超声辅助氯化胆碱基低共熔溶剂提取银杏叶中多酚

Ultrasound-assisted extraction of polyphenols from Ginkgo biloba leaves using choline chloride-based deep eutectic solvent

摘要

考察了超声辅助低共熔溶剂（Deep eutectic solvents-based ultrasound-assisted extraction,DES-UAE）提取银杏叶多酚化合物的效果，在制备的7种低共熔溶剂（Deep eutectic solvent,DES）中，氯化胆碱-乳酸因其优异的提取性能被认为是多酚提取的良好提取溶液.以多酚提取量为响应值，采用响应面法探究工艺参数对提取率的影响，而且根据提取的效果不断优化提取的工艺条件.结果表明，在40 kHz频率的超声中，使用氯化胆碱∶DL-乳酸的物质的量比为1∶3、DES中水体积分数为32.32%，提取时间50.5 min、液固比27.30 mL/g的条件下，从银杏叶提取得到13.73%的多酚物质.上述结果为银杏叶多酚化合物的提取提供了新思路，体现出了DES提取多酚化合物的优势.

关键词

银杏叶多酚 / 低共熔溶剂 / 福林-酚比色法 / 超声提取 / 响应面法 / 绿色提取

Key words

Ginkgo biloba polyphenols / deep eutectic solvents / Folin-Ciocalteu colorimetry / ultrasonic extraction / response surface method / green extraction

银杏是银杏科的落叶树种.它是第四纪冰川之后留下的最古老的裸子植物遗存，因此被称为“活化石”^［1］.银杏叶中富含黄酮和酚类化合物，展现出对多种疾病具有显著的药理作用及保护性活性，其应用范围广泛，包括脑血管及神经系统疾病、心血管疾病、内分泌系统疾病、肌肉骨骼疾病、肾脏疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病以及免疫相关疾病等^［2-3］.对于具有巨大的潜在的医药价值的银杏叶，其多酚（酸酯类多酚和黄烷醇类多酚或原花色素等）活性物质的提取研究也日益受到重视^［4］.

采用有机溶剂提取法提取多酚，需耗费大量有机试剂，易导致环境污染及产品存在安全隐患，同时，其操作流程繁琐，耗时较长，不利于活性成分的有效提取.鉴于此，针对银杏叶多酚化合物的提取，迫切需要研发一种既遵循绿色化学理念，又兼具安全性与高效性的新型提取溶剂.低共熔溶剂通常由氢键供体（Hydrogen bond donor，HBD）和氢键受体（Hydrogen bond acceptor，HBA）组成的两组分或三组分的低熔点共熔混合物，是具有优异性能的新型溶剂^［5-6］.其优点包括不易燃性、极低蒸气压和较广谱的溶解性，并且可由食品级物质构成，对环境和产品无害^［7］.而且大多数的低共熔溶剂（Deep eutectic solvents， DES）都易于制备、价格低廉并且可生物降解^［8］.因此DES在提取多种非极性或极性化合物方面有突出的优势^［9-10］，广泛应用于提取天然小球藻多酚^［11］、黄酮^［12］、石斛多糖^［13］、蛋白质^［14］和生物碱^［15］等物质.

多酚提取所采用的主要技术手段涵盖回流提取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法以及亚临界萃取法等^［16］.其中，超声辅助提取法作为一种广泛应用的技术手段，相较于其他提取技术，超声辅助提取法呈现出诸多明显优势，具体体现在提取周期较短、提取效率高、操作流程简便高效且应用领域广泛^［17-19］.

本文以廉价无毒的氯化胆碱作为HBA和不同的HBD制备一系列DES，以此DES系列在超声中提取银杏叶多酚，通过使用单因素试验分析各因素的影响效果和用响应面设计优化提取的工艺条件，为银杏叶多酚的绿色开发及DES在天然产物绿色提取工艺提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料银杏叶采自2022年8月采自云南民族大学校园内，由云南民族大学民族医药学院杨青松教授鉴定，标本号：20220824，存放于化学与环境学院标本室；氯化胆碱、羟基乙酸、草酸、尿素、丙三醇、1，2－丙二醇、没食子酸、磷酸、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、碳酸钠分析纯，购自于上海阿达玛斯（Adamas）试剂有限公司；乙二醇，分析纯，购自于广东西陇科学股份有限公司；DL－乳酸，分析纯，购自于天津科密欧化学试剂有限公司；浓盐酸，分析纯，购自于重庆川东化工有限公司；溴水，分析纯，购自于上海超研生物科技有限公司.

