乏情期发情绵羊卵巢miRNA及相关靶基因筛选

摘要

目的 筛选、鉴定绵羊卵巢差异MicroRNA(miRNA)并研究其调控机制，为绵羊非繁殖季节发情的研究奠定基础。方法 使用Solexa测序技术进行筛选和分析，对发情和乏情绵羊卵巢，差异miRNA的数量和特征进行鉴定，通过实时荧光定量PCR进行检测。还进行了对miR-200c靶基因检测、GO注释和KEGG信号通路富集等的研究工作。并通过TargetScan技术、RNAhybrid技术等，成功找到了MAPK8-3′端非翻译区(3′UTR)与miR-200c的潜在互补结合位点，PCR扩增MAPK8(丝裂原活化蛋白激酶8)基因的3′UTR序列，并成功实现了在psiCHECK2的克隆，成功建立了MAPK8野生型/突变型重组的双荧光素酶报告质粒。接着把野生型psiheck2-MAPK8-3′UTR/突变型psiheck2-MAPK8-mut3′UTR的质粒，与miR-200c mimics/mimics-NC,转染至HEK 293T细胞中，从而通过双荧光素酶的系统，测定双荧光素酶的生物活性。结果 建立了OAN(乏情)和OEN(发情)非繁殖季节绵羊卵巢文库。鉴定出113个差异miRNA,9个为已知miRNA,104个为未知miRNA。在已知miRNA中有6个miRNA显著(P<0.05)上调、3个下调，其中上调倍数最高的为miR-200c。在104个未知的miRNA中，有52个miRNA显著(P<0.05)上调，52个显著(P<0.05)下调。获得候选新miRNA的长度分布主要集中在21～23 nt之间。荧光定量证实，miRNA表达的趋势与测序结果一致。用软件预测到miR-200c的27个靶基因。GO注释发现miR-200c在卵巢组织中介导细胞增殖、迁移、凋亡等过程。KEGG分析表明，miR-200c的靶基因涉及发情相关途径(MAPK信号途径、胰岛素信号通路和GnRH信号途径)以及与卵泡/黄体发育相关的途径，MAPK通路是富集基因最多的通路，共有25个基因被富集。干扰miR-200cmimics,会引起MAPK8基因的Wt型质粒的荧光表达明显减少(P<0.05),而Mut型则没有明显改变。结论 筛选出非繁殖季节发情差异显著(P<0.05)的miRNA有6个。试验研究初步证实了miR-200c与MAPK8的靶向关系，开展了miRNA家族调节绵羊非繁殖季节发情的试验，为深入研究其调控绵羊繁殖及卵泡发育机制提供了试验基础。

关键词

绵羊 / 卵巢 / 非繁殖季节发情 / miR-200c / MAPK8