三叶青治疗病毒性脑膜炎的作用机制探索

Exploring the mechanism of Tetrastigma hemsleyanum in treating viral meningitis

摘要

通过中国知网、PubMed数据库收集三叶青活性成分；借助中药系药理学数据库与分析平台（TCMSP）对活性成分进行搜索并获取其作用靶标；通过在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、DisGeNET和GeneCards数据库获取病毒性脑膜炎治疗靶点；采用Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络及“成分-靶点-通路”网络；使用R语言进行基因本体论（GeneOntology,GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析.从三叶青中筛选出12个主要活性成分和181个作用靶点；与796个病毒性脑膜炎相关靶点取交集，得到86个药物-疾病共同靶点，蛋白互作网络（protein-protein interaction networks, PPI）中心主要涉及肿瘤蛋白53(tumor protein 53, TP53)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1, AKT1)、JUN原癌基因（jun proto-oncogene, JUN）、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)等关键靶蛋白. KEGG富集分析主要涉及AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎、TNF信号通路、人类巨细胞病毒感染等相关通路.因此，三叶青防治病毒性脑膜炎可能具有多成分、多靶点、多通路的潜在作用机制.

关键词

三叶青 / 病毒性脑膜炎 / 网络药理学 / 分子对接,作用机制

Key words

T. hemsleyanumin / viralmeningitis / networkpharmacology / molecular docking / mechanism of action

病毒性脑膜炎（virus meningitis，VM）是一种中枢神经系统感染性疾病.该病主要发病人群是10岁以下儿童，病因是各种病毒感染，导致软脑膜和蛛网膜产生弥漫性炎症，从而表现出发热、头痛、呕吐、呼吸衰竭等症状^［1］.VM可分为轻症和重症，多数轻症患儿可自行缓解，但炎症可在不同脑区积累，使患儿出现局限性神经系统体征，导致病情加重，甚至会产生遗留神经系统后遗症^［2］，因此要及时的治疗和干预.目前，VM的发病机制尚未完全清楚，主要认为与神经系统感染、免疫功能降低等相关^［3］.临床上对VM患者的治疗主要以阿昔洛韦等抗病毒药物治疗为主，但有研究^［4］显示，阿昔洛韦的抗病毒谱较窄，长期应用可出现抗药性.

中药药用历史悠久，因毒性低、副作用小、效果佳而备受青睐^［5］.三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg）系葡萄科崖爬藤属植物，主要分布在江西、浙江、安徽等省，是畲族特有的一种民族药，其根块常作为清热解毒药物常被使用，含有黄酮、多糖等多种有效成分，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能^［6-8］.现代医学研究^［9-10］发现，三叶青还可用于痢疾、咽炎、支气管炎、病毒性脑膜炎、高热惊厥、肺炎、肝炎、肾炎等疾病的治疗，极具药用价值.

网络药理学是近年来新兴的一门技术，可从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析预测药物与疾病之间的分子关联规律，为中药应用于疾病的机制研究提供了新方法、新思路，已广泛应用于中药防治疾病的作用机制阐释和研究^［10-11］.本文采用网络药理学方法，以三叶青防治VM为核心，系统地探索三叶青多成分、多靶点、多通路与VM之间的用药关系，整体系统地揭示三叶青潜在有效成分组成和药理作用机制，为三叶青防治VM的研究提供思路.

1 材料与方法

1.1 三叶青活性成分收集及靶标的获取

通过搜索中国知网及PubMed 数据库文献收集三叶青活性成分，再通过中药系药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）对活性成分进行搜索并获取其作用靶标.设定筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥ 30%、类药性（drug likeness，DL） ≥ 0.18，收集所得活性成分并对各成分的作用靶点进行归纳整合.将三叶青活性成分的作用靶点蛋白名在UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）中转化为基因名.

1.2 病毒性脑膜炎疾病靶点的搜集

以“病毒性脑膜炎（VM）”为关键词，分别在在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https://omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org）和GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库中进行检索，合并并删除同时出现在2个关键词中的重复基因，得到病毒性脑膜炎潜在的治疗靶点.

1.3 三叶青活性成分治疗病毒性脑膜炎的靶点筛选

将疾病靶点与药物靶点分别导进Venny 2.1作图工具当中，利用软件画出韦恩图，交集部分即为三叶青活性成分治疗病毒性脑膜炎的潜在作用靶点.

1.4 蛋白互作网络的构建和核心靶点筛选

在STRING数据库当中输入交集靶点，并将蛋白质种类设定成“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.7，进行蛋白互作（protein - protein interaction networks， PPI）网络分析，将数据导入Cytoscape 3.9.0软件并进行拓扑研究，从中挑选取得核心基因.

