紫皮石斛和铁皮石斛中多糖提取工艺及抗氧化活性研究

column:Study on the extraction technology and antioxidant activity of polysaccharide from Dendrobium devonianum and Dendrobium officinale

摘要

研究水提法中提取时间、提取液倍数和提取次数以及不同提取方式对不同种类石斛多糖质量浓度的影响.结果表明，未经处理过的人工大棚种植的紫皮石斛多糖质量浓度最高，仿野生种植紫皮石斛次之.在相同条件下，使用Sevag试剂进行脱蛋白处理后，3种石斛中多糖的质量浓度均显著下降，其中仿野生种植紫皮石斛的损耗率最大，高达17.7%.此外，紫皮石斛和铁皮石斛中多糖对羟基自由基的清除效果较好，粗多糖及其纯化后的多糖对自由基和DPPH自由基也具有一定的清除能力.不同石斛种类和种植方式导致了3种石斛样品在粗多糖和纯化多糖质量浓度及活性方面存在差异.

关键词

铁皮石斛 / 紫皮石斛 / 粗多糖 / 抗氧化活性

Key words

Dendrobium officinale / Dendrobium devonianum / crude polysaccharide / antioxidant activity

紫皮石斛（Dendrobium devonianum Paxton）与铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura & Migo）均为兰科石斛属多年生附生草本植物^［1－4］.在众多石斛品种中，铁皮石斛药用价值最高，滋补效果最佳，日常用量最多；紫皮石斛次之^［5］.两者均以茎或干燥茎作为食材、滋补品或药材使用，但人们对铁皮石斛的认可度更高.近年来，云南龙陵致力于开发优质的紫皮石斛衍生食品、药品和滋补产品.然而，由于对紫皮石斛了解甚少，影响其推广与销售.实验研究表明，石斛的主要有效成分为石斛多糖^［6］.本实验采用水提醇沉法，探讨了不同提取时间、提取次数、提取液倍数对仿野生紫皮石斛、人工大棚种植紫皮石斛及人工大棚种植铁皮石斛3种石斛中多糖提取与纯化过程的影响.此外，使用紫外分光光度法比较了3种石斛样品中粗多糖和纯化后多糖对Fenton反应产生的羟自由基、以及DPPH自由基的清除作用^［7－13］.实验和数据分析在客观反映两者石斛多糖的质量浓度、提取工艺及抗氧化活性的差异，以及不同种植方式对上述参数的影响，从科学的角度选择优质的石斛.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛和紫皮石斛采自云南省保山市龙陵县龙山镇杨梅山种植基地，铁皮石斛和紫皮石斛经过鉴定后，在60 ℃下干燥、粉碎、过60目筛后保存于实验室备用；葡萄糖、硫酸、卵磷脂、蒽酮、DPPH、邻苯三酚、无水乙醇等试剂均为分析纯.样品1为仿野生紫皮石斛；样品2为人工大棚种植紫皮石斛；样品3为人工大棚种植铁皮石斛.

1.2 仪器与设备

岛津SHIMADZU型电子分析天平；上海尤尼柯仪器有限公司UNICO－7200型可见分光光度计；岛津UV－1800型紫外－可见分光光度计；上海亚荣生化仪器厂RE－52－05型旋转蒸发仪；上海安亭科学仪器厂TDL－40B型离心机.

1.3 方法

1.3.1 3种石斛粗多糖的提取

取实验样品仿野生紫皮石斛、人工大棚种植紫皮石斛、人工大棚种植铁皮石斛，依据2020版《中国药典》一部中，铁皮石斛项下粗多糖的提取与制备^［14］.

1.3.2 3种石斛提取液中粗多糖质量浓度的测定

石斛多糖质量浓度测定参考2020版《中国药典》一部中的苯酚－硫酸法进行.铁皮石斛项下粗多糖的质量浓度测定分析方法制备标准曲线.以吸光度为纵坐标，多糖浓度为横坐标，绘制吸光度与葡萄糖质量浓度的标准曲线.曲线方程为Y=17.60X + 0.118，相关系数R ² = 1.000 0.

