维生素C和甘草酸联合防治新型冠状病毒感染的作用机制研究

Study on the mechanism of vitamin C and glycyrrhizin acid in co-treatment of COVID-19

摘要

基于网络药理学技术，探索维生素C(VC)和甘草酸（GA）联合防治新型冠状病毒感染（COVID-19）的作用机制.通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、SuperPred、SEA Search Server(SEA)、DrugBank、Comparative Toxicogenomics Database(CTD)和SwissTargetPrediction数据库综合相关文献获得VC和GA功能靶标，以及Genecards等数据库获取COVID-19治疗靶点；构建“药物-疾病-靶点”网络，并进行基因本体论（GO）富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析和蛋白互作网络分析（PPI）；运用Autodock Vina软件进行分子对接.筛选出VC功能靶标667个、GA功能靶标154个、COVID-19靶点1 586个，VC与GA共有45个靶标与COVID-19致病靶点相关.关键靶点包括ALB、MAPK3、EGFR、IL2、MAPK1和CTLA4等. GO分析显示靶点富集于肽基丝氨酸磷酸化、蛋白结合等生物过程，KEGG分析提示靶点主要作用于5-羟色胺能突触通路.分子对接表明，VC和GA与SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2等靶点具有较强结合能力.研究表明，VC和GA可能通过调节免疫系统的激活，在COVID-19预防和治疗中发挥协同作用.

关键词

新型冠状病毒感染 / 维生素C / 甘草酸 / 网络药理学 / 作用机制

Key words

COVID-19 / vitamin C / glycyrrhizin / network pharmacology / mechanism of action

新型冠状病毒感染（COVID－19）是由SARS－CoV－2病毒引起的一种急性呼吸道传染疾病，其传播方式包括直接或间接的接触、母婴传播等，具有高传染性、高隐蔽性的特点.截止2022年6月，全世界已有近5.4亿人感染COVID－19，夺走了634余万人的生命.虽全球新冠疫苗接种已超118亿剂次，康复人数超过新增病例数，疫情有所好转，但新冠病毒的不断变异仍然严重威胁着全球人民的生命安全，开发寻找有效预防和治疗COVID－19药物迫在眉睫、意义重大^［1］.

目前，对于COVID－19的治疗策略，主要包括老药新用、广谱抗病毒药物以及新型靶向药物等^［2］.研究^［3］表明，维生素C（VC）具有抗衰、抗病毒、抗免疫损害的功能，可通过增强B和T细胞的分化和增殖来调节免疫，从而达到防治呼吸道和全身感染效果^［4－7］.据报道，在新冠疫情爆发以来，已经有很多通过大剂量静脉注射VC而出现病情好转的病例^［8］，但大剂量服用VC存在出现血液色谱症、G－6－PD缺乏、肾功能障碍、肾结石或草酸尿等不良反应的风险^［9］.甘草酸（GA）是中药甘草质量评价的指标性成分，具有显著的解毒、抗炎、抗肿瘤和抗病毒作用^{［10－11］}，可与血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，预防SARS－CoV－2感染，也是治疗炎症的主要药物之一^{［12－13］}.在国家卫生健康委员会和国家中医药管理局联合发布《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版））》^［14］中甘草出现4次，是出现频率最高的药物之一，充分表明了甘草在临床上治疗COVID－19的重要性.

网络药理学可综合系统生物学、蛋白组学等理论基础，对药物成分和相关靶点进行整体、系统地分析，有利于揭示药物潜在活性成分和作用靶点的预测，从而为药物的研发提供科学指导.本研究拟通过网络药理学技术，结合生物功能富集分析和分子对接技术，初步阐述VC和GA合用防治COVID－19的作用机制，以期为后期实验研究和新药开发提供依据.

1 材料与方法

1.1 VC和GA的功能靶标及疾病靶点分析

通过Genecards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/home/）和TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库，以“Coronavirus COVID－19”为关键词，获得COVID－19的疾病靶点.通过TCMSP（https://tcmsp－e.com/）、SuperPred（https://prediction.charite.de/）、SEA（https://sea.bkslab.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/drugs）、CTD（https://ctdbase.org/）、SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）和Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库筛选并校正数据分析，最终得出VC和GA的作用靶点.

