响应面优化超声辅助水酶法提取燕窝中活性物质及抗氧化评价

Response surface optimization of ultrasound-assisted aqueous enzymatic extraction of active substances from Cubilose and antioxidant evaluation

摘要

应用超声辅助水酶法对燕窝中活性物质的提取工艺进行研究，并对提取物进行抗氧化活性评价及成分分析.以印度尼西亚粗加工后的燕窝为研究对象，通过粉碎处理制得燕窝试样，在单因素实验筛选的基础上，进行中心复合设计（CCD）实验，以ABTS自由基的清除率作为响应值进行响应面优化.实验结果表明，燕窝抗氧化物质的最佳提取工艺为碱性蛋白酶质量分数5.36%、酶解时间2.5 h、酶解温度55℃、料液比为1∶39.51 g/mL、超声时间25 min、超声功率180 W.实验预测最优清除率为89.708 4%.实验结果的清除率接近预期值，达到89.70%，二者几乎无差异.通过气相色谱-质谱法（GC-MS）、二级质谱法（LC-MS-MS）对加胃蛋白酶和碱性蛋白酶的燕窝总提物进行分析显示碱性蛋白酶的总提取物提取成分最多，抗氧化能力最强.研究表明，引入超声技术对水酶法提取燕窝中抗氧化物质具有促进作用，能够高效提取燕窝中抗氧化成分，且碱性蛋白酶的优异提取效果可为提高燕窝食用效果提供新思路，为燕窝的开发利用提供了理论基础.

关键词

燕窝 / 碱性蛋白酶 / 超声波 / 抗氧化 / GC-MS / LC-MS-MS

Key words

alkaline protease / ultrasonic / antioxidant / GC-MS / LC-MS-MS

燕窝是雨燕科（Apodidae）几种金丝燕分泌的唾液再混合其它物质粘结所筑成的巢穴^［1］，巢穴在繁殖季节建造，由鸟舌下唾液腺产生的粘性物质掺杂一些羽绒及柔软的植物纤维和海藻构成，形成了燕窝独特的结构和质地^［2－3］.从地理分布来看，燕窝主要产自东南亚国家及我国的一些沿海地区^［4］，因其蕴含丰富的营养成分和潜在的治疗作用，历来被视为中医滋补的珍品.据中医学资料^［5］表明，燕窝具有养颜滋润、补肺润肺及增强机体免疫力等功效.随着现代科学技术的进步，对燕窝的研究日益深入.研究^［6］发现，燕窝不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、碳水化合物及多种维生素，还富含多种具有生物活性的物质，如唾液酸、表皮生长因子等.这些成分在抗氧化、抗炎、抗菌、调节血压及促进骨骼健康等方面展现出广泛而显著的生物学活性.因此，深入研究燕窝营养成分的提取工艺，对于提高燕窝的利用率、开发高附加值产品以及推动燕窝产业的可持续发展具有重要意义.

董建辉等^［7］研究表明，燕窝水提物中有效成分具有抗氧化、抗衰老、修复损伤皮肤等功效.因此深入探索燕窝活性成分的抗氧化机制，这将对于慢病防治具有较为深远的意义.然而，目前对燕窝的研究多为成分分析和食用方法，如何提高燕窝食用效果及抗氧化作用方面研究较少.目前关于燕窝提取物的工艺研究，多采用传统炖煮法和酶解法^［8］.酶解法优于传统炖煮法，因为蛋白酶作为一种重要的酶类，通过催化蛋白质分子内部的化学键断裂反应，在生物体内发挥着至关重要的作用^［9］.目前对酶解法缺少酶种类、酶法机理的考察以及不同酶的总提物中成分及含量的研究.所以，本研究基于水酶法提取燕窝活性成分的工艺，结合超声法辅助和响应面法优化单因素实验，以抗氧化活性评价优化提取工艺，对酶种类、酶法机理进行分析，并结合气质、液质结果研究酶提取物中的成分及含量.本研究旨在通过科学的提取方法，有效保留燕窝中的活性成分，提高产品的品质和安全性，从而更好地满足市场对高品质燕窝产品的需求.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

燕窝购于深圳市皇巢贸易有限公司，产地为印度尼西亚；胃蛋白酶（≥ 1 200 U/mg）、木瓜蛋白酶（≥ 500 U/mg），郑州万搏化工产品有限公司；酸性蛋白酶（≥ 100 U/mg）、中性蛋白酶（≥ 60 U/mg）、碱性蛋白酶（≥ 200 U/mg），沧州夏盛酶生物技术有限公司；ABTS，萨恩化学技术（上海）有限公司；过硫酸钾，优耐德引发剂（上海）有限公司.