1.3.3 提取工艺对3种石斛多糖提取的影响研究

1） 提取时间对3种石斛多糖质量浓度的影响

将1.3.1中制备的实验样品分别加入提取液倍数35倍的纯化水175 g，称量.回流提取分别进行20、40、60、80和100 min，产物放置至室温后用蒸馏水补足损失的重量.将回流产物摇匀后以4 000 r/min离心5 min，取出上清液并测量其体积.将25 mL上清液与100 mL无水乙醇混合，充分摇匀后放置于冰水混合物中1 h，然后进行多糖沉淀处理.将沉淀复溶后定容至25 mL作为供试液备用，测定多糖质量浓度.

2） 提取液倍数对3种石斛多糖质量浓度的影响

将1.3.1中制备的实验样品分别加入提取液倍数为25、30、35、40和45倍的纯化水（对应的质量分别为125、150、175、200和225 g），称量后按照1）中的最佳实验条件提取.提取产物放置至室温后用蒸馏水补足损失的重量，摇匀后以4 000 r/min离心5 min，取出上清液并测量其体积.将25 mL上清液与100 mL无水乙醇混合摇匀后置于冰水混合物中1 h，然后进行多糖离心沉淀处理.将沉淀复溶后定容至25 mL作为供试液备用，测定多糖质量浓度.

3） 提取次数对3种石斛多糖质量浓度的影响

将1.3.1中制备的实验样品加入2）中最佳提取液倍数的纯化水并称量.按照1）中的最佳提取时间进行提取，提取产物放置至室温后用超纯水补足损失的重量，摇匀后以4 000 r/min离心5 min.取出上清液并测量其体积，将剩余的滤渣按照相同条件分别提取1、2、3和4次后，将提取次数相同的提取液合并、摇匀并保存.将25 mL上清液和100 mL无水乙醇混合摇匀后，置于冰水混合物中1 h，然后进行多糖离心沉淀处理.将沉淀复溶后，定容至25 mL作为供试液备用，测定多糖质量浓度并计算出每个样品的总多糖质量浓度.

4） 3种石斛多糖提取正交实验设计

根据3种石斛样品的单因数试验条件，选取提取时间为A1、A2、A3；提取液倍数比为B1、B2、B3；提取次数为C1、C2、C3；对以上3因数进行L₉（3⁴）正交试验设计.

5） Sevag试剂脱蛋白对3种石斛中多糖质量浓度的影响

将3）中提取4次制备的多糖样品分别取出25 mL，加入3倍体积的Sevag试剂进行3 ~ 5次脱蛋白处理，定容至25 mL作为供试液，最后分别计算出各样品脱蛋白后的总多糖质量浓度.比较Sevag试剂脱蛋白对仿野生紫皮石斛、人工大棚种植紫皮石斛、人工大棚种植铁皮石斛多糖质量浓度测定的影响.

6） 3种石斛样品提取液中多糖质量浓度的测定

将3）和4）中石斛样品第1次多糖提取液稀释100倍后，按照1）进行显色并测定吸光度，每个样品平行测定3次，按标准曲线方程计算石斛多糖样品提取液中多糖的质量浓度并计算相对标准偏差（RSD）.

