绿玉树内生真菌Cytospora sp.L2次生代谢产物及抑菌活性研究

摘要

为研究大戟属植物绿玉树（Euphorbia trucalli L.）内生真菌的次生代谢产物，将分离自绿玉树的内生真菌Cytospora sp. L2进行固体发酵，利用柱层析、高效液相色谱等手段对其发酵产物进行分离纯化，共得到10个化合物.通过核磁波谱解析等方法发现其为6种甾醇类，2种二聚烷基芳香族，1种酮类衍生物和1种丁烯内酯类化合物，鉴定为dankasteronesA (1)、6β-hydroxystigmast-4-en-3-one (2)、isocyathisterol (3)、6β-hydroxy-ergosta-4,7,22-trien-3-one (4)、（24R）-ergosta-4,6,8(14),22-tetraene-3-one (5)、stigmast-4-en-3-one (6)、integracin A (7)、integracin B (8)、methyl 2,5-dihydro-4-hydroxy-5-oxo-3-phenyl-2-furanpropanoate (9)、和4-methoxy-5-methoxycarbonyl-6-propyl-2-pyrone (10)，其中化合物1、3、5、6、9和10为首次从Cytospora sp.中分离得到.同时采用二倍肉汤稀释法对所分离的化合物进行体外抗菌活性测定，结果显示化合物1～10对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、烟草野火病菌和烟草青枯菌有较弱的抑制作用.

关键词

内生真菌 / Cytospora sp. / 甾醇类化合物 / 抑菌活性 / 绿玉树

Key words

endophytic fungus / Cytospora sp. / steroid / bacteriostatic activity / Euphorbia trucalli L.

绿玉树 （Euphorbia trucalli L.）为大戟科（Euphorbiaceae）大戟属（Euphorbia L.）植物，在我国南北方都有栽培，其原产于非洲东部的安格拉地区，广泛栽培于热带和亚热带^［1］.绿玉树有着很好的药用价值，具有治疗泻下、水肿、癫痫疝气等功效.现代研究^［2］表明其主要化学成分是二萜、三萜类型化合物，此类型是主要活性成分，有很好的抗病毒、抗肿瘤等活性^［3］.植物内生真菌是指在其生活史的一定阶段或者全部阶段无症状地存在于植物表皮细胞层以下的内部组织中，而不使宿主植物表现明显病害症状的真菌^［4］.植物内生真菌种类繁多，是一个庞大的微生物类群，其广泛分布于植物的根、茎、叶、种子等器官和组织中，它不仅可以产生与宿主植物活性成分相同或相似的次生代谢产物，而且还能合成具有生物活性的新代谢产物.例如，从短叶紫杉内生真菌中发现其能产生与宿主植物一样的抗肿瘤物质紫杉醇^［5］；从雷公藤内生曲霉属真菌中分离出新的丁烯酸内酯，这些产物的活性甚至要强于宿主植物的活性物质^［6］.Cytospora sp.含有丰富的次生代谢产物.这些化合物在体外生物试验中表现出各种生物活性，如具有细胞毒性的三苯基醌衍生物^［7］、具有抗菌活性的苄基γ - 丁内酯类似物^［8］、抑制HIV - 1整合酶^［9］作用的聚酮衍生物等，这表明了Cytospora sp.菌属有着很大的开发价值和潜力.另外，目前国内外对绿玉树植物化学成分的研究十分深入，然而对其内生真菌却少有报道，其内生真菌的研究还有着很大的研究空间.因此，本文选取分离自绿玉树中的内生真菌Cytospora sp. L2对其次生代谢产物进行系统研究.希望从其内生真菌的次生代谢产物中发现结构类型新颖，具有抗菌、抗癌、抗氧化等作用的活性化合物，为拓宽天然产物化学的研究领域，寻找新药及药物先导化合物提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 主要仪器和材料

立式自动电热蒸汽灭菌锅（YXQ - LS - 100 S11，上海博迅实业有限公司）；超净工作台（SW CJ ZFD，苏净集团安泰公司）；电热恒温培养箱（DHP - 9012，上海一恒科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪（N - 1300，上海爱朗仪器有限公司）；循环水式真空泵（SHZD （Ⅲ），予华仪器有限责任公司）；双层恒温摇床（BS - 2F，常州隆和仪器制造有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent 1260，美国Agilent公司）；半制备色谱柱（ZORBAX SB - C₁₈，美国Agilent公司）；核磁共振仪（Bruker AV 400，德国 bruker 公司）；imark酶标仪（美国Bio - Rad公司）.