Waters ACQUITY UPLC^® H－Class 超高效液相色谱仪，Waters Xevo G2－XS Q－Tof 液质联用，Waters公司；安捷伦 7890B－5977B GC/MSD气质联用仪，联和层析贸易（上海）有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 燕窝试样的制备

以粗加工后的干燕窝为研究对象，用切碎机将干燕窝进行粉碎，过40目筛，之后装袋备用.

1.2.2 ABTS自由基清除能力的测定

2， 2－联氮－双（3－乙基苯并噻唑－6－磺酸）二胺盐，即ABTS自由基的配制∶称取30 mg ABTS试剂粉末于8 mL水中，超声溶解得到ABTS储备液；称取10 mg的K₂S₂O₈于15 mL水中，超声溶解得到K₂S₂O₈储备液.将2种储备液按质量比1∶1混合后避光氧化12～14 h后，在734 nm波长下，利用分光光度计将其吸光度调至0.700 ± 0.002范围内备用.

参照文献［10］的方法，取6个50 mL的烧杯，依次进行编号，然后分别称取0.3 g燕窝加入，再按1∶40 g/mL的料液比加入蒸馏水，在150 W条件下超声5 min，然后加入质量分数5%的碱性蛋白酶，保鲜膜封口，放入水浴锅中，在55 ℃下反应2 h.反应结束后，取出烧杯，摇匀，离心，取上层均匀液体.取6份5 mL ABTS自由基，并分别加入处理好的燕窝提取液0.1 mL，二者充分反应15 min后，利用紫外分光光度仪在734 nm下测量提取液吸光度A _x，空白组吸光度A ₀，并计算ABTS自由基的清除率，并使用公式（1）计算抗氧化物质对ABTS自由基的清除率.每组3个平行样.

\mathrm{清除} \mathrm{率} = \frac{A_{\mathrm{0}}-A_{\mathrm{x}}}{A_{\mathrm{0}}} \times \mathrm{100}%.（1）

其中，A ₀表示空白对照组吸光度；A _x表示样本组吸光度.

1.2.3 料液比对燕窝中抗氧化物质提取的影响

取6个50 mL的烧杯，依次编号，然后分别称取0.3 g燕窝加入，再按照不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60 g/mL）依次加入3、6、9、12、15和18 mL蒸馏水，在150 W功率下超声5 min，然后加入0.01 g碱性蛋白酶，保鲜膜封口，之后放入水浴锅中，在55 ℃下反应2 h.反应结束后，取出烧杯，摇匀，离心，取上层均匀液体.取6份5 mL ABTS自由基，并分别加入处理好的燕窝提取液0.1 mL，让二者充分反应15 min后，用紫外分光光度仪在734 nm下测量其吸光度，并计算ABTS自由基的清除率.进行3次平行试验.

1.2.4 其他单因素试验

以抗氧化活性物质对ABTS自由基的清除率为评价标准，使用最优的料液比，分别对酶种类（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶）、酶质量分数（所加燕窝的1%、2%、3%、4%、5%和6%）、超声时间（5、10、15、20、25和30 min）、超声功率（60、90、120、150、180和210 W）、酶解时间（0.5、1、1.5、2、2.5和3 h）和酶解温度（25、35、45、55、65和75 ℃）进行筛选实验.

1.2.5 GC－MS、LC－MS－MS测定不同酶总提物的成分及质量分数

按照1.2.3操作，分别进行不加酶提取、加胃蛋白酶提取、加碱性蛋白酶提取，之后分别将上清液进行GC－MS、LC－MS－MS测试不同酶总提物的成分及质量分数.

1） GC－MS条件

色谱条件DB－5MS（30 mm × 250 mm，0.25 μm），高纯氦气，进样口温度250 ℃，不分流进样，溶剂延迟1 min；程序升温50 ℃保持2 min，以7 ℃/min升到120 ℃，以10 ℃/min升到250 ℃，保持5 min；载气流速为1.0 mL/min；进样量为1 μL.