1.2 药物－疾病－靶点网络分析

将通过筛选分析得到的VC和GA联合对抗COVID－19的共有靶点，经过Cytoscape 3.8.2软件进行处理.将药物、疾病、有效靶点进行分类，按照格式制作网药表以及类型表.网药表的第一列表头为“From”，内容为VC、GA、COVID－19；第二列表头为“To”，内容为VC的靶点、GA的靶点以及COVID－19的靶点.类型表的第一列表头为“Symble”，内容为共有靶点以及药物、疾病，第二列表头为“type”，将靶点、药物、疾病以不同的字母作为代号分类.打开Cytoscape 3.8.2软件，依次将网药表、类型表导入，在“Select”中选定要调整的对象，然后在“Style”中进行美化调整，构建药物－疾病－靶点之间的网络关系图.

1.3 蛋白－蛋白相互作用（PPI）网络构建

以VC和GA联合对抗COVID－19的共有靶点为研究对象，构建PPI网络.打开“STRING”数据库（https://string－db.org/），选择“Multiple proteins”，在“list of names”中输入得到的共有靶点，而后在“Organism”中将物种限定为“Homo sapiens”，之后点击“SEARCH”，检索靶点相关蛋白质，检查无误后点击“CONTINUE”，得到VC和GA联合对抗COVID－19的PPI网络图.将其数据导入“Cytoscape”软件进行拓扑分析，得到各个靶点的Degree和Betweenness值.

1.4 生物功能与通路富集分析

采用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）在线数据库中进行基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析.进入DAVID 6.8版本后，点击左侧第一列的“Functional Annotation”，进入后选择左侧选项的“Upload”，在“Step 1： Enter Gene List”中输入之前筛选出的共有靶点基因名称，其次在“Step 2： Select Identifier”选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”，以及在“Step 2a： Select species”中搜索填入“homo sapiens”，而后在“Step 3： List Type”里勾选“Gene List”，最后一步点击“Submit List”；这样相关数据就被检索出，而后在左侧“List”中将其限定为“Homo sapiens”，然后在列表里点击“Gene_Ontology”，最后依次点击“GOTERM_BP_DIRECT”、“GOTERM_CC_DIRECT”、“GOTERM_MF_DIRECT”3处标红数据后面的“Chart”，对数据进行下载.其次点击“Pathways”，选择“KEGG_PATHWAY”，下载绘制KEGG通路分析相关数据.

利用“微生信”平台（www.bioinformatics.com.cn）对共有靶点进行GO富集分析时，在BP（Biological process）、CC（Cellular component）、MF（Molecular function）数据中，取前10个通路的相关数据进行处理，将数据整理为“微生信”所需的格式：第一列是GO term，第二列是分类（此列的文字及顺序必须为Biological process，Cellular component，Molecular function），第三列是P值.在“微生信”平台选择“GO富集BP、CC、MF三合一柱状图”，将整理好的数据导入，然后在“数据转换方法”中选定“－log10转化（针对P值，P = 0时设置为10）”，再在字体大小内将“GO term”调整为6，在bar上标两位小数数值，其他数据遵照自动格式，点击“提交”得出GO富集分析图.

选取先前所得KEGG数据中的前十个通路，处理为格式正确格式，为每一列添加加表头：第一列为“Term”，第二列是为“gene ratio”，第三列是P值（P Value），第四列是“Count”.数据经处理后，打开“微生信”平台，选择“富集气泡图”，将数据导入“绘图数据”一栏，在“条目排序”中选择第三列从小到大，提交后得到KEGG通路图.

1.5 分子对接

利用PDB数据库（www.rcsb.org）下载SARS－CoV－2 3CL水解酶（PDB ID： 6LU7）、ACE2（PDB ID： 1R42）和核心靶点的3D结构PDB格式，运用Pymol软件对靶点蛋白进行去水、去配体等操作；在ZINC数据库中下载VC和GA的3D结构sdf格式，并利用Open Babel GUI软件转化为mol2格式；最后运行Vina进行分子对接并将结果可视化.

2 结果与分析

2.1 VC和GA功能靶标与疾病靶点筛选结果

通过数据库鉴定得出1 586个COVID－19相关基因，根据Uniprot校正数据分析之后得出，VC有667个药理作用靶点，GA有154个药理作用靶点.维恩图（图1）显示VC与COVID－19有34个交叉点，GA与COVID－19有28个交叉点.其中，有17个交叉点同时是VC和GA的靶点，即VC和GA有17个相同的功能靶标对抗COVID－19.而在研究VC和GA联合治疗COVID－19疾病时，对COVID－19起到治疗作用的所有靶点均为研究对象.此外，图1还显示，VC和GA各还有17和11个靶点对COVID－19起作用.结果得到共计45个VC和GA联合防治COVID－19的靶点（表1为靶点明细，黄色标注为共有靶点）.

