 h；R406组给予1 μmol/L R406处理；CSE+R406组先给予1 μmol/L R406预处理1 h，再加入5% CSE共同作用至24 h。SYK过表达实验分为空载体（empty vector，EV）+Veh+CSE组、EV+R406+CSE组、SYK过表达（SYK overexpression，OE-SYK）+Veh+CSE组和OE-SYK+R406+CSE组。共培养实验分为单培养上皮+Veh组、共培养+Veh组、共培养+CSE组和共培养+CSE+R406组，用于检测ROS水平和细胞存活率。

1.2.6 Transwell间接共培养模型建立

采用0.4 μm孔径Transwell小室建立BEAS-2B细胞与THP-1来源巨噬样细胞的间接共培养模型。BEAS-2B细胞接种后培养至状态稳定，THP-1来源巨噬样细胞接种于另一腔室。共培养12 h后，根据实验分组加入CSE和R406进行处理。

1.2.7 实时荧光定量聚合酶链式反应检测

各组细胞处理结束后，采用总RNA提取试剂提取RNA，检测RNA浓度和纯度后反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR检测TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达水平。β-actin作为内参，采用2^―ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.8 ELISA检测

各组细胞处理结束后收集培养上清，3 000 r/min离心10 min，取上清液备用。按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β蛋白分泌水平，酶标仪于450 nm波长读取吸光度，根据标准曲线计算各指标浓度。

1.2.9 蛋白免疫印迹检测

各组细胞处理结束后加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转膜后用5%脱脂奶粉封闭，加入p-SYK、SYK、p-IκBα、IκBα、p-p65、p65和β-actin一抗4 ℃孵育过夜。次日加入HRP标记二抗孵育，经增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显色后采集图像。采用Image J软件分析条带灰度值，计算p-SYK/SYK、p-IκBα/IκBα和p-p65/p65相对表达水平。

1.2.10 ROS检测

各组细胞处理结束后，加入2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）工作液，37 ℃避光孵育。孵育结束后用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤，去除未进入细胞的探针，采用荧光酶标仪检测荧光强度，以相对荧光强度表示ROS活性指数。

1.2.11 CCK-8检测细胞存活率

各组细胞处理结束后，每孔加入CCK-8工作液，37 ℃继续孵育。孵育结束后，采用酶标仪于450 nm波长检测吸光度。细胞存活率按实验组吸光度与对照组吸光度的比值计算。

1.2.12 CSE浓度筛选

为明确正式建模条件，BEAS-2B细胞分别给予Veh、2.5% CSE、5% CSE和10% CSE处理24 h。处理结束后，采用CCK-8法检测细胞存活率，采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测IL-8 mRNA表达水平。

1.2.13 SYK小干扰RNA转染及敲低效率验证

BEAS-2B细胞融合度为60%～70%时进行小干扰RNA转染。实验设置Control组、阴性对照小干扰RNA（negative control siRNA，si-NC）组、SYK小干扰RNA（si-SYK）-1组和si-SYK-2组。转染48 h后提取总RNA，采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测SYK mRNA表达；转染72 h后提取总蛋白，采用蛋白免疫印迹检测SYK蛋白表达，并据此筛选敲低效率较高的小干扰RNA用于后续机制验证。

1.2.14 SYK敲低背景下CSE与R406干预

根据敲低效率验证结果，后续实验采用si-SYK-2进行SYK敲低。实验设置si-NC+Veh组、si-NC+CSE组、si-NC+CSE+R406组和si-SYK+CSE组。CSE处理浓度为5%，作用24 h；R406干预方式与前述基础实验一致，即1 μmol/L R406预处理1 h后再加入CSE。处理结束后，采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达水平，采用蛋白免疫印迹检测SYK、p-IκBα/IκBα和p-p65/p65水平。

1.2.15 免疫荧光检测p65核转位

细胞分组同SYK敲低背景下的CSE与R406干预实验。处理结束后按免疫荧光染色常规流程进行固定、通透和封闭，依次孵育p65一抗及荧光二抗，并以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）复染细胞核。采集荧光图像后，分析p65核/胞质荧光强度比值及p65核转位阳性细胞比例。

