绵羊PLC-γ1基因真核表达载体的构建及鉴定

袁利明; 陈云蕾; 刘素平; 丁林玲; 吴兰; 赛务加甫

doi:10.13880/j.cnki.65-1174/n.2023.22.034

石河子大学学报（自然科学版） ›› 2023, Vol. 41 ›› Issue (04) : 441 -448. DOI: 10.13880/j.cnki.65-1174/n.2023.22.034

绵羊PLC-γ1基因真核表达载体的构建及鉴定

袁利明, 陈云蕾, 刘素平, 丁林玲, 吴兰, 赛务加甫

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摘要

目的旨在构建携带红色荧光蛋白(RFP)报告基因的绵羊PLC-γ1非融合性真核表达载体。方法在原有PUC57-PLC-γ1克隆载体基础上，对目的片段N端前加入P2A序列和3个连续Flag序列后使用HindⅢ酶和SalⅠ酶双酶切获得P2A-3×Flag-PLC-γ1片段，将其连接至pDsRed2-C1载体获得重组质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1;然后采用Lip 2000转染试剂将该重组质粒转染至HEK-293T细胞，最后利用荧光显微镜、qRT-PCR、Western blot、免疫共沉淀(IP)和免疫荧光(IF)法鉴定重组质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1的表达及亚细胞定位情况。结果双酶切和测序结果显示质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1构建成功，观察到红色荧光；免疫荧光的亚细胞定位检测出PLC-γ1蛋白在细胞质中表达；qRT-PCR和Western blotting法均能检测出PLC-γ1表达，与对照组有显著性差异(P>0.01);免疫共沉淀也纯化分离出含有Flag标签的PLC-γ1蛋白。结论本研究成功构建绵羊PLC-γ1基因的真核表达载体，在P2A肽作用下实现目的蛋白PLC-γ1与DsRed2的表达，构建的载体可用于研究PLC-γ1在早期胚胎发育中的作用。