AR级甲醇和AR级乙腈（云南新蓝景化学工业有限公司）、工业乙醇、工业乙酸乙酯、工业二氯甲烷、工业甲醇（云南利研科技有限公司）、80 ~ 100，100 ~ 200目柱层析硅胶（上海皓鸿生物医药科技有限公司）、GF 254薄层层析硅胶板（100 mm × 100 mm，青岛海洋化工有限公司）；氨苄、胰蛋白胨、琼脂粉、酵母粉、NaCl （大连美仑生物技术有限公司）、叶枯唑（上海麦克林生化科技有限公司）.

1.2 实验菌株

野生绿玉树活样品采集自云南省西双版纳市，经云南民族大学周敏教授鉴定为大戟属植物绿玉树（Euphorbia trucalli L.）.编号为L2的菌株从中分离得到，对其进行DNA的提取，将所提取的DNA送往擎科生物有限公司进行测序.所得结果经过基因序列比对发现菌株L2与Cytospora thailandica MFLUCC 17 - 0263（ITS NCBI登记号为NR 159830.1）相似度达100%，因此该菌株鉴定为壳囊孢属Cytospora sp.，菌株现保存于云南民族大学民族药资源化学重点实验室.

供试菌种包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， GDMCC 1.2442）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis， GDMCC 1.1293）、烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv. Tabaci）、烟草青枯菌（Ralstonia solanacearum）.上述供试菌株均为作者所在实验室保藏菌种.

1.3 菌株的发酵

将纯化的Cytospora sp. L2由试管挑取置于PDA培养基上，28 ℃恒温温箱培养3 ~ 5 d，待其长好一定菌丝后，将菌丝挑取置于10瓶装有200 mL PDB培养基的三角瓶中，摇床内28 ℃，160 r/min培养3 ~ 5 d，待其菌体长满锥型瓶底部.将大米提前浸泡24 h，按照大米80 g、蒸馏水100 mL、珍珠岩60 g比例配制大米固体培养基100瓶（共使用大米8 kg）装瓶混匀后，进行121 ℃高温灭菌20 min.灭菌完成后冷却到室温，按菌种质量比1∶10进行接种工作，将接种完成的100瓶大米培养基置于28 ℃的培养间培养30 d左右，固体发酵完成后将大米从发酵罐里掏出，使用体积分数95%的工业乙醇进行超声提取，每次超声1 h，共超声提取5次.乙醇提取液经旋转蒸发仪浓缩得到粗提物，将粗提取使用V _乙酸乙酯∶V _水=1∶1萃取，将乙酸乙酯部分减压浓缩得到浸膏139.8 g.