质谱条件电子轰击离子源（EI）；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；离子源电子能量为70 eV；相对分子质量扫描范围为35～500 m/z.

2） LC－MS－MS条件

超高效液相Waters ACQUITY UPLC H－Class超高效液相色谱仪；PDA检测器；色谱柱ACQUITYUPLC BEH C₁₈ （2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）；以体积分数0.1%的甲酸为流动相A，以甲醇为流动相B；梯度洗脱，0～2 min，5%～30% B；2～7 min，30%～34% B；7～15 min，34%～80% B；流速0.3 mL/min，检测波长为258 nm，柱温30 ℃，进样量1 μL.质谱仪器和型号Waters Xevo G2－XS Q－Tof 液质联用；离子源Esi；离子模式为负离子；毛细管电压3.0 kV；提取锥孔电压20 kV；样品锥孔电压40 kV；离子源温度120 ℃；脱溶剂温度450 ℃；脱溶剂流速600 L/h；锥孔气流速50 L/h；扫描时间18 min；离子检测质荷比100～1 000 Da；采用LE溶液进行在线质量校正.

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同料液比的影响

料液比是指固态的“料”的质量与作为浸提液的“液”的体积的比，它是影响提取效率和提取物质相对含量的重要因素之一^［11］.不同的料液比可以导致提取效果的差异，影响提取物所得质量分数.在图1中，由于料液比的增大，ABTS自由基的清除率呈上升趋势，在料液比1∶40 g/mL时达到最高.这可能是由于随着料液比的增加，可以增加原料与提取液的接触面积，使被提取物更充分地溶解出来.当料液比继续增大，ABTS自由基的清除率逐渐降低，这可能因为当料液比增加到一定程度时，燕窝中抗氧化物质的溶出已经达到趋于饱和，此时杂质分散相应增加.所以本实验选取1∶40 g/mL为最优料液比.

2.1.2 不同种酶的影响

酶的结构具有特异性，酶的活性基团与特定底物相结合，从而催化底物转化.采用5种酶制剂提取燕窝中抗氧化物质，发现碱性蛋白酶的效果明显优于其他酶，这表明ABTS自由基的清除率较高（图2）.因此，选择碱性蛋白酶作为后续实验的酶制剂，与李敬等^［12］提取燕窝中唾液酸的研究结论一致.

2.1.3 不同酶质量分数的影响

酶的催化作用并非酶越多越好，过多的酶可能导致酶分子相互附着，降低酶与底物的传质效率，反而降低反应效率.由图3可以看出，随着酶的质量分数增多，ABTS自由基的清除率呈现上升趋势，当酶的质量分数达到5%时，ABTS自由基清除率达到最大.这表明适量的酶增加能够提高酶与底物的结合作用频率，但当酶过多时，酶与底物的结合点接近饱和，多余的酶无法充分结合底物，导致酶的作用受到抑制^［13］.因此，选择酶的质量分数为5%.

2.1.4 不同超声时间的影响

超声波提取的时间也是影响提取效率的重要因素^［14］.通常，随着提取时间的延长，细胞内的有效成分逐渐被释放并溶入溶剂中，但过长的提取时间可能导致细胞内成分的损失和降解，因此需要在保证提取效率的前提下选择合适的提取时间.由图4中可以看出，当超声时间为25 min的时候，燕窝提取物对ABTS自由基的清除率达到了最高值.随着时间的延长，清除率有轻微的下降趋势. 这是因为超声波首先作用于燕窝表面，逐步向内部扩展^［15］，当超声波的作用完全传递至燕窝颗粒内部时，继续延长时间已经不会对燕窝颗粒产生额外影响.因此，超声时间超过25 min后，即使继续延长，也无法提高清除率^［16］.

2.1.5 不同超声功率的影响

超声技术在提取过程中对物质成分的释放和提取具有重要作用^{［17－18］}.本实验引入超声技术提取燕窝中抗氧化物质，并对实验参数进行了优化.由图5可知，随着超声功率的不断增大，清除率也随之上升.在超声功率到达180 W时，对燕窝结构破碎程度已经达到最大，即提取物对ABTS自由基的清除率达到最大值.随后，清除率出现减缓的趋势，这可能是因为随着时间的延长，燕窝结构已无其他破碎空间，且燕窝中抗氧化活性物质结构会遭到破坏.故本实验超声功率选180 W.