1.3.4 石斛样品粗多糖抗氧化活性测定

1） 3种石斛多糖清除羟自由基的活性测定

采用羟自由基可以使番红花红褪色的试验方法来研究仿野生种植紫皮石斛、人工大棚种植紫皮石斛和人工大棚种植铁皮石斛多糖对羟自由基的清除能力.取1.0 mL pH为7.4的5.0 × 10^－2 mol/L磷酸缓冲溶液，1.0 mL 40 μg/mL的番红花红溶液、1.0 mL 9.4 × 10^－4 mol/L（临用现配）的EDTA－Fe （Ⅱ）溶液、实验样品粗多糖溶液0.5 mL、体积分数3% H₂O₂（临用现配）1.0 mL，将样品混合均匀后置于（37 ± 0.5） ℃的恒温水槽中反应30 min.反应结束后，在波长520 nm处测定吸光度A ₁.将0.5 mL蒸馏水代替上述混合样品中的粗多糖溶液，测定其吸光度A ₀作为空白组.将1.5 mL蒸馏水代替上述混合样品中H₂O₂和粗多糖溶液，测定其吸光度A作为对照组.随后，使用以下公式（1）计算清除率^{［15－16］}.

\mathrm{清除} \mathrm{率} = \left(\mathrm{1}-\frac{A_{\mathrm{1}}-A_{\mathrm{0}}}{A-A_{\mathrm{0}}}\right) \times \mathrm{100} \%.（1）

2） 3种石斛多糖清除DPPH自由基的活性测定

分别取2.0 mL含不同质量浓度的铁皮石斛和紫皮石斛多糖样品溶液于试管中，2.0 mL 2 × 10^－4 mol/L加入DPPH溶液，混合均匀后静置30 min.使用空白溶剂作为参比，用紫外可见分光光度计在517 nm波长处测定其吸光度为A₁，测定2.0 mL DPPH溶液与溶剂混合后溶液的吸光度为A₀，取不同质量浓度粗多糖溶液2.0 mL与2.0 mL溶剂混合后的吸光度A₂，并公式（2）计算清除率^{［17－18］}.

\mathrm{清除} \mathrm{率} = \left(\mathrm{1}-\frac{A_{\mathrm{1}}-A_{\mathrm{2}}}{A_{\mathrm{0}}}\right) \times \mathrm{100} \%.（2）

2 结果与分析

2.1 提取时间对3种石斛多糖质量浓度的影响

由图1所示，在提取液倍数为35倍、提取次数为1次的条件下，仿野生种植紫皮石斛、人工大棚种植紫皮石斛和人工大棚种植铁皮石斛在多糖提取率随提取时间的变化而变化.提取时间在20 ~ 60 min内，多糖提取率随提取时间的增加而快速增加；提取时间在60 ~ 100 min内，多糖提取率随提取时间的增加而缓慢增加.这是因为随着提取时间增加，石斛多糖的溶出增加.当提取时间超过60 min后，水溶液中的多糖已经趋于饱和，石斛多糖溶出不再随时间增加.根据上述实验结果，选取提取时间为60 min作为单因数考察参数，选取提取时间为50、60和70 min作为正交试验的参数.

2.2 提取液倍数对3种石斛多糖提取率的影响

由图2所示，在提取时间为60 min、提取次数为1次的条件下，仿野生种植紫皮石斛、人工大棚种植紫皮石斛和人工大棚种植铁皮石斛多糖提取率随提取液倍数的变化而变化.提取液倍数在20 ~ 30范围内，多糖提取率随提取液倍数的增加而显著提高；提取液倍数在30 ~ 40范围内，多糖提取率随提取时间延长呈现平缓增加的趋势.这是因为随着提取时间的增加，石斛中的多糖能够更充分地溶解.当提取液倍数达到一定值时，进一步增加溶剂量并不能显著增加多糖的溶解度，提取液倍数的增大，导致石斛中杂质的溶出，抑制了石斛多糖的提取，使得石斛多糖提取率呈现先增大后平稳的趋势.由以上可知，提取液倍数为35为最佳提取条件，但是考虑到生产过程中能耗的消耗以及提取的便携性，因此，选取提取液倍数为30作为单因数考察参数，并选取提取液倍数为25、30和35作为正交试验的参数.