2.2 药物－疾病－靶点网络分析

图2中共有45个节点，107条边，这侧面表现了药物多成分、多靶点的特点.绿色标注为COVID－19疾病，紫色标注为VC、GA药物，蓝、粉、黄色标注为靶点，其中蓝色标注靶点为VC、GA对抗COVID－19的17个共同作用靶点，粉色标注靶点为VC对抗COVID－19的另外17个作用靶点，黄色作用靶点为GA对抗COVID－19的另外11个作用靶点.通过图2可以明显地看到，在VC和GA联合对抗COVID－19时，经筛析得出的45个靶点均对COVID－19疾病产生作用.

2.3 PPI网络分析及关键靶点筛选

借助“STRING”平台，将得到的VC和GA联合对抗COVID－19的45个有效靶点导入，构建作用靶点之间的PPI网络，如图3显示.图3中不同颜色的边代表不同类型，边的粗细代表关联分值大小，节点即为靶点^［16］，PPI图中显示有262条边，45个靶点，靶点的平均degree值为11.6，其中Degree值大于平均值的靶点共计19个，根据表2可以看出，Degree值由大到小排序，前5位的有ALB（Degree值为32）、MAPK3（Degree值为27）、MAPK1（Degree值为26）、IL2（Degree值为26）、EGFR（Degree值为25）.BetweennessCentrality值越大的靶点在药物作用过程中越关键，分析表2得出BetweennessCentrality值前5位的靶点分别为ALB、CTLA4、IL2、MAPK3、EGFR.综合Degree值与BetweennessCentrality值前5位的靶点，ALB、MAPK3、EGFR、IL2、MAPK1、CTLA4为主要关键靶点.

2.4 VC和GA作用的GO生物过程和KEGG途径

通过DAVID平台得到生物过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3部分的数据，对VC和GA联合抗COVID－19的BP、CC、MF 3个水平的前10个条目进行GO富集分析，得到图4.生物过程方面，这些靶点主要涉及到肽基丝氨酸磷酸化（peptidyl－serine phosphorylation）、药物反应（response to drug）、细胞凋亡（apoptotic process）、磷脂酰肌醇3激酶信号的调节（regulation of phosphatidylinositol 3－kinase signaling）、缺乏配体的外源性凋亡信号通路（extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand）、B细胞受体信号通路（B cell receptor signaling pathway）、血小板活化（platelet activation）、血压调节（regulation of blood pressure）、细胞对机械刺激的反应（cellular response to mechanical stimulus）等过程.细胞组成方面，VC和GA抗COVID－19靶点涉及细胞表面（cell surface）、胞外外泌体（extracellular exosome）、质膜（plasma membrane）、高尔基体（Golgi apparatus）、薄膜筏（membrane raft）等组分.分子功能方面，涉及蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、蛋白质结合（protein binding）、相同的蛋白质结合（identical protein binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）等功能.

在DAVID平台获得VC和GA联合防治COVID－19靶点的KEGG－Pathways数据，共104条通路，取前10个主要通路进行数据处理后，得出KEGG通路分析气泡图（如图5）.结果显示，在主要的前10个条目中，VC和GA联合对抗COVID－19的通路主要涉及在5－羟色胺能突触（Serotonergic synapse）、T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）、自然杀伤细胞介导的细胞毒性（Natural killer cell mediated cytotoxicity）、非小细胞肺癌（Non－small cell lung cancer）等信号通路.