1.4 发酵物的提取分离

通过TLC分析确定样品分离条件为二氯甲烷/甲醇，浸膏通过硅胶柱层析（80 ~ 100目）使用V _二氯甲烷∶V _甲醇 = 1∶0、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1和0∶1进行洗脱，得到Fr. A ~ Fr. F 6个组分.Fr. B （11.2 g）通过硅胶柱层析（100 ~ 200目）使用V _二氯甲烷∶V _乙酸乙酯 = 1∶0、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1和0∶ 1进行洗脱，得Fr. B1 ~ Fr.B6 6个组分.Fr. B2 （3.4 g）通过柱层析（100 ~ 200目）使V _二氯甲烷∶V _乙酸乙酯 = 1∶0、20∶1和0∶1以及纯甲醇进行洗脱，得Fr. B21 ~ Fr. B24 4个组分.Fr. B22 （876.0 mg）经半制备高效液相色谱（流速3.0 mL/min，流动相为纯甲醇溶液）等度洗脱分离得到4个亚组分Fr. B22-1 ~ Fr. B22 - 4.Fr. B22 - 1 （203.0 mg）经半制备高效液相色谱（3.0 mL/min，流动相为体积分数95%的甲醇水溶液）等度洗脱纯化得化合物1 （6.2 mg）和10 （4.7 mg）.Fr. B22 - 4 （62.0 mg）经半制备高效液相色谱（流速3 mL/min，流动相为纯甲醇溶液）等度洗脱纯化得化合物2 （19.6 mg）和3 （2.5 mg）.Fr. B22 - 3 （34.0 mg）经半制备高效液相色谱（流速3 mL/min，流动相为纯甲醇溶液）等度洗脱纯化得化合物4 （9.6 mg），Fr. B21 （763.0 mg）经半制备高效液相色谱（流速3 mL/min，流动相为体积分数96%的甲醇水溶液）等度洗脱纯化得化合物5 （26.8 mg）和6 （73.2 mg）.Fr. C （10.5 g）通过硅胶柱层析（100 ~ 200目）使用V _二氯甲烷∶V _甲醇 = 1∶0、10∶1、5∶1、1∶1和0∶1进行洗脱，得Fr. C1 ~ Fr. C5 5个组分.Fr. C2 （7.5 g）使用V _二氯甲烷∶V _乙酸乙酯 = 1∶0、20∶1和0∶1以及纯甲醇进行洗脱，得Fr. C21 ~ Fr. C24 4个组分.Fr. C22 （865.0 mg）经半制备高效液相色谱（流速3 mL/min，流动相为体积分数65%的乙腈水溶液） 等度洗脱纯化得化合物7 （102.0 mg）、8 （36.7 mg）和9 （110.0 mg）.

1.5 化合物活性测定

测定化合物1 ~ 10对金黄色葡萄球菌 （S. aureus）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、烟草野火病菌（P. syringae pv. Tabaci）、烟草青枯菌（R. solanacearum）的抑菌活性.将供试菌株活化，选用对数生长期的实验菌种，将菌液浓度稀释至约为1 × 10⁶ ~ 1 × 10⁸ CFU/mL.称取一定质量化合物用1 mL DMSO溶解配成母液（化合物1 ~ 10质量分别为6.8、7.3、2.5、9.4、5.0、8.0、10.0、10.0、10.8和10.4 mg）.采用二倍稀释法用LB液体培养基将化合物稀释成6个梯度，每个梯度设3个复孔（50 μL菌液 + 50 μL化合物溶液）加于96孔板，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌以氨苄青霉素钠为阳性对照，烟草野火病菌和烟草青枯菌以叶枯唑为阳性对照，阴性对照都为LB液体培养基.金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌放置28 ℃培养，烟草野火病菌和烟草青枯菌放置37 ℃培养，培养时间为12 ~ 24 h.用酶标仪在595 nm处测量各孔的吸光度，化合物抑菌活性的强弱由最小抑菌浓度（MIC）值体现，每个实验都平行3次.

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化合物1 淡黄色油状物； ¹H - NMR （CDCl₃， 400 MHz） δ 6.35 （1H， s， H - 4）， 5.26 （1H， m， H - 23）， 5.26（1H， m， H - 22）， 2.80 （1H， t， J = 9.2 Hz， H - 9）， 2.65 （1H， dd， J = 16.9， 1.2 Hz， H - 7a）， 2.53（1H， m， H - 2b）， 2.48 （1H， d， J = 16.7 Hz， H - 7b）， 2.46（1H， m， H - 2a）， 2.45（2H， m， H - 15）， 2.41（1H， m， H - 20）， 2.06（1H， m， H - 1a）， 2.03（1H， m， H - 1b）， 2.01（2H， m， H - 11）， 1.90（1H， m， H - 16a）， 1.87（1H， m， H - 24）， 1.85（1H， m， H - 11b）， 2.53（1H， m， H - 2b）， 1.76（1H， m， H - 12a）， 1.72（1H， m， H - 12b）， 1.69（1H， m， H - 16b）， 1.47（1H， dd， J = 12.9， 7.9 Hz， H - 17）， 1.47（1H， m， H - 25）， 1.25 （3H， s， H - 19）， 1.08 （3H， d， J = 7.0 Hz， H - 21）， 0.97 （3H， s， H - 18） ， 0.90 （3H， d， J = 6.8 Hz， H - 28）， 0.82 （3H， d， J = 6.8 Hz， H - 27）， 0.80 （3H， d， J = 6.8 Hz， H - 26）； ¹³C - NMR （CDCl₃， 100 MHz） δ 215.0 （C - 14）， 200.2 （C - 6）， 199.3 （C - 3）， 156.2 （C - 5）， 135.3 （C - 23）， 132.5 （C - 22）， 126.5 （C - 4）， 62.3 （C - 8）， 54.1 （C - 13）， 49.5 （C - 9）， 49.5 （C - 17）， 43.4 （C - 24）， 41.0 （C - 7）， 39.0 （C - 1）， 38.5 （C - 12）， 38.1 （C - 15）， 37.4 （C - 20）， 36.2 （C - 10）， 34.5 （C - 2）， 33.2 （C - 25）， 25.3 （C - 11）， 24.2 （C - 19）， 23.7 （C - 21）， 23.3 （C - 16）， 20.2 （C - 27）， 19.8 （C - 26）， 17.7 （C - 28）， 17.2 （C - 18）.以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［9］报道一致，因此鉴定为dankasterones A.