1.2.16 NF-κB抑制剂对照实验

为进一步验证炎症因子表达与NF-κB通路活化的关系，实验设置Veh组、CSE组、CSE+R406组和CSE+BAY 11-7082组。BAY 11-7082按预实验确定的工作条件进行预处理后，再给予5% CSE刺激。处理结束后，采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达水平。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以\overline{x}±s表示，组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

2.1 CSE浓度筛选

与Veh组比较，2.5%、5%和10% CSE处理24 h后BEAS-2B细胞存活率逐步下降，IL-8 mRNA表达水平逐步升高。5% CSE组细胞存活率为（88.590±1.139）%，同时IL-8 mRNA表达水平升至9.332±0.584，已形成较明确的炎症损伤反应；10% CSE组细胞存活率进一步降至（58.143±3.875）%，提示细胞毒性较强。综合炎症诱导幅度与细胞活力保留情况，后续正式机制实验采用5% CSE处理24 h作为建模条件，见表1。

2.2 R406抑制CSE处理诱导炎症因子表达升高

实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示，与Veh组比较，CSE组TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；R406单独处理组上述炎症因子mRNA表达水平与Veh组相比无明显升高；与CSE组比较，CSE+R406组TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

ELISA验结果显示，与Veh组比较，CSE组TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β蛋白分泌水平均明显升高；R406单独处理组炎症因子分泌水平未见明显升高；与CSE组比较，CSE+R406组上述炎症因子蛋白分泌水平均降低，差异有统计学意义，见表3。

蛋白免疫印迹结果显示，与Veh组比较，CSE组p-SYK/SYK比值升高；与CSE组比较，CSE+R406组p-SYK/SYK比值降低，提示R406可抑制CSE诱导的SYK活化，见表4、图1。

2.3 R406减轻共培养条件下CSE增强氧化应激并降低细胞存活率

与单培养上皮+Veh组比较，共培养+Veh组ROS活性指数升高，细胞存活率降低（P＜0.05），提示THP-1巨噬样细胞与BEAS-2B细胞共培养可增强上皮细胞氧化应激状态并影响细胞活力。与共培养+Veh组比较，共培养+CSE组ROS活性指数进一步升高，细胞存活率进一步下降（P＜0.05），说明CSE可加重共培养体系中的氧化损伤。与共培养+CSE组比较，共培养+CSE+R406组ROS活性指数降低，细胞存活率升高，提示R406可减轻CSE诱导的氧化应激并改善细胞活力，见表5。

2.4 R406部分逆转SYK过表达增强CSE诱导的炎症反应

在CSE刺激背景下，与EV+Veh+CSE组比较，OE-SYK+Veh+CSE组TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β蛋白分泌水平均升高（P＜0.05）；与OE-SYK+Veh+CSE组比较，OE-SYK+R406+CSE组上述炎症因子蛋白分泌水平降低（P＜0.05）；OE-SYK+R406+CSE组仍高于EV+R406+CSE组（P＜0.05），提示SYK过表达可增强CSE诱导的炎症反应，并在一定程度上削弱R406的抑制作用，见表6。

实时荧光定量聚合酶链式反应结果与酶联免疫吸附试验结果基本一致。与EV+Veh+CSE组比较，OE-SYK+Veh+CSE组TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达水平均升高（P＜0.05）；R406处理后，上述mRNA表达水平降低，OE-SYK+R406+CSE组仍高于EV+R406+CSE组（P＜0.05），进一步说明SYK过表达可放大CSE诱导的炎症因子表达，见表7。

2.5 R406抑制SYK过表达促进NF-κB通路活化

蛋白免疫印迹结果显示，与EV+Veh+CSE组比较，OE-SYK+Veh+CSE组p-IκBα/IκBα和p-p65/p65比值均升高（P＜0.05），提示SYK过表达可促进NF-κB通路活化。与OE-SYK+Veh+CSE组比较，OE-SYK+R406+CSE组p-IκBα/IκBα和p-p65/p65比值降低（P＜0.05），说明R406可抑制SYK过表达背景下NF-κB通路的活化。与EV+R406+CSE组比较，OE-SYK+R406+CSE组上述指标仍处于较高水平（P＜0.05），提示在SYK高表达状态下，R406对NF-κB通路的抑制作用可能受到一定限制，见表8、图2。