分光光度计（WFJ－7200）购自于上海尤尼柯仪器有限公司；粉碎机（SD－YM1502）购自于克尼普斯有限公司；超声波清洗机（SB－120D），频率40 kHz、功率120 W，购自于宁波新芝生物科技股份有限公司；电动离心机（80－2），功率40 W、调速范围0 ~ 4 000 r/min，购自于金坛市天竟实验仪器厂；数显恒温水浴锅（HH－4）购自于金坛市富华仪器有限公司；电子分析天平（AL－204）购自于广州南创电子科技有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 DES的制备

本实验采用热制备方法来制备提取溶剂DES，根据物质的量比精确称量并混合DES的组分.将混合物在80 ℃下加热搅拌直至形成均匀的液体DES.将制备的DES在室温下放置过夜，观察组分是否沉淀.如果无沉淀，DES可以用于实验.本实验使用的DES如表1所示.

1.2.2 银杏叶中多酚的提取工艺流程

银杏叶清洗→50 ℃烘干过夜→粉碎过80目筛→加入DES搅拌→超声辅助提取→离心→过滤→浓缩提取液→分析多酚的质量分数.

1.2.3 银杏叶多酚提取单因素试验

在超声功率恒定为120 W的条件下，通过单因素试验选择出1种提取效果最佳的DES来研究超声时间（t）、液固比和DES中水体积分数这3个因素对银杏叶多酚提取率的影响，从而确定最适合DES提取多酚化合物的工艺条件.

1） DES的选择

准确称取1.00 g粉碎过的银杏叶粉末7份，分别加入25 mL 表1列出的7种水体积分数为30%的DES，在室温下进行超声辅助提取50 min，研究DES的种类对银杏叶多酚提取率的影响，从而得到最适合用于提取银杏叶多酚的DES.

2） 超声时间的选择

准确称取1.00 g处理好的银杏叶粉末9份，分别加入25 mL水体积分数为30%的DES - 2，在室温下分别进行超声辅助提取10、20、30、40、50、60、70、80和90 min，探究超声时间对银杏叶多酚提取率的影响.

3） 液固比的选择

准确称取1.00 g处理好的银杏叶粉末6份，分别加入液固比为10、15、20、25、30和35 mL/g，30%水体积分数的DES - 2，在室温下进行超声辅助提取50 min，探究液固比对银杏叶多酚提取率的影响.

4） DES水量的选择

准确称取1.00 g处理好的银杏叶粉末6份，分别加入25 mL含水体积分数为10%、20%、30%、40%、50%、60%的DES - 2，在室温下进行超声辅助提取50 min，探究DES中水体积分数对银杏叶多酚提取率的影响.

1.2.4 银杏叶多酚质量分数的测定

1） 福林－酚（Folin－Ciocalteu）试剂的配制

按照文献［20］中的方案制备福林-酚试剂.用分析天平准确称取10.00 g钨酸钠和2.50 g钼酸钠，然后将它们混合倒入250 mL的圆底烧瓶中，加入70 mL蒸馏水，再慢慢滴入5 mL体积分数为85%磷酸和10 mL浓盐酸，摇匀，连接回流冷凝装置，保持微沸冷凝回流10 h.滴加蒸馏水将冷凝管上的附着物冲入烧瓶中使其反应充分，取下冷凝管并少量多次地加入15 g无水硫酸锂和几滴溴水，开口继续加热让溴水挥发直至溶液颜色变为黄绿色.待溶液冷却至室温后过滤，储存在棕色瓶并放在冰箱里保存备用.