化合物2 白色晶体； ¹H - NMR （CDCl₃， 400 MHz） δ 5.80 （1H， s， H - 4）， 4.33 （1H， m， H - 6）， 2.50（1H， m， H - 2b）， 2.35（1H， m， H - 2a）， 2.02（1H， m， H - 1a）， 2.02（1H， m， H - 12a）， 1.96（1H， m， H - 8）， 1.85（1H， m， H - 1b）， 1.52（2H， m， H - 11）， 1.38（3H， s， H - 19）， 1.29 （1H， m， H - 25）， 1.24 （2H， m， H - 7）， 1.15（1H， m， H - 12b）， 1.14（1H， m， H - 23）， 1.10（1H， m， H - 17）， 1.03（1H， m， H - 13）， 0.92（2H， d， J = 6.5 Hz， H - 21）， 0.90（1H， m， H - 9）， 0.85 （3H， d， J = 6.5 Hz， H - 26）， 0.81 （3H， d， J = 6.8 Hz， H - 27）， 0.80 （3H， t， J = 6.6 Hz， H - 29）， 0.73 （3H， s， H - 18）； ¹³C - NMR （CDCl₃， 100 MHz） δ 200.7 （C - 3）， 168.9 （C - 5）， 126.4 （C - 4）， 73.3 （C - 6）， 56.2 （C - 17）， 56.0 （C - 14）， 53.8 （C - 9）， 45.9 （C - 24）， 42.6 （C - 13）， 39.7 （C - 12）， 38.7 （C - 7）， 38.1 （C - 10）， 37.2 （C - 1）， 36.3 （C - 20）， 34.4 （C - 2）， 34.0 （C - 22）， 29.9 （C - 8）， 29.3 （C - 25）， 28.3 （C - 16）， 26.2 （C - 23）， 24.3 （C - 15）， 23.2 （C - 28）， 21.1 （C - 11）， 20.0 （C - 26）， 19.6 （C - 19）， 19.2 （C - 27）， 18.9 （C - 21）， 12.1 （C - 29）， 12.1 （C - 18）. 以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［10］报道一致，因此鉴定为 6β - hydroxystigmast - 4 - en - 3 - one.