2.1.6 不同酶解时间的影响

酶解时间也是影响酶解效果的关键因素.由图6可知，在1～2.5 h的酶解时间范围内，因为酶解初始阶段，燕窝结构破坏的程度较低，目标成分溶出少.随着酶解时间的增长，使燕窝结构破裂程度增大，有利于底物与碱性蛋白酶的接触^［11］，促进燕窝中的抗氧化物质溶出，从而提高清除率.当酶解时间达到2.5 h时，燕窝中抗氧化物质的溶出达到平衡，之后，清除率呈下降趋势.这可能因为底物已被酶解得较为充分，碱性蛋白酶的酶活力逐渐下降，而溶出的杂质增多，导致清除率下降^［19］.因此，选择2.5 h作为最佳酶解时间.

2.1.7 不同酶解温度的影响

在蛋白质酶解反应中，温度也是影响酶解效果的重要因素.温度会影响蛋白酶催化反应速率及其稳定性.对于不同类型的酶，其适合的酶解温度不同.对于碱性蛋白酶，通常在40～55 ℃的温度范围内，酶活性较高，酶解效果较好.从图7中分析得出，随着酶解温度的升高，燕窝中抗氧化物质对ABTS自由基的清除率不断增大.但当酶解温度超过55 ℃时，清除率开始下降，这主要是由于温度过高导致碱性蛋白酶活性降低，从而影响了酶解过程.此外，酶解温度不仅影响酶的活性，还会影响抗氧化成分的生物活性^［20］.因此，55 ℃为最适宜酶解温度.

2.2 响应面法优化

2.2.1 中心复合设计实验设计及其实验结果

本实验采用响应面分析方法，通过分析影响因素和其响应值的关系，以此为基础选出最优的工艺参数^［21］.在探究燕窝提取物对ABTS自由基的清除过程中，通过单因素实验发现料液比、酶的质量分数、超声功率3个因素对燕窝中抗氧化物质的提取影响较大，因此选择料液比、酶的质量分数、超声功率这3个因素作为响应面分析的影响因素.从而，采用中心复合设计（CCD）法^［22］对清除体系中料液比、酶质量分数和超声功率对ABTS自由基清除率进行探究.根据CCD设计原理，对这3个因素各设置了3个水平.

根据CCD的试验设计，以料液比为自变量A、酶的质量分数为自变量B和超声功率为自变量C，燕窝抗氧化物质对ABTS自由基清除率响应值为R，实验方案和该方案取得的实验结果，见表1.

2.2.2 回归和方差分析

以燕窝抗氧化物质对ABTS自由基的清除率作为响应值，在分析软件中对3个因素进行了回归拟合，响应值R与各个影响因子之间的回归方程为R _清除率 = 89.29 - 0.37A+ 2.20B+ 0.46C - 0.080AB+ 1.04AC - 0.63BC - 3.73 A² - 3.03B² - 2.97C².上述相关系数R ²为0.984 6.回归模型的方差分析结果见表2.

本试验建立出的模型P < 0.000 1，表明该模型具有极显著性，意味着该模型可以用作燕窝抗氧化物质提取响应面的分析.此外，除A、C、AB项和BC项外，其他因素的P值均小于0.05，呈现出显著性，这表明料液比、加酶量以及超声功率是影响ABTS自由基清除率的主要因素.其中，B项的P值小于0.001，表明加酶量对ABTS自由基清除率的影响极为显著；而料液比和超声功率的显著性则相对较弱.AC项的P值小于 0.05，这表明料液比、超声功率对ABTS自由基清除率的影响在特定条件下表现出交互作用，而其他因素之间并未表现出此类交互效应.