2.3 提取次数对3种石斛多糖质量浓度的影响

图3为在提取时间为60 min、提取液倍数为30的条件下，仿野生种植紫皮石斛、人工大棚种植紫皮石斛和人工大棚种植铁皮石斛的多糖提取率随提取次数的变化.在提取次数为1 ~ 2时，多糖提取率随提取次数的增加而快速增加；提取次数超过3后，多糖提取率的增加趋于缓慢.这是因为石斛多糖易溶于水溶液，在一定提取时间和提取液倍数条件下，石斛多糖溶液趋于饱和，同时该趋势也会受到杂质溶出的影响.经过2次提取后，石斛中的大部分多糖已经被溶解.综上所述，选取提取次数为2、3和4作为正交试验的参数.

2.4 3种石斛多糖提取正交实验设计

根据对仿野生紫皮石斛、大棚紫皮石斛、大棚铁皮石斛中多糖提取的单因数影响试验，选取提取时间为50、60和70 min，提取液倍数比为25、30和35和提取次数为2、3和4，建立上述3种因素对3种石斛中石斛多糖影响的正交试验L₉（3⁴），具体实验方案见表1.

由表2可知，仿野生紫皮石斛多糖最佳提取条件为A2B2C3，最大提取率为42.21%；大棚紫皮石斛多糖最佳提取条件为A2B2C3，最大提取率为45.18%；大棚铁皮石斛多糖最佳提取条件为A1B3C3，最大提取率为41.39%.虽然不同紫皮石斛的种植方式具有相同的最佳提取工艺，但是人工种植的紫皮石斛具有更高的多糖质量分数，这是由于石斛品种的不同而造成的差异.在大规模生产中，考虑到生产的效率和能耗，3种石斛的多糖提取条件均建议采用A1B2C2.

由单因数实验可知，提取时间在20 ~ 60 min内，多糖提取率随提取时间的增加而快速增加；在60 ~ 100 min内，多糖提取率随提取时间的增加而缓慢增加.提取液倍数在20 ~ 30内，多糖提取率随提取液倍数的增加而迅速增加；在30 ~ 40范围内，多糖提取率随提取时间的延长而呈现平缓增加的趋势.提取次数提次数为1 ~ 2时，多糖提取率随提取次数的增加而大幅增加；提取次数超过3后，多糖提取率增加缓慢.

结合表3可知，在多糖提取过程中，3种石斛中的多糖在较短时间内就能充分溶解，因此，延长提取时间并不会显著增加多糖的提取量.此外，石斛多糖的物理化学性质较为稳定，在提取过程的初期就已经达到饱和，延长提取时间并不会导致更多的多糖释放.因此，提取时间对多糖提取影响不显著；但是增加提取液倍数和提取次数，石斛多糖的饱和溶解状态被打破，可以溶解更多的石斛多糖并形成新的平衡状态，从而提高石斛多糖的提取率.综上所述，提取液倍数、提取次数对多糖的提取率影响显著.

2.5 Sevag试剂脱蛋白对3种石斛中多糖提取率的影响

由图4可见，不同石斛样品中的多糖提取率按照人工大棚种植的紫皮石斛、仿野生种植的紫皮石斛、人工大棚种植的铁皮石斛的顺序依次递减.采用Sevag试剂对粗多糖脱蛋白后，多糖提取率显著下降，但多糖提取率仍然按照人工大棚种植的紫皮石斛、仿野生种植的紫皮石斛、人工大棚种植的铁皮石斛的顺序递减.此外，仿野生铁皮石斛、人工大棚种植紫皮石斛、人工大棚种植铁皮石斛脱蛋白后的多糖提取率明显下降，说明脱蛋白处理对多糖提取率影响显著.这可能是由于脱蛋白处理导致部分以糖蛋白形式的多糖被洗脱，使得多糖提取率下降.