化合物3 白色粉末； ¹H - NMR （CDCl₃， 400 MHz） δ 6.16 （1H， d， J = 9.7 Hz， H-6）， 6.08 （1H， d， J = 9.8 Hz， H - 7）， 5.72 （1H， s， H - 4）， 5.22 （1H， dd， J = 15.3， 7.5 Hz， H - 23）， 5.12 （1H， dd， J = 15.3， 8.3 Hz， H - 22）， 2.61（1H， m， H - 2b）， 2.44 （1H， dd， J = 18.1， 4.2 Hz， H - 2a）， 2.11（1H， m， H - 1b）， 2.09（1H， m， H - 12b）， 2.02（1H， m， H - 20）， 1.86 （1H， ddd， J = 20.2， 13.5， 5.1 Hz， H - 11b）， 1.85（1H， m， H - 24）1.73（1H， m， H - 16b）， 1.70（1H， m， H - 1a）， 1.62（1H， m， H - 15b）， 1.59 （1H， m， H - 11a）， 1.49 （1H， m， H - 15a）， 1.45（1H， m， H - 25）， 1.47 （1H， dd， J = 12.1， 4.7 Hz， H - 9）， 1.41 （1H， dd， J = 7.2， 4.8 Hz， H - 14）， 1.33（3H， s， H - 19）， 1.32（1H， m， H - 16a）， 1.12（1H， m， H - 17）， 1.02（3H， s， H - 18）， 0.99 （3H， d， J = 6.6 Hz， H - 21）， 0.91 （3H， d， J = 6.8 Hz， H - 28）， 0.83 （3H， d， J = 6.8 Hz， H - 27）， 0.81 （3H， d， J = 6.8 Hz， H - 26）； ¹³C - NMR （CDCl₃， 100 MHz） δ 199.9 （C - 3）， 163.5 （C - 5）， 139.4 （C - 7）， 135.4 （C - 22）， 132.4 （C - 23）， 128.2 （C - 6）， 125.3 （C - 4）， 71.9 （C - 8）， 57.2 （C - 14）， 56.6 （C - 17）， 53.3 （C - 9）， 44.2 （C - 13）， 42.9 （C - 24）， 40.9 （C - 12）， 39.9 （C - 20）， 36.3 （C - 10）， 35.3 （C - 1）， 33.8 （C - 2）， 33.2 （C - 25）， 28.3 （C - 16）， 20.7 （C - 21）， 20.1 （C - 27）， 19.8 （C - 26）， 19.1 （C - 15）， 19.0 （C - 19）， 18.0 （C - 28）， 17.8 （C - 11）， 14.6 （C - 18）.以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［11］报道一致，因此鉴定为isocyathisterol.

化合物4 白色粉末； ¹H - NMR （CDCl₃， 400 MHz） δ 6.11 （1H， d， J = 1.5， H - 4）， 5.11 - 5.35 （3H， overlapped， H - 7， 22， 23）， 4.96 （1H， brs， H - 6）， 1.17 （3H， s， H - 19）， 1.02 （3H， d， J = 6.6， H - 21）， 0.91 （3H， d， J = 6.6， H - 28）， 0.83 （3H， d， J = 6.6， H - 27）， 0.81 （3H， d， J = 6.6， H - 26）， 0.60 （3H， s， H - 18）； ¹³C - NMR （CDCl₃， 100 MHz） δ 199.3（C - 3）， 170.5 （C - 8）， 142.9 （C - 5）， 135.4 （C - 4）， 132.4 （C - 22）， 121.3 （C - 23）， 119.3 （C - 7）， 67.6 （C - 6）， 56.0 （C - 17）， 55.1 （C - 14）， 45.13 （C - 9）， 43.98 （C - 13）， 42.94 （C - 24）， 40.5 （C - 20）， 39.0 （C - 12）， 38.6 （C - 10）， 33.9 （C - ）， 33.2 （C - 2）， 32.8 （C - 25）， 28.2 （C - 16）， 22.9 （C - 15）， 22.9 （C - 11）， 22.3 （C - 27）， 21.2 （C - 26）， 20.1 （C - 21）， 19.8 （C - 28）， 17.7 （C - 19）， 12.4 （C - 18）. 以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［12］报道一致，因此鉴定为 6β - hydroxy - ergosta - 4，7，22 - trien - 3 - one.