2.5 分子对接

通过Autodock Vina将处理后的VC和GA分别与核心靶点ALB（PDB ID： 5HQZ）、MAPK3（PDB ID： 2ZOQ）、IL2（PDB ID： 1QVN）、MAPK1（PDB ID： 6G54）、EGFR（PDB ID： 5GTY）、CTLA4（PDB ID： ZX44）进行分子对接.同时3CL水解酶和ACE2作为抗COVID－19的潜在作用靶点已被广泛报道，因此将这2个受体蛋白与VC和GA进行分子对接，结果见表3和图6.通常认为，配体与受体结合能越小，发生作用的可能性越大.结合能 ≤ 0 kJ/mol时，认为化合物与蛋白二者之间可自发进行结合且产生相互作用；结合能 ≤ - 5.0 kJ/mol时，具有良好的亲和力^［17］.对接结果显示，VC和GA与SARS－CoV－2 3CL水解酶、ACE2和核心靶点具有良好的结合能，均可自发进行结合，并且它们之间有较好的亲和力.SARS－CoV－2 3CL水解酶在介导病毒复制和转录功能中发挥关键作用.ACE2是SARS－CoV－2的受体，新冠病毒经ACE2介导的内吞作用侵入宿主细胞而致病.VC与GA联用可能通过调节人体免疫系统、影响SARS－CoV－2病毒复制和阻止该病毒进入人体内，从而实现对COVID－19的治疗.

3 讨论与结语

当前，新冠肺炎疫情仍在全球范围内肆虐，各国纷纷研发疫苗以期控制疫情。据世界卫生组织（WHO）统计，全球已有超过160种疫苗正在研发^[17]。在我国应对COVID-19疫情的过程中，中西医结合的治疗策略已被证实具有显著疗效，其中，中医药的特色更是我国治疗策略的重要亮点，在抗疫战役中发挥了举足轻重的作用。查阅相关资料发现，大量注射VC改善病情的案例表明，VC在COVID-19治疗中具有一定的潜在疗效。同时，GA也被发现对炎症具有潜在疗效。虽然VC和GA单独对病毒性肺炎均表现出一定药理作用^[18-19]，但它们联合对抗COVID-19的机制尚未得到全面研究。研究^[20]表明，探讨VC和GA联合对抗COVID-19的机制，应重点关注二者对COVID-19靶点的并集，而非仅研究它们分别作用的靶点交集。本研究采用了网络药理学和生物信息学（包括GO和KEGG）手段，以揭示VC和GA联合对抗COVID－19的药理学机制.

因VC和GA各自的功能有所异同，故在对二者联用的所可能的疗效进行探究时，应将二者看作一个整体进行考虑，故最终筛选得出了VC和GA联合对抗COVID－19时参与产生作用的45个靶点.VC和GA有17个相同的功能靶标对抗COVID－19.然而通过PPI网络分析可以看到，除17个共同靶点外，VC和GA各另有17、11个功能靶点，这表示在VC和GA联合治疗COVID－19过程中，起作用的靶点有45个，VC和GA除了共同功能以外，还通过不同的信号通路各自发挥的不同的作用，在防治COVID－19疾病时，这些靶点的作用叠加，VC和GA会表现为协同作用.因此，VC联合GA治疗COVID－19会起到更加显著的治疗作用.

根据药物－疾病－靶点网络以及PPI网络分析结果，在VC和GA联合防治COVID－19过程中，ALB、MAPK3、EGFR、IL2等为关键作用靶点.研究^［21］发现在乳腺癌中，MAPK通路的抑制对T细胞活性产生负面影响，这表明MAPK活性是免疫系统中T细胞功能所必需的.VEGF信号通路是刺激血管形成的主要通路^［22］.此外，啮齿动物胶质母细胞瘤模型显示，VEGF通过抑制巨噬细胞的免疫和促血管生成功能来调节先天免疫反应，这表明VEGF对适应性免疫系统也是必不可少的^［23］.

通过GO富集分析结果可以看出，VC和GA主要是通过调节免疫系统，对COVID－19进行治疗作用.药物在BP方面主要涉及肽基丝氨酸磷酸化、药物反应、细胞凋亡、磷脂酰肌醇3激酶信号的调节等，CC方面主要涉及细胞表面、胞外外泌体、质膜等，MF方面主要涉及蛋白磷酸酶结合、蛋白质结合等.KEGG通路分析结果显示VC和GA联合防治COVID－19疾病是主要涉及到5－羟色胺能突触、T细胞受体信号通路等信号通路.这充分说明VC和GA主要是依靠这些通路对COVID－19疾病产生治疗作用的.上述研究结果表明，VC和GA联合治疗通过激活免疫系统发挥强大的抗病毒和抗炎作用，这提示联合VC和GA可作为COVID－19的可选治疗手段.

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基金资助

江西省卫健委科技项目(SKJP220225895)