2.6 Sevag洗脱前后3种石斛样品提取液中多糖的测定

采用Sevag试剂对仿野生紫皮石斛多糖提取液进行粗多糖脱蛋白后，平行3次进行多糖质量浓度测定.结果表明，采用Sevag试剂处理前后粗多糖脱蛋白样品提取液中石斛多糖质量浓度浓度为7.51和6.18 mg/mL，测定的RSD分别为1.4%和0.9%；洗脱后多糖减少17.7%.采用上述相同方法对人工紫皮石斛多糖提取液进行处理，处理前后的石斛粗多糖质量浓度分别为8.10和7.34 mg/mL，测定RSD均为1.1%；洗脱后多糖减少9.4%.采用上述相同方法对人工铁皮石斛多糖提取液进行脱蛋白处理，处理前后的石斛多糖质量浓度分别为7.35和6.26 mg/mL，测定的RSD分别为1.6%和1.3%；洗脱后多糖减少14.8%.上述3种样品测定结果的RSD均小于2%，说明所用试验方法具有较好的精密度.综上所述，仿野生的紫皮石斛多糖的洗脱损失率最大，高达17.7%，其次是人工大棚种植的铁皮石斛，损失率为14.8%，人工大棚种植的紫皮石斛损失率最小，仅为9.4%.

2.7 3种石斛多糖清除羟自由基活性的测定

不同石斛样品对Fenton反应产生的羟基自由基的清除率不同（图5）.当多糖质量浓度小于1.8 mg/mL时，清除率随着粗多糖质量浓度的增加而提高；当粗多糖质量浓度达到1.8 mg/mL或以上时，清除率趋于平稳.序号为1至6的样品的最大清除率分别为97.66%、98.35%、96.51%、97.21%和97.27%.当粗多糖质量浓度小于1.8 mg/mL时，大棚种植的紫皮石斛多糖对羟基自由基的清除率高于仿野生种植的紫皮石斛；而当粗多糖质量浓度达到1.8 mg/mL或以上时，仿野生种植的紫皮石斛多糖的清除率高于大棚种植的紫皮石斛.在多糖质量浓度达到或超过1.8 mg/mL时，紫皮石斛和铁皮石斛多糖的清除率均超过95.00%，表现出较好的清除效果.对于采用Sevag试剂脱蛋白的样品，紫皮石斛的脱蛋白样品的清除率低于未脱蛋白样品，而铁皮石斛的脱蛋白样品则显示出高于未脱蛋白样品的清除率.

2.8 3种石斛多糖清除自由基DPPH的活性测定结果

图6为铁皮石斛和紫皮石斛对DPPH自由基的清除率.当多糖质量浓度小于5.0 mg/mL时，清除率随着粗多糖的质量浓度增加而提高；当粗多糖质量浓度达到或超过5.0 mg/mL时，清除率趋于稳定；当粗多糖质量浓度在1.0 ~ 6.0 mg/mL范围内时，大棚种植紫皮石斛多糖对DPPH自由基的清除率高于仿野生种植的紫皮石斛多糖.这说明紫皮石斛和铁皮石斛多糖对羟基自由基的清除率均具有较好的清除效果.当多糖质量浓度达到或超过5.0 mg/mL时，序号为1 ~ 6的样品最大清除率可分别为40.21%、40.99%、41.88%、43.37%、41.27%和40.28%.以上6个样品对DPPH自由基的清除率均超过39.00%；采用Sevag试剂对粗多糖脱蛋白处理后，紫皮石斛脱蛋白的样品清除率低于未脱蛋白样品，而铁皮石斛脱蛋白样品的清除率高于未脱蛋白样品.

3 结语

石斛多糖的提取率受提取时间、提取液倍数和提取次数的影响.人工大棚种植的紫皮石斛多糖提取率最高，其次是仿野生种植的紫皮石斛，而人工大棚种植的铁皮石斛多糖提取率最低.同时，不同种植方式的紫皮石斛以及相同种植方式的铁皮石斛与紫皮石斛的多糖提取率差异显著.这可能是由于不同种植方式产生的多糖种类不同，或是由于不同石斛品种中活性多糖和糖蛋白质量浓度的差异所致.实验结果表明，紫皮石斛的多糖质量浓度显著高于铁皮石斛.因此，未来应加大对紫皮石斛和铁皮石斛的研究和开发力度，深入探讨其药用价值和药用机制，为其在实际应用中的疗效和功能提供科学依据.