2.2.3 提取燕窝抗氧化物质的响应面分析

料液比、酶的质量分数和超声功率3个因素对ABTS自由基清除的3D响应面如图8（a）所示.可以看出，在A因素方向的响应面曲线的走势为平缓，由此得出ABTS自由基清除率受料液比的作用不明显.与A因素相比，B因素有较大的变化，响应面曲线表现为较陡，对于实验结果而言，即燕窝抗氧化物质的提取受酶的质量分数影响更大.图8（b）表明了A因素（料液比）和C因素（超声功率）两因素对实验结果的影响.通过3D图不难看出，在A项因素方面则表现为平缓，在C项因素这侧曲线有明显斜度，说明了ABTS自由基清除率受超声功率的影响更大.因此可知，C因素的变动对实验结果的作用高于A因素，换言之，清除率相对于料液比来说，对超声功率更为敏感.从图8（c）响应面曲线的倾斜程度可以看出，B因素的影响远远高于C因素，即酶的质量分数对燕窝中抗氧化物质的提取更为显著.响应面法清晰地表明了各因素的影响程度，优化了单因素实验.根据其优化结果表明，选中的3因素于清除率的作用大小为酶的质量分数>超声功率>料液比.

此外，利用响应面优化后，确定提取工艺为料液比1∶39.51 g/mL，酶的质量分数为5.36%，超声功率为180.89 W，实验预测的最优清除率为89.708 4%.根据最优预测条件，进行实验操作验证.实验结果ABTS自由基清除率达到89.70%，与预期值相接近，仅相差为0.008 4％，表明该提取工艺具有可行性^［23］.通过引入超声波技术和对工艺参数的优化，燕窝抗氧化物质对ABTS自由基的清除率有了明显的提高，此结果与超声波辅助法提取核桃青皮总黄酮工艺呈现出来的结论相近^［24］.

2.3 不同工艺提取结果对比

综上可知，水浸提法提取燕窝中蛋白质和多糖，提取操作简单，但提取率较低；相较于水提法，酶法提取燕窝中唾液酸的提取率有所提高，提取过程绿色，但燕窝结构并未破坏完全，仍有较多物质残留，造成浪费.而超声波辅助水酶法提取燕窝中唾液酸，提取率达到84.76%，提取效率较高，但未研究其提取物功效.而本研究采用的超声波辅助水酶法提取燕窝中抗氧化物质，在水酶法优化条件下引入超声波技术，提取效率较好^［28］，且产品质量优良，并对提取物进行抗氧化活性评价，结果表明对ABTS自由基清除率可达到89.70%（表3），能为进一步开发燕窝潜在价值提供较好的理论基础.

2.4 条件优化后的燕窝提取物与阳性对照比较

以L型－抗坏血酸（L－ascorbic acid， VC）水溶液作为对照，浓度为横坐标，VC水溶液对ABTS自由基溶液清除率为纵坐标，得到VC水溶液作参照物的标准曲线，并建立方程.碱性蛋白酶提取燕窝总提物得到上清液，取0.1 mL上清液与5 mL ABTS自由基反应.通过计算得到清除率89.7%，将此清除率带入VC水溶液的标准方程y = 0.438 6x + 0.035 6，计算得到x = 1.964 0 mg/mL，即0.1 mL燕窝上清液对ABTS自由基的抗氧化性相当于1.964 0 mg的VC.

同样的方法和计算得到，未加酶提取燕窝总提物得到上清液的清除率为4%，胃蛋白酶提取燕窝总提物得到上清液的清除率为5%；即0.1 mL未加酶燕窝上清液对ABTS自由基的抗氧化性相当于0.010 0 mg的VC，0.1 mL加胃蛋白酶燕窝上清液对ABTS自由基的抗氧化性相当于0.032 8 mg的VC.

综上比较，碱性蛋白酶提取燕窝总提物的抗氧化能力最强，其0.1 mL燕窝上清液对ABTS自由基的抗氧化性相当于1.964 0 mg的VC.

2.5 3种处理方式的燕窝总提物SEM分析

不同方法处理燕窝的扫描电镜图如图9所示，未加酶（a）、胃蛋白酶（b）和碱性蛋白酶（c）处理后的燕窝样品的表面微观结构没有太明显的区别，均呈现一些细小的块状，这可能是因为蛋白酶主要是分解燕窝中的蛋白质，导致其蛋白结构遭到破坏，而对表观结构没有明显的影响.