化合物5 淡黄色晶体； ¹H - NMR （CDCl₃， 400 MHz） δ 6.59 （1H， d， J = 9.6 Hz， H - 7）， 6.01 （1H， d， J = 9.5 Hz， H - 6）， 5.72 （1H， s， H - 4）， 5.24 （1H， m， H - 22）， 5.19 （1H， m， H - 23）， 1.05 （3H， d， J = 6.7 Hz， H - 21）， 0.98 （3H， s， H - 19 ）， 0.95 （3H， s， H - 18）， 0.92 （3H， d， J = 6.8 Hz， H - 28）， 0.83 （6H， d， J = 6.7 Hz， H - 26， 27）； ¹³C - NMR （CDCl₃， 100 MHz） δ 199.6 （C - 3）， 164.5 （C - 5）， 156.2 （C - 14）， 135.1 （C - 22）， 134.1 （C - 7）， 132.7 （C - 23）， 124.6 （C - 6），124.5 （C - 8）， 123.1 （C - 4）， 55.8 （C - 17）， 44.5 （C - 9）， 44.1 （C - 13）， 43.0 （C - 24）， 39.4 （C - 20）， 36.9 （C - 10）， 35.7 （C - 12）， 34.3 （C - 2）， 34.2 （C - 1）， 33.2 （C - 25）， 27.8 （C - 16）， 25.5 （C - 15）， 21.3 （C - 21）， 20.1 （C - 27）， 19.8 （C - 26）， 19.1 （C - 11）， 19.1 （C - 28）， 17.8 （C - 18）， 16.8 （C - 19）.以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［13］报道一致，因此鉴定为 （24R） - ergosta - 4，6，8（14），22 - tetraene - 3 - one.

化合物6 白色晶体； ¹H - NMR （CDCl₃， 400 MHz） δ 5.72 （1H， s， H - 4）， 2.40（1H， m， H - 2b）， 2.28（1H， m， H - 2a）， 2.01（1H， m， H - 1a）， 2.00（1H， m， H - 12a）， 1.88（1H， m， H - 8）， 1.85（1H， m， H - 1b）， 1.64（2H， m， H - 11）， 1.29 （1H， m， H - 25）， 1.26 （1H， m， H - 6）， 1.24 （2H， m， H - 7）， 1.18（3H， s， H - 19）， 1.15（1H， m， H - 12b）， 1.12（1H， m， H - 23）， 1.07（1H， m， H - 17）， 1.04（1H， m， H - 13）， 0.91（2H， d， J = 6.5 Hz， H - 21）， 0.90（1H， m， H - 9）， 0.84 （3H， d， J = 6.5 Hz， H - 26）， 0.82 （3H， d， J = 6.8 Hz， H - 27）， 0.81 （3H， t， J = 6.6 Hz， H - 29）， 0.70 （3H， s， H - 18）； ¹³C - NMR （CDCl₃， 100 MHz） δ 199.8 （C - 3）， 171.9 （C - 5）， 123.9 （C - 4）， 56.2 （C - 17）， 56.0 （C - 14）， 54.0 （C - 9）， 46.0 （C - 24）， 42.5 （C - 13）， 40.0 （C - 12）， 38.8 （C - 7）， 36.2 （C - 10）， 35.8 （C - 1）， 35.8 （C - 20）， 34.1 （C - 2）， 34.0 （C - 22）， 32.20 （C - 6）， 29.9 （C - 8）， 29.3 （C - 25）， 28.3 （C - 16）， 26.2 （C - 23）， 24.3 （C - 15）， 23.2 （C - 28）， 21.2 （C - 11）， 20.0 （C - 26）， 19.2 （C - 19）， 18.8 （C - 27）， 17.5 （C - 21）， 12.1 （C - 29）， 12.1 （C - 18）. 以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［14］报道一致，因此鉴定为 stigmast - 4 - en - 3 - one.