参考文献

[1] 尚明越， 王嘉乐， 周莹， 濒危紫皮石斛叶绿体基因组结构及系统发育分析［J］. 中草药， 2023， 54（19）： 6424－6433.

[2] 李晓娇， 闵诗碧， 曹凯红， 龙陵紫皮石斛多糖的硒化修饰及其抗氧化活性［J］. 食品研究与开发， 2022， 43（20）： 117－123.

[3] 石雪， 唐明华， 黄雕顺. 不同产地铁皮石斛及其破壁粉质量指标的差异分析［J］. 宁德师范学院学报（自然科学版）， 2021， 33（4）： 400－406.

[4] 陈志琳， 赵颖， 李玮， 基于UPLC－MS技术分析铁皮石斛炮制前后糖类成分差异［J］. 中草药， 2023， 54（13）： 4321－4328.

[5] 饶毅， 王孟颖， 赵雯， 药用石斛鉴别方法研究进展［J］. 药品评价， 2023， 20（1）： 1－5.

[6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部 ［S］. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 445－446.

[7] 商丽丽， 高兰， 孙立丽， 正交法优选炮制工艺控制炒桂枝质量的探讨［J］. 质量安全与检验检测， 2021， 31（6）： 63－65.

[8] 曾稍俏. 木耳菜总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究［J］. 湖北民族大学学报（自然科学版）， 2023， 41（4）： 440－447.

[9] 郭明遗， 邓艳， 王天鑫， 超声辅助酶解提取水蜜桃果核多酚工艺优化及抗氧化性研究［J］. 食品与机械， 2023， 39（11）： 204－210.

[10] 王皓南， 范晶， 余坤子， 霍山石斛多糖的结构分析、生物活性研究进展及与不同种间多糖成分差异性分析［J］. 中草药， 2023， 54（15）： 5044－5056.

[11] 阮崇洁， 李勇， 黄裳. 石斛多糖通过抗氧化减轻关节炎小鼠的关节肿胀和炎症反应［J］. 中国医院药学杂志， 2023， 43（23）： 2648－2652.

[12] 尚小龙， 徐陈陈， 董健健， 霍山石斛多糖调控NLRP3炎症小体对帕金森病模型神经炎性损伤的抑制作用［J］. 中国实验方剂学杂志， 2023， 29（11）： 97－105.

[13] 刘川， 李环， 王大伟. 霍山石斛多糖对帕金森病模型小鼠脑组织氧化应激和炎症反应的影响［J］. 吉林大学学报（医学版）， 2023， 49（1）： 110－115.

[14] 欧小勇， 潘文章， 杨通莲， 玫瑰茄水提物抗氧化及抑菌活性研究［J］. 湖南农业科学， 2023（11）： 59－62.

[15] 辛炫英， 李美瑶， 张雨嫣， 明太鱼胶原蛋白提取工艺优化及其体外抗氧化活性［J］. 食品研究与开发， 2023， 44（21）： 114－122.

[16] 吴静， 顾震， 谢传奇， 油茶果壳多糖纯化工艺及其抗氧化活性研究［J］. 食品工业， 2023， 44（11）： 72－76.

[17] 杨丽华， 刘子璇， 徐香琴. 南沙参总黄酮的提取工艺及抗氧化活性研究［J］. 山东化工， 2023， 52（21）： 37－39.

[18] 杭书扬， 杨林霄， 郭建行， 山药皮中黄酮、多酚提取工艺优化及其抗氧化活性［J］. 食品研究与开发， 2023， 44（20）： 122－127.

基金资助

创新引导与科技型企业培育计划(202004BK091382)