基于CRISPR/Cas9技术构建PAX3-FOXO1融合基因敲除腺泡状横纹肌肉瘤细胞模型

摘要

目的 使用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除PAX3-FOXO1融合基因的人腺泡状横纹肌肉瘤(ARMS)细胞系(RH30),并验证PAX3-FOXO1功能。方法 运用在线网站针对PAX3、FOXO1设计sgRNA,选择切割效率最高的一组构建LV-PAX3-sgRNA、LV-FOXO1-sgRNA及LV-Cas9慢病毒载体；LV-Cas9病毒感染RH30细胞，潮霉素筛选后，通过RT-PCR及qRT-PCR检测RH30-Cas9细胞中Cas9基因表达；LV-PAX3-sgRNA及LV-FOXO1-sgRNA慢病毒载体分别感染RH30-Cas9细胞，流式分选筛选荧光阳性细胞；Sanger测序、PCR等分别验证RH30-PAX3-KO细胞及RH30-FOXO1-KO细胞中PAX3-FOXO1表达；EDU、TUNEL、Transwell实验检测敲除RH30-PAX3-KO细胞及RH30-FOXO1-KO细胞功能改变。结果 成功构建靶向PAX3、FOXO1的CRISPR/Cas9慢病毒载体；PCR验证稳定表达Cas9的RH30细胞系(RH30-Cas9)构建成功；PCR、Western Blot验证靶向PAX3或FOXO1均成功敲除RH30中PAX3-FOXO1融合基因；靶向PAX3或FOXO1抑制RH30细胞增殖、侵袭、迁移，促进凋亡。结论 使用CRISPR/Cas9成功构建敲除PAX3-FOXO1的RH30细胞系；敲除PAX3-FOXO1抑制了RH30细胞增殖、迁移等恶性生物学行为。

关键词

横纹肌肉瘤 / PAX3-FOXO1 / CRISPR/Cas9 / 基因编辑