2.6 3种处理方式的燕窝总提物的GC－MS分析

按照1.2.3进行燕窝样品的处理，分别测定未加酶、加胃蛋白酶、加碱性蛋白酶的燕窝提取液的挥发性成分（图10）.对色谱峰逐一以NIST11质谱数据库进行检索分析，并以峰面积归一法确定组分中挥发性成分的相对含量（表4）.结果显示，燕窝气味构成复杂，碱性蛋白酶提取效果最好.其成分中包含脂肪酸、维生素和多功能酚类化合物等抗氧化物质.

2.7 3种处理方式的燕窝总提物的LC－MS－MS分析

按照1.2.3进行燕窝样品的处理，分别进行未加酶、加胃蛋白酶、加碱性蛋白酶的燕窝提取液的LC－MS－MS测定（图11）.对色谱峰进行检索分析，得出3种样品的提取成分（表5～7）.结果显示，碱性蛋白酶提取效果最好，其总提物成分多达28种.根据李敬等^［27］的报道，不同种类酶对燕窝的水解pH依赖性比较强.胃蛋白酶主要酸性条件下发挥作用，尤其是在pH为2～3时，其水解燕窝产生的蛋白和唾液酸得率都最高.而本研究采用传统燕窝加工工艺，使用水泡发燕窝，不但便于水溶性成分的溶解，而且其pH也有利于碱性蛋白酶作用的发挥.胃蛋白酶则有可能在水溶性成分外层形成了包裹，降低了溶解度.所以胃蛋白酶提取物反而比未加酶提取物还少.通过LC－MS－MS成分分析，发现成分中包含氨基酸、脂肪酸、黄酮类物质和多功能酚类化合物等抗氧化成分.

3 结语

利用超声辅助水酶法提取燕窝中抗氧化物质，对单因素进行筛选后结合响应面优化实验参数，结果得出最优工艺参数是碱性蛋白酶质量分数为5.36%，料液比为1∶39.51 g/mL，酶解温度55 ℃，酶解时间2.5 h，超声时间25 min，超声功率180 W. ABTS自由基清除率高达89.70％，与响应面预测值89.708 4%相符.之后通过GC－MS、 LC－MS－MS对未加酶、加胃蛋白酶、加碱性蛋白酶的燕窝总提物进行分析，结果表明碱性蛋白酶的总提取物成分最多.多种方法综合分析可知水酶法燕窝提取物成分中包含氨基酸、维生素、脂肪酸、黄酮类物质和多功能酚类化合物等抗氧化物质.研究表明引入超声技术对水酶法提取燕窝中抗氧化物质具有促进作用，而且碱性蛋白酶酶解效果优异.该研究可以为综合利用燕窝资源提供参考依据.

参考文献

[1] MURUGAN D D， ZAIN Z MD， CHOY K W， et al. Edible bird's nest protects against hyperglycemia－induced oxidative stress and endothelial dysfunction［J］. Frontiers in Pharmacology， 2019， 10∶ 1624－1626.

[2] WU YJ， CHEN Y， WANG B， et al. Application of SYBRgreen PCR and 2DGE methods to authenticate edible bird's nest food［J］. Food Research International， 2010， 43（8）∶ 2020－2026.

[3] 连建梅， 范群艳， 李红卫. 不同加工工艺对燕窝产品唾液酸含量的影响［J］. 食品工业科技， 2017， 38（1）∶ 265－277.

[4] 梅秀明， 吴肖肖， 乔玲， 燕窝的营养成分和危害因子分析［J］. 现代食品科技， 2020， 36（2）∶ 277－282.

[5] 于海花 徐敦明， 周昱， 燕窝的研究现状［J］. 食品安全质量检测学报， 2015， 6（1）∶ 198－206.

[6] 李翠， 徐小涵， 林小仙， 燕窝营养成分与功效研究现状［J］. 食品与发酵工业， 2023∶ 1－9.

[7] 董建辉， 田巧基， 段素芳， 燕窝提取物的抗氧化及促进表皮细胞生长活性比较［J］. 食品与发酵工业， 2019， 45（17）∶ 73－78.

[8] 苑子涵， 崔佳燕， 郑丹婷， 超声波与酶解法协同提取天然产物中多糖类化合物的研究［J］. 机电信息， 2016， 8∶ 38－44.