2） 标准曲线的绘制

准确称取0.020 g的无水没食子酸，将其定容于100 mL的容量瓶中，配制成200 mg/L的没食子酸水溶液.然后分别准确取 0、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 g没食子酸标准溶液定容于50 mL容量瓶内，加10 mL蒸馏水和2 mL福林－酚试剂，充分摇匀，立即加入10 mL质量分数为10%的Na₂CO₃溶液，加水定容并混合均匀.然后在40 ℃下避光放置反应2 h，以试剂样为空白，在756 nm处用分光光度计测定吸光度A ^［20］.以吸光度为纵坐标，没食子酸标准溶液的质量浓度m为横坐标，绘制标准曲线（图1），得A = 0.128 6 m + 0.006 7，R ² = 0.999 3.

3） 银杏叶多酚提取率的测定

银杏叶多酚质量分数和提取率的测定使用Folin－Ciocalteu比色法.取1.0 mL银杏叶多酚提取液于50 mL容量瓶内，加10.0 mL蒸馏水，再加2.0 mL福林－酚试剂，摇匀，静置30 s后慢慢滴入10.0 mL质量分数为10%的Na₂CO₃溶液，加水定容并混合均匀.制备试剂空白之后，在40 ℃下避光反应2 h，在765 nm波长处测量吸光度，根据标准曲线方程计算银杏叶提取液中多酚质量分数（以没食子酸计），并通过带入公式（1）得到该提取液的多酚提取率.

Y = \frac{CV}{M} \times \mathrm{100} \mathrm{\%}.（1）

式中：Y表示银杏叶多酚的总提取率（%）；V表示提取多酚液体积（mL）；C表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度（mL/g）；M表示使用的银杏叶的质量（g）.

4） 响应面优化试验设计

根据单因素试验的结果优化DES超声辅助提取银杏叶多酚的条件，根据 Box-Benhnken设计的组合变量，即超声时间、液固比和DES中水体积分数作为自变量，以多酚提取率为响应值，进行多酚提取条件的优化.设计响应面试验因素和水平见表2.

1.3 数据处理

所有实验均重复3次及以上后进行因素实验数据处理和响应面实验设计及数据处理.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 不同DES提取银杏叶多酚效率的对比分析

DES的结构是由HBA和HBD通过形成氢键网络构成的，其组成的选择与组分之间形成的氢键网络的特性对其银杏叶多酚的提取效果有明显的影响.不同DES对银杏多酚提取量的影响如图2所示.

由图2可知，这7种DES中DES－7和DES－6明显高于其他的DES对银杏多酚提取的效果，而且最高的DES－7的提取率达到了13.51%.其提取率最高的原因可能是因为其黏度较小，分散性好，能够促进多酚化合物向提取液中的扩散.另一方面是DES－7的极性与多酚提取物的极性较为接近，也更加符合相似相溶的原理.其中DES－1、DES－3和DES－6的提取效果不佳的原因可能是黏度较大，不利于细胞壁的渗透和多酚化合物的运输.由于DES－2与DES－5的极性与待提取物的极性相差较大，导致提取的效果最差.因此，后续选择DES－7以优化提取工艺的试验.

2.1.2 超声时间对银杏叶多酚提取率的影响

提取时间的长短会影响到待提取物是否充分溶出.由图3可知，多酚提取率开始是随着超声时间的延长而快速上升，随后上升变慢，到最高点后又逐渐下降.可能是开始时随着超声时间的延长，其多酚化合物在提取液中的扩散也越来越充分.然后，随着扩散接近平衡，提取率增长的速度也在变慢，到最高提取率后，受到超声发热的影响和过度超声导致部分多酚化合物水解的影响，同时也伴随着更多的杂质也被提取，导致多酚提取率开始下降.而且超声时间过长也会带来增加能耗提高成本的问题，因此，50 min为最佳超声时间，其多酚提取率为13.31%.

2.1.3 液固比对银杏叶多酚提取量的影响

提取液和待提取物间的浓度差是提取过程的重要推动力，适当的液固比可以保持良好的浓度差，从而使多酚化合物能够得到充分地提取（图4）.在液固比低于25 mL/g时，多酚提取率随提取液的增加而增加，可能是因为液固比较低导致目标物不能全部溶出.而在液固比大于25 mL/g时，多酚提取率随之下降，这可能是提取液的增加也提高了其他可溶性杂质的溶出，从而相对降低了多酚的比率.另外，过多的提取液可能会更多的消耗超声的能量，从而降低超声的效率.因此，液固比为25 mL/g为最佳液固比，对应的多酚提取率为13.46%.