1.5 “成分 - 靶点”网络构建及分析

使用Cytoscape 3.9.0 软件构建“成分 - 靶点”网络，同时对其进行拓扑研究，并挑选出核心活性元素.

1.6 基因本体论（GO） 富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析

为了得到1.3筛选的潜在基因在功能和信号通路中的富集情况，使用R语言的Bioconductor软件包，以P ≤ 0.05作为条件进行GO功能富集和 KEGG通路富集分析.

1.7 分子对接验证

为了进一步预测关键活性成分和关键靶点直接的结合情况，分别取度值排名前5的核心靶点和成分进行分子对接.从ProteinData Bank（PDB）数据库（http://www.rcsb.org/）中下载蛋白质结构，利用Autodock Tools软件对蛋白质进行去水加氢处理；通过Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载取得格式为sdf的活性成分文件.利用分子对接软件Auto Dock Vina进行分子对接，若对接结合能小于0，则配体与受体可自发结合.部分对接结果用PyMOL 2.3.0进行绘制.

2 结果与分析

2.1 三叶青活性成分及靶点筛选

设置OB ≥ 30%且DL ≥ 0.18 为条件初步筛选出主要活性成分12个（已删除重复值），最终得到12个活性成分，分别为1 - 亚油酸甘油单酯（Th1）、β - 谷留醇（Th2）、大黄素 - 8 - O - β - D - 葡萄糖苷（Th3）、儿茶素（Th4）、槲皮素（Th5）、木犀草素（Th6）、山奈素（Th7）、山奈酚（Th8）、圣草酚（Th9）、异杜荆苷（Th10）、异鼠李素（Th11）、原花青素B1（Th12）.12个活性成分通过TCMSP数据库得到181个治疗疾病的作用靶点.

2.2 病毒性脑膜炎治疗靶点

以“VM”分别在OMIM、DisGeNET和GeneCards数据库中进行检索，分别得到135、14和684个治疗靶点.其中，对于GeneCards检索到的数据，设置筛选条件为“Relevance score ≥ 4”.合并并去除重复项，得到796个基因.在Venny 2.1平台中做出3个数据库的基因交集图，如图1所示.

2.3 三叶青活性成分治疗病毒性脑膜炎的潜在作用靶点

在Venny 2.1平台中输入796个疾病靶点，181个三叶青成分靶点.取交集后，发现药物 - 疾病共同靶点共计86个，如图2所示.将取得的基因全部输入至STRING数据库，以最低相互作用阈值为0.7进行蛋白互作分析，将结果导出并在Cytoscape软件绘制PPI网络，见图3.每个节点的度值大小通过颜色深浅表示，度值排名前5的基因分别为肿瘤蛋白53（tumor protein 53， TP53）、白细胞介素 - 6（interleukin - 6， IL - 6）、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1， AKT1）、JUN原癌基因（jun proto - oncogene， JUN）、 白细胞介素 - 1β（interleukin - 1 beta， IL - 1β）.

2.4 “成分-靶点”网络的构建

将三叶青中12个潜在挥发性活性成分和86个药物 - 疾病共同靶点输入Cytoscape中，绘制出“成分 - 靶点”网络，见图4.度值排名前5的成分分别为槲皮素（Th5）、木犀草素（Th6）、山奈酚（Th8）、异鼠李素（Th11）、山奈素（Th7）.

2.5 GO和KEGG富集分析

使用R语言的Bioconductor软件包，以P ≤ 0.05进行关键基因GO与KEGG分析，将结果以条形图和气泡图形式展现，见图5 ~ 6.GO功能注释包括生物过程、细胞组分和分子功能3个方面.整个生物过程包含氧化应激、甾类激素、脂多糖、营养水平、炎症等生物合成过程；细胞组分主要涉及到膜微区、膜筏、核被膜、囊腔；分子功能大体包含激酶调节、内切酶、水解酶以及磷酸酶相互联系等.

KEGG富集分析得到153个目录，主要涉及到肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）信号通路、白细胞介素7（IL - 7）信号通路、乙型肝炎、丙型肝炎、人类巨细胞病毒感染等病毒感染有关.

2.6 分子对接结果

选取degree值前5的基因（TP53、IL - 6、AKT1、JUN、IL - 1β）与degree值前5的化合物（槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素、山奈素）进行分子对接检验，具体结果如表1.结果显示，结合能均 ≤ -5 kcal/mol，表明活性成分与预测的作用靶点有较强的结合活性.利用PyMOL绘制出核心靶点与小分子配体的对接结合模式，细节图中显示对接形成的氢键作用，并且标出相应的氨基酸残基.分子对接模式图见图7.