化合物7 淡黄色油状物； ¹H - NMR （CD₃OD， 400 MHz） δ 6.20 （1H， d， J = 2.5 Hz， H - 6′）， 6.16 （1H， d， J = 2.5 Hz， H - 4′）， 6.11 （2H， d， J = 2.2 Hz， H - 1， H - 5）， 6.07 （1H， t， J = 2.2 Hz， H - 3）， 5.25 （H， m， H - 14）， 4.82 （H， overlap， H - 15′ ）， 2.73 ~ 2.90 （2H， m， H - 8′ ）， 2.42 （H， t， J =6.7 Hz， H - 7）， 2.01 （3H， s， H - 20′）， 1.66 ~ 1.73 （4H， m， H - 13， H - 15）， 1.47 ~ 1.58 （4H， m， H - 8， H - 9′）， 1.35 ~ 1.47 （4H， m， H - 14′ ， H - 16′ ）， 1.31 ~ 1.37 （20H， m， H - 9 ~ H - 12， H - 16， H - 10′ ~ H - 13′ ， H - 17′）， 0.95 （3H， t， J =7.4 Hz， H - 18′）， 0.91 （3H， t， J =7.3 Hz， H - 17）； ¹³C - NMR （CD₃OD， 100 MHz） δ 173.6 （C - 10）， 172.9 （C - 10′），166.1 （C - 3′）， 163.6 （C - 5′）， 159.3（C - 2， C - 4）， 149.0 （C - 7′ ）， 146.3 （C - 6）， 111.9 （C - 6′）， 107.9 （C - 1， C - 5）， 105.7 （C - 2′）， 101.9 （C - 4′）， 101.0 （C - 3）， 76.6 （C - 14）， 76.6 （C - 15′）， 37.8 （C - 8′）， 37.5 （C - 15）， 37.0 （C - 16′）， 36.6 （C - 7）， 35.5 （C - 13）， 35.3 （C - 14′）， 33.6 （C - 9′）， 32.4 （C - 8）， 31.1 （C - 10′）， 30.8 （C - 11′）， 30.6 （C - 12′）， 30.5 （C - 11）， 30.5 （C - 10）， 30.3 （C - 9）， 26.7 （C - 13′）， 26.5 （C - 12）， 21.2 （C - 20′）， 19.9 （C - 16）， 19.7 （C - 17′）， 14.3 （C - 18′）， 14.3 （C - 17）. 以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［15］报道一致，因此鉴定为 integracin A.

化合物8 淡黄色油状物； ¹H - NMR （CD₃OD， 400 MHz） δ 11.79 （1H， s， 3′ - OH）， 8.99 （3H， brs， 3 × - OH）， 6.20 （1H， d， J =2.5 Hz， H - 6′）， 6.18 （1H， d， J =2.5 Hz， H - 4′）， 6.13 （2H， d， J =2.5 Hz， H - 1， H - 5）， 6.09 （1H， t， J =2.1 Hz， H - 3）， 5.23 （1H， m， H - 14）， 3.46 ~ 3.52 （H， m， H - 15′）， 2.81 （2H， m， H - 8′）， 2.41 （1H， t， J =7.5 Hz， H - 7）， 1.60 ~ 1.72 （2H， m， H - 13）， 1.58 ~ 1.64 （2H， m， H - 15）， 1.46 ~ 1.54 （4H， m， H - 8， H - 9′）， 1.35 ~ 1.40 （4H， m， H - 14′， H - 16′）， 1.34 ~ 1.38 （2H， m， H - 17′）， 1.28 ~ 1.32 （2H， m， H - 16）， 1.21 ~ 1.30 （20H， m， H - 9 ~ H - 12， H - 16， H - 10′ ~ H - 13′， H - 17′）， 0.94 （3H， t， J =6.0 Hz， C - 18′）， 0.91 （3H， t， J =5.6 Hz， C - 17）； ¹³C - NMR （CD₃OD， 100 MHz） δ 172.7 （C - 1′ ）， 166.1 （C - 3′）， 163.5 （C - 5′ ）， 159.2 （C - 2， C - 4）， 149.1 （C - 7′）， 146.3 （C - 6）， 111.9 （C - 6′）， 107.9 （C - 1， C - 5）， 105.6 （C - 2′）， 101.9 （CH - 4′）， 101.0 （C - 3）， 76.6 （C - 14）， 72.2 （C - 15′）， 40.6 （C - 16′）， 38.4 （C - 8′）， 37.8 （C - 15）， 37.7 （C - 7）， 37.0 （C - 13）， 35.5 （C - 14′）， 33.6 （C - 9′ ）， 32.3 （C - 8）， 31.1 （C - 10′）， 30.9 （C - 11′）， 30.9 （C - 12′）， 30.6 （C - 11）， 30.5 （C - 10）， 30.3 （C - 9）， 26.8 （C - 13′）， 26.7 （C - 12）， 19.9 （C - 16）， 19.9 （C - 17′）， 14.5 （C - 18′）， 14.4 （C - 17）. 以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［15］报道一致，因此鉴定为 integracin B.