2.1.4 DES中水体积分数对银杏叶多酚提取率的影响

DES中形成的氢键会增大DES的黏度，而在DES中加水可以适当的调节DES的黏度和极性，从而更有利于提高待提取物在提取过程中的传质速度.从图5可知，随着水体积分数的增加，银杏叶多酚提取率表现出先上升再下降的趋势，这可能是因为水的加入降低了DES的黏度，从而促进了多酚化合物在提取液中的传质，并且提高了DES的极性也更加促进了对目标物的提取.但是随着水体积分数进一步增加，DES中的氢键受到影响.当极性又慢慢超过目标物时，其水体积分数开始抑制对目标物的提取过程.因此，DES中水体积分数30%为最佳实验条件，对应的多酚提取率为13.37%.

2.2 响应面设计优化分析

2.2.1 响应面试验试验结果及方差分析

响应面试验结果见表3，方差分析见表4.通过对表3中的数据进行多元回归模型拟合，获得银杏叶多酚提取率（Y）对应自变量的二次多项式回归方程为Y=13.35 + 0.15A + 0.42B + 1.08C - 0.082AB + 0.19AC - 0.37BC - 0.46A² - 0.19B² - 1.71C².由表4可知，得到回归方程模拟的P < 0.000 1，表明水平差异极显著，而失拟项P为0.123 5大于0.05，表明水平差异不显著，表明实际结果和数学模型拟合较好，因为响应值和自变量显著，因此可以用于多酚提取率的分析和预测.决定系数R² = 0.983 3，与校正决定系数R _Adj ² = 0.961 8相近，表明多酚提取率的预测值与实际值拟合度较好.3个因素对银杏叶多酚提取的影响由强到弱为水体积分数 > 液固比 > 超声时间；且各因素相互作用时可以看出，水体积分数和液固比对多分提取率的影响显著，超声时间与水体积分数相互作用以及超声时间与液固比相互作用对银杏叶多酚提取率的影响不显著.

2.2.2 模型的响应面分析

从3D响应面图中可以明显看到，当曲线越陡峭则说明该因素对银杏叶多酚的提取率影响越大，等高线若为椭圆形，则说明两因素的交互作用比较强，等高线密集程度越高则表明此因素对响应值的影响也越显著.由图6中可以观察到明显的曲线和等高线变化，结果表明水体积分数对银杏叶多酚提取率影响显著，其顺序依次为水体积分数、料液比、超声时间；影响银杏叶多酚提取率的各交互作用因素顺序为BC > AC > AB.通过建立数字模拟方程，发现在超声时间为50.5 min，液固比为27.30 mL/g，水体积分数为32.32%的最佳的提取工艺参数下，银杏叶多酚的理论最高提取率为13.86%.再经过3次平行实验得到的银杏叶多酚提取率平均值为13.73%.该值与理论值接近，说明使用响应面法来优化银杏叶多酚的提取工艺有着良好的效果.

3 结语

以银杏叶为原料，采用超声辅助DES提取法对银杏叶中的多酚化合物进行高效快速提取.通过单因素试验和响应面法得出了最佳工艺为DES的氢键供体为氯化胆碱，氢键受体为DL－乳酸，二者物质的量比为1∶3，超声时间为50.5 min，水体积分数为32.32%，液固比为27.30 mL/g时，多酚提取率最高为13.73%.相比较于传统提取方法DES提取法不仅在成本、安全性、环保性等具有突出的优势，在银杏叶多酚化合物的提取率上也明显高于通过传统溶剂提取的得率（12.45%）.此类工艺将DES与天然产物的提取有效地结合，并且采用DES取代了常规的有机试剂，既实现了绿色环保，又为银杏叶多酚化合物的提取提供了新思路，体现了DES提取多酚化合物的优势.

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基金资助

国家自然科学基金(21862023)