3 讨论

为探讨三叶青治疗VM的药效基础及潜在机制，借助网络药理学技术，通过查阅三叶青化学成分相关文献，选取具有代表性的12个成分进行研究.其中槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素、山奈素是三叶青发挥防治VM的主要活性成分.研究表明，槲皮素有显著的抗炎功效，可通过活化NF - κB通路而抑制HMGB1释放及促炎功能，从而有效防治小鼠的脑膜炎损伤^［13］.木犀草素抑制脑膜炎的机制可能是通过抑制p38、MAPK和JNK的磷酸化，抑制NF - κB核易位并随后减弱CVB3感染细胞中炎性细胞因子的表达^［14］.槲皮素、山奈酚能够显著改善肠道病毒71（EV71）和柯萨奇病毒A16（CVA16）导致的无菌性脑膜炎^［15］.

TP53、IL - 6、AKT1、JUN和IL - 1β是本研究的关键基因.TP53基因是一种抑癌基因，该基因编码为一种分子量为53 kDa的蛋白质，可参与氧化应激、炎症、DNA修复等多种生物学功能.研究表明，患有VM的患者体内的TP53基因表达异常，抑制TP53能够缓解VM损伤^［16］.IL - 6和IL - 1β是体内关键的促炎因子，CVB3诱导细胞病变效应和从星形胶质细胞产生促炎细胞因子IL - 1β、TNF - α、IL - 6^［17］，IL - 6和IL - 1β是体内关键的促炎因子，CVB3诱导细胞病变效应和从星形胶质细胞产生促炎细胞因子IL - 1β、TNF - α、IL - 6^［17］，表明抑制炎症可能是治疗VM的一个潜在作用途径.AKT1基因编码的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）依赖的机制被胞外信号激活.研究^［18］表明，在缺乏Mir-155的小鼠对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒和细胞内单核细胞增生利斯特氏菌感染的CD8（+） T细胞反应受损，而这一过程与PI3K - AKT - mTOR信号增加有关.JUN为原癌基因，正常情况下JUN表达水平极低，而VM患者的JUN表达水平明显升高^［19］，治疗VM的药物可通过下调JUN表达来缓解VM导致的脑损伤.

GO分析结果显示，主要涉及到活性氧的生物合成和代谢过程、对氧化应激和炎症的反应以及对激酶活性调节等过程.KEGG分析得出，三叶青治疗VM的靶点主要涉及TNF信号通路、IL - 7信号通路、乙型肝炎、丙型肝炎、人类巨细胞病毒感染等病毒感染有关.TNF可以激活Caspase蛋白激酶、JUK和NF - κB三条信号通路，实现抗细胞毒性、抗病毒、免疫调节等多种生物学功能.研究^［20］发现，VM患者的TNF - α异常升高，表明TNF - α抑制剂可能是治疗VM的方法之一.IL - 7信号通路是调节内在的凋亡通路，从而维持T细胞的存活.研究^［21］表明，给与IL - 7能够剂量依赖性的抑制病毒的复制，减轻病毒性脑膜炎导致的损伤.乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类巨细胞病毒等感染人体后，可能是通降低人体的免疫系统，使得炎症细胞应激强度降低，从而导致病毒感染进一步扩散，导致发生病毒性脑膜炎等疾病^［22］.

分子对接结果显示，三叶青的核心成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素和山奈素与核心靶点TP53、IL-6、AKT1、JUN和IL-1β的分子对接分数均小于-5 kcal/mol，表明核心成分与核心靶点的对接效果良好，从而进一步验证了通过网络药理学得到的结果.异鼠李素对VM的治疗作用尚未有实验证实，其所能够发挥的实际作用还有待进一步深入探究.

4 结语

基于网络药理学对三叶青活性成分防治VM的作用机制进行了分析预测，并对筛选出的核心成分与核心靶点进行了分子对接验证.结果显示，三叶青中的槲皮素、木犀草素、山奈酚和山奈素等成分可能通过AGE - RAGE和PI3K - Akt等信号通路作用于TP53、IL-6、AKT1、JUN和IL-1β等靶点，发挥抗炎作用，缓解病毒性脑膜炎损伤，进一步佐证了中药多成分多靶点的治疗作用，为后续进一步深入研究三叶青药理活性和作用机制提供了依据.

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基金资助

山东省中医药科技项目(Q-2022020)