[9] SILVA D C S DA， RODRIGUES A M C， SILVA L DA， et al. Enzyme extraction of cupuassu （Theobroma grandiflorum S.） fat sedes［J］. Grasas y Aceites， 2023， 74（2）∶ 498.

[10] 黄瑶， 李红锐， 李育晓， 6 种鳞毛蕨属植物醇提物的抗氧化、降血糖及抗炎活性［J］. 云南民族大学学报（自然科学版）， 2022， 31（2）∶ 152－156.

[11] 郑丽娟， 李致瑜， 简叶叶， 响应曲面法优化燕窝糖蛋白提取工艺研究［J］. 食品工业科技， 2017， 38（8）∶ 267－271.

[12] 胡玥明， 孙桂菊， 姚宏亮. 响应面法优化鸡小肠黏膜唾液酸提取工艺［J］. 福建农业学报， 2020， 35（6）∶ 665－672.

[13] 卢朝婷， 刘江， 王晓君， 响应面法优化双孢菇鲜味物质提取工艺的研究［J］. 食品研究与开发， 2019， 40（6）∶ 88－94.

[14] LI G， LIU S， ZHOU Q， et al. Effect methodology－optimized ultrasound－assisted pretreatment extraction on the composition of essential oil released from tribute citrus peels［J］. Frontiersin Nutrition， 2022， 9∶ 840780.

[15] 刘骅漫. 基于Nrf2/ARE信号通路探讨海藻多糖对人胚肺成纤维细胞抗氧化作用的机制研究［D］， 济南： 山东中医药大学， 2018.

[16] 刘文媛， 贾伟， 李侠， 超声辅助水热法提取牛骨油工艺参数优化［J］. 农业工程学报， 2018， 34（8）∶ 283－290.

[17] 李思敏， 张言， 高定烽， 响应面优化白花酸藤果浸泡酒抗氧化活性及成分分析［J］. 中国调味品， 2019， 44（8）∶ 7－12.

[18] 岳秀洁， 李超， 扶雄. 超声提取辣木叶黄酮优化及其抗氧化活性［J］. 食品工业科技， 2016， 37（1）∶ 226－231.

[19] 郑心怡， 李致瑜， 曾红亮， 响应面法优化燕窝不溶性蛋白酶解工艺的研究［J］. 中国农学通报， 2019， 35（6）∶ 151－157.

[20] 何秋实. 超声辅助复合酶法制备核桃抗氧化肽工艺研究［J］. 粮食与油脂， 2018， 31（5）∶ 97－100.

[21] 慕运动. 响应面方法及其在食品工业中的应用［J］. 郑州工程学院学报， 2001， 3（2）∶ 91－94.

[22] 张言， 高定烽， 李思敏， 响应面优化红香木树皮浸泡酒抗氧化活性以及成分分析［J］. 食品研究与开发， 2020， 41（1）∶ 72－78.

[23] 阮金华， 覃业茗， 黄祥林， 响应面法优化制备巨菌草基高比表面积活性炭［J］. 云南民族大学学报（自然科学版）， 2024， 33（1）∶ 71－78.

[24] 吕名蕊， 张旋， 樊璐， 超声波辅助法提取核桃青皮总黄酮工艺及抗氧化活性研究［J］. 粮食与食品工业， 2021， 28（3）∶ 34－39.

[25] 陈玲， 陈昕露， 范群艳， 燕窝主要营养成分及其唾液酸酶法提取工艺［J］. 福建农林大学学报（自然科学版）， 2015， 44（5）∶ 542－547.

[26] 简叶叶， 李庆旺， 庄培荣. 酶法提取燕碎中唾液酸工艺优化及其浓缩液制备［J］. 现代食品， 2020， 6∶ 92－94.

[27] 李敬， 钟文俊， 王晓云， 响应面法优化燕窝唾液酸的提取工艺［J］. 中药材， 2017， 40（7）∶ 1670－1674.

[28] LU W， ZHANG Y， XIAO C， et al. The comprehensive utilization of bean dregs in high－fiber tofu［J］. Foods， 2022， 11（10）∶ 1475.

基金资助

国家自然科学基金(52163013)

云南省“千人计划”培训项目(YNQR-CYRC-2018-012)