化合物9 透明晶体； ¹H - NMR （CD₃OD， 400 MHz） δ 7.74 （2H， dd， J = 5.3， 3.3 Hz， H - 2′， H - 6′）， 7.44 （2H， dd， J = 10.4， 4.8 Hz， H - 3′， H - 5′）， 7.35（1H， t， J = 8.5 Hz， H - 4′）， 5.50 （1H， dd， J = 8.1， 2.2 Hz， H - 5）， 3.64 （3H， s， - OCH₃）， 2.48 （1H， m， H - 7a）， 2.39 （1H， m， H - 7b）， 2.43 （1H， m， H - 6a）， 1.73 （1H， m， H - 6b）； ¹³C - NMR （CD₃OD， 100 MHz） δ 174.9 （C - 8）， 171.1 （C - 2）， 139.4 （C - 3）， 131.8 （C - 1′）， 130.6 （C - 4）， 129.8 （C - 4′）， 129.7 （C - 3′， C - 5′）， 128.6 （C - 2′， C - 6′）， 79.3 （C - 5）， 52.2 （8 - OCH₃）， 30.4 （C - 6）， 29.7 （C - 7）. 以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［16］报道一致，因此鉴定为 methyl 2，5 - dihydro - 4 - hydroxy - 5 - oxo - 3 - phenyl - 2 - furanpropanoate.

化合物10 白色晶体； ¹H - NMR （CD₃OD， 400 MHz） δ 5.63 （1H， s， H - 3）， 3.88 （3H， s， H - 7）， 3.84 （3H， s， H - 9）， 2.54 （2H， t， J = 7.3 Hz， H - 10）， 1.70 （2H， m， H - 11）， 0.95 （3H， t， J = 7.4 Hz， H - 12）； ¹³C - NMR （CD₃OD， 100 MHz，） δ 170.1 （C - 4）， 167.3 （C - 6）， 165.5 （C - 8）， 165.1 （C - 2）， 110.6 （C - 5）， 88.4 （C - 3）， 57.5 （C - 7）， 53.2 （C - 9）， 34.8 （C - 10）， 21.7 （C - 11）， 13.7 （C - 12）.以上核磁数据通过微谱数据库查询，发现与文献［17］报道一致，因此鉴定为4 - methoxy - 5 - methoxycarbonyl - 6 - propyl - 2 - pyrone.10种化合物结构如图1所示.

2.2 化合物活性测定结果

采用二倍稀释法对所分离的化合物进行体外抑菌试验，其中金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌液浓度稀释至约为1 × 10⁸ CFU/mL，野火和青枯菌液浓度稀释至约为1 × 10⁶ CFU/mL；抑菌筛选结果见表1，可以看出化合物3对烟叶病原菌野火和青枯的抑制效果最好，其MIC在0.31 ~ 0.63 mg/mL，化合物5的抑菌活性较差，在所设浓度梯度下没有发现其对烟叶病原菌野火和青枯的抑制效果，另外化合物1在所分离化合物中对表皮葡萄球菌的抑菌活性最好，其MIC在0.85 ~ 1.70 mg/mL.

3 结语

从绿玉树内生真菌Cytospora sp. L2的次生代谢产物中分离鉴定10种单体化合物，包括6种甾醇类、2种二聚烷基芳香族化合物、1种丁烯内酯及1种酮类.体外抗菌活性测试表明，所有化合物对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、烟草野火病菌及青枯菌均具抑制活性，其中化合物3对烟草病原菌的抑制效果最显著，MIC值在0.31 ~ 0.63 mg/mL.文献调研显示，该类化合物具有显著药理潜力.化合物1展现强效抗细胞增殖活性，化合物7和8则对HIV-1整合酶具有抑制作用.本文不仅拓展了Cytospora属次生代谢产物的化学多样性，更揭示了药用植物内生真菌作为新型药物先导化合物来源的潜力，为抗肿瘤及抗HIV药物研发提供重要参考，同时丰富了药用微生物资源的研究内涵.

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基金资助

国家自科基金(31860099)

云南省自然科学基金(202001AW07002)