2.6 SYK敲低效率验证

与Control组和si-NC组比较，si-SYK-1组与si-SYK-2组SYK mRNA及蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）。其中，si-SYK-2组SYK mRNA表达降至0.288±0.031，SYK/β-actin降至0.300±0.025，敲低幅度更明显，故后续机制验证采用si-SYK-2进行SYK敲低，见表9、图3。

2.7 SYK敲低减弱CSE诱导的炎症因子表达并抑制NF-κB通路活化

实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示，与si-NC+Veh组比较，si-NC+CSE组TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达水平均明显升高（P＜0.05）；与si-NC+CSE组比较，si-NC+CSE+R406组及si-SYK+CSE组上述炎症因子mRNA表达水平均降低（P＜0.05），提示R406干预和SYK敲低均可减弱CSE诱导的炎症因子转录上调，见表10。

Western blot结果显示，si-NC+CSE组p-IκBα/IκBα和p-p65/p65比值较si-NC+Veh组升高（P＜0.05）；与si-NC+CSE组比较，si-NC+CSE+R406组及si-SYK+CSE组上述通路指标均降低（P＜0.05）。SYK/β-actin在si-SYK+CSE组明显下降（P＜0.05），而在si-NC背景下各处理组间未见明显变化，说明SYK敲低能够在降低靶蛋白表达的同时抑制CSE诱导的NF-κB通路活化，见表11、图4。

2.8 R406干预及SYK敲低降低CSE诱导的p65核转位

免疫荧光结果显示，与si-NC+Veh组比较，si-NC+CSE组p65核/胞质荧光强度比值和p65核转位阳性细胞比例升高（P＜0.05）；与si-NC+CSE组比较，si-NC+CSE+R406组和si-SYK+CSE组上述指标均明显降低（P＜0.05），提示R406干预及SYK敲低均可减弱CSE诱导的p65核转位，见表12、图5。

2.9 NF-κB抑制剂降低CSE诱导的炎症因子表达

与Veh组比较，CSE组TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达水平均明显升高（P＜0.05）；与CSE组比较，CSE+R406组及CSE+BAY 11-7082组上述炎症因子mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05），说明CSE诱导的炎症因子表达与NF-κB通路活化密切相关，也进一步支持SYK抑制剂对炎症反应的干预作用与该通路有关，见表13。

2.10 NF-κB通路活化程度与炎症因子mRNA表达呈正相关

基于SYK敲低补充实验的逐重复数据进行Pearson相关分析。结果显示，p-IκBα/IκBα与TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达均呈显著正相关，相关系数r为0.933～0.988；p-p65/p65与上述炎症因子mRNA表达同样呈显著正相关（r为0.961～0.990，均P＜0.001），见表14。

3 讨　　论

本研究围绕“建模条件确认―药理抑制观察-SYK双向遗传学验证-NF-κB下游功能验证”的技术路线展开。CSE浓度筛选显示，5% CSE处理24 h已可诱导较明确的炎症反应，同时细胞活力仍保留在可用于机制分析的范围内，因此被确定为后续正式刺激条件。选择SYK/NF-κB轴作为研究重点，主要基于两点考虑：其一，SYK是炎症信号转导中的关键激酶，可参与免疫细胞和气道上皮相关促炎反应；其二，NF-κB是调控TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β等炎症因子转录的重要通路^［4-8］。本研究结果显示，CSE处理后炎症因子表达升高、ROS生成增加、细胞存活率下降，并伴随SYK活化，提示该通路可能参与烟雾刺激下的上皮炎症损伤。既往研究显示，CSE可通过ROS-p38活化介导BEAS-2B细胞氧化应激损伤，也可通过Nrf2/HO-1和NF-κB等通路参与炎症、凋亡和氧化应激反应^［12-13］。R406是fostamatinib的活性代谢物，已有研究证实其可抑制SYK相关免疫炎症信号；SYK抑制也被用于哮喘、急性肺损伤和严重流感相关炎症反应的机制研究^{［9-10，14-16］}。肺上皮―巨噬细胞共培养模型已被用于慢性肺病微环境研究^［17］。近年在BEAS-2B及其他气道上皮模型中的研究亦提示，CSE可伴随NF-κB相关炎症信号增强，并诱发氧化应激、细胞活力下降或旁分泌微环境改变^［18-29］。

