Neuritin C56S突变对Neuritin蛋白结构、活性和热稳定性的影响

摘要

目的 蛋白质分子内半胱氨酸残基形成的二硫键是维持蛋白质结构非常重要的稳定力。本研究通过突变Neuritin蛋白活性片段的C56S,观察56位点的半胱氨酸对Neuritin蛋白的结构形式、活性及热稳定性的影响。方法 通过分析实验结果和来自生物信息学的结构预测，明确了突变位点；利用重叠延伸PCR技术，构建了插入正确的pPIC9K-Neuritin C56S突变体穿梭质粒；电转入毕赤酵母GS115后，经G418抗药性筛选、基因型鉴定和高表达筛选，成功获得了突变体酵母重组子，并最终得到了表达量最高的菌株；利用我们已建立的纯化工艺，对Neuritin C56S突变体蛋白进行纯化，并对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE还原电泳考马斯亮蓝染色鉴定、Western blot免疫原性鉴定；随后利用SDS-PAGE非还原电泳考马斯亮蓝染色完成存在形式的鉴定；利用本课题组前期按照药典建立的重组Neuritin蛋白生物学活性检定方法，通过观察海马神经元HT22细胞存活情况，检测Neuritin C56S突变体蛋白的活性；并完成了在37℃下，不同时间点Neuritin C56S突变体纯化蛋白降解情况的检测分析。结果 构建了Neuritin C56S突变体的毕赤酵母表达系统，筛选出其表达量最高的毕赤酵母重组子菌株，得到了蛋白纯度为98%的重组人Neuritin C56S突变体纯化蛋白；与未突变的Neuritin蛋白相比，突变体蛋白中未见多聚体，二聚体增多，说明Neuritin C56S突变体蛋白单体中只有一个自由的半胱氨酸残基，只能形成二聚体，不能形成多聚体，因此可以推断其它链内二硫键稳定，不稳定的链内二硫键为C56-C4;同时，由于只有1个自由的半胱氨酸，其二聚体只能形成一个链间二硫键，因此37℃,14 d, Neuritin C56S突变体蛋白的降解明显增高。结论 Neuritin蛋白中C56-C4间的链内二硫键为不稳定结构；Neuritin蛋白C56S的点突变，影响了该蛋白自然状态下的结构形式，并进一步影响了它的活性和热稳定性。

关键词

Neuritin蛋白 / 半胱氨酸 / 二硫键 / 蛋白活性 / 热稳定性