p-SYK/SYK反映SYK磷酸化水平相对于总SYK蛋白的变化，可用于评价SYK活化状态，而并非仅表示SYK总量改变。本研究结果显示，CSE明显升高p-SYK/SYK比值，R406可降低该指标，并同步减弱炎症因子表达。为避免仅凭药理抑制推断靶点作用，本研究进一步采用SYK过表达和SYK敲低进行双向验证。SYK过表达可放大CSE诱导的炎症因子释放及NF-κB相关蛋白磷酸化，而SYK敲低可降低炎症因子mRNA表达及p-IκBα/IκBα、p-p65/p65水平。上述结果从“增强”和“减弱”两个方向支持SYK参与CSE诱导的炎症放大过程，也增强了R406作用具有SYK相关性的解释力度。对于R406单独处理组部分炎症指标数值略低于Veh组的现象，应谨慎解释。本研究未据此将R406界定为具有明确的基础抗炎作用，而是将其作为SYK药理抑制工具，重点评价其在CSE刺激背景下的干预效应。

在下游通路验证方面，本研究不仅检测了p-IκBα/IκBα和p-p65/p65，还补充了p65核转位免疫荧光及NF-κB抑制剂对照。CSE可显著促进p65由胞质向细胞核转位，而R406干预和SYK敲低均可减弱该变化；同时，BAY 11-7082可降低CSE诱导的多种炎症因子mRNA表达。蛋白磷酸化、亚细胞定位和通路阻断三类证据相互印证，说明NF-κB并非单纯与炎症表型并行变化，而是更可能作为SYK下游的重要促炎执行环节。该结果也使“CSE刺激-SYK活化-NF-κB转录激活―炎症因子上调”的证据链更加完整。此外，基于新增SYK敲低机制实验的逐重复数据进行Pearson相关分析发现，p-IκBα/IκBα及p-p65/p65与TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β mRNA表达均呈显著正相关，进一步支持NF-κB通路活化程度与炎症输出变化之间具有较一致的统计学对应关系。

本研究同时采用THP-1来源巨噬样细胞与BEAS-2B细胞间接共培养模型，观察到共培养状态可增加上皮细胞氧化应激并降低细胞存活率，CSE刺激后损伤进一步加重，而R406具有一定保护作用。这一结果提示，免疫细胞与上皮细胞间的可溶性因子互作可能放大烟雾相关炎症损伤。之所以以细胞实验为主，是因为本研究的首要目标是明确SYK/NF-κB轴是否参与CSE诱导的炎症表型，并验证R406干预的通路基础；体外体系便于同时控制烟雾刺激、药理干预、基因操作和通路阻断条件，适合作为机制研究的第一步。此外，CSE暴露后上皮细胞来源胞外囊泡、外泌体或分泌组可进一步影响巨噬细胞及邻近肺细胞状态^［30-32］，本研究采用上皮-巨噬样细胞互作模型的设计思路与之一致。

本研究的意义在于，将CSE建模筛选、SYK药理抑制、SYK过表达与敲低、p65核转位验证及NF-κB抑制剂对照整合在同一研究框架内，较系统地补强了SYK/NF-κB轴参与吸烟相关气道上皮炎症损伤的体外证据。需要指出的是，本研究仍局限于细胞水平，尚缺乏动物模型和临床样本支持；不同模型中NF-κB作用及上皮免疫应答可受暴露方式、细胞来源和体内微环境影响^［33-35］；此外，目前已补充CSE浓度筛选，但时间梯度及内毒素质控数据仍有待进一步完善。综上所述，CSE可诱导气道上皮相关模型发生炎症反应、氧化应激和细胞活力损伤，并伴随SYK/NF-κB轴活化；R406的保护作用与抑制该通路有关，为后续吸烟相关气道炎症干预研究提供了实验依据。

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基金资助

泰康健投青年医学科研启动基金(AF/SQ-02/01.0)