栽培大麦和野生大麦叶绿体基因组密码子偏好性比较分析

Comparative analysis of chloroplast genome codon usage bias in cultivated and wild of barley

摘要

基于裸大麦、普通大麦和野生大麦叶绿体基因组编码序列，分析其密码子使用偏好及差异.结果显示，3者不同窗口大小的胞嘧啶和鸟嘌呤（GC）含量在密码子不同位点（GC1、GC2、GC3）呈梯度递减趋势（46.74%/46.80%/46.63%、39.47%/39.43%/39.43%、29.80%/29.75%/30.25%），且均存在31个高偏好密码子（RSCU>1），其中29个以A/U结尾，呈现显著NNA/NNU结尾偏好.叶绿体基因组有效密码子数（ENC）值（47.14、47.02、47.75）及ENC>45的基因占比（39、39、42个）表明整体密码子偏好性较弱.中性绘图、ENC-plot和PR2-plot分析证实自然选择是密码子偏好形成的主要驱动力.栽培大麦（裸大麦与普通大麦）在GC组成、ENC分布及最优密码子（含特有GCA/AGA）上高度趋同，提示人工驯化通过纯化选择强化了有益性状的遗传稳定性，为解析大麦驯化分子机制提供了新视角.

关键词

裸大麦 / 普通大麦 / 野生大麦 / 最优密码子 / 选择作用

Key words

H.vulgare var.Coleste / H.vulgare ssp.vulgare / H.vulgare ssp.spontaneum / optimal codons / selection

叶绿体是植物和一些藻类执行光合作用功能的细胞器.由于其基因组结构相对保守、进化速率低，因而叶绿体基因组的研究在多领域具有广泛的应用，包括DNA条形码技术、系统发育分析^［1］、基因工程育种^［2］和生态进化^［3］等.密码子是氨基酸的编码单元，也是基因表达的基本单位^［4］，同义密码子在基因组中的使用呈现不同的频率，这被称为密码子偏好性（PR2）.密码子偏好性是基因表达的重要影响因素之一，直接影响蛋白质合成的效率和准确性.通过密码子偏好性分析，能够更全面地了解分子进化、基因调控等生物学过程，这对于研究物种演化和提高外源基因的表达具有重要意义^［5］.如赵春丽等^［6］通过研究苋菜AtGAI基因密码子偏好性，从而筛选该基因的受体系统.随着组学技术发展的日新月异，叶绿体基因组密码子偏好性研究成果出现井喷式报道，根据中国知网初步统计仅2023年中文期刊报道的研究就多达140篇，涉及73科119属442种.密码子的偏好性受多种因素的影响，包括基因长度、基因表达水平、翻译的起始信号、蛋白质氨基酸组成和结构、突变压力以及自然选择等^［7-10］.进行密码子偏好性研究，不仅有助于揭示物种间适应性进化中的差异，理解蛋白质的合成，为更好地利用植物提供科学依据；而且有助于拓展密码子偏好性在植物叶绿体基因组中的普遍规律，在基因工程、育种和生态学研究等领域具有重要意义.

禾本科大麦属（Hordeum Linn.）是地球上的主食谷物和粮食作物，常见的栽培品种主要有裸大麦和普通大麦两种，均由野生大麦驯化而成.作为重要的粮食作物，大麦属植物的基因组已完成测序、拼接和注释，但是目前未见关于其叶绿体基因组的密码子偏好性研究.普通大麦（H. vulgare ssp. vulgare）广泛种植于世界各地，作为野生大麦（H. vulgare ssp. spontaneum）的驯化品种，通常比野生大麦高大，穗子更紧密，颗粒较大，是世界上最重要的粮食作物之一^［11］.裸大麦（H. vulgare var. coeleste）作为青藏高原地区常栽培的粮食经济作物，一年生，当前的研究聚焦于种质资源、病害防治^［12］、食品发酵加工^［13］、保健品开发^［14］等方面.本文对裸大麦、普通大麦和野生大麦叶绿体基因组密码子偏好性进行分析，将为研究3种大麦优化异源基因，预测基因功能、基因表达等方面提供参考.

1 材料与方法

1.1 蛋白编码序列获取

完整的裸大麦（KT962228）、普通大麦（EF115541）与野生大麦（KC912689）的叶绿体基因组序列从NCBI上下载获得，去除序列长度 < 300 bp、非ATG起始、非TAG，TAA，TGA终止的序列，以及蛋白编码序列（coding sequence，CDS）内部存在终止密码子的序列.最终分别获得50条裸大麦CDS序列、50条普通大麦CDS序列和53条野生大麦CDS序列用于后续分析.

1.2 密码子组成分析

参照李江飞等^［15］的分析方法，通过在线软件CUSP （https://www.bioinformatics.nl/cgi - bin/emboss/cusp）计算每个基因的密码子数量、GC占比（分别为GC₁、GC₂、GC₃）及3位碱基的GC平均占比（GC_all）、有效密码子数（effective number of codon，ENC）、同义密码子相对使用度（relative synonymous codon usage，RSCU），并使用R包进行相关性分析.

1.3 密码子偏好性分析

通过中性绘图、ENC - plot和PR2 - plot开展叶绿体基因组密码子偏好性分析.中性绘图以GC₁和GC₂的平均值（GC₁₂）为纵坐标，以GC₃为横坐标，每个基因用一个散点表示^［16］.在ENC - plot散点图中纵坐标为ENC值，横坐标为GC₃值，标准曲线的公式为ENC = 2 + GC₃ + 29/（GC₃ ² + （1 － GC₃）²）^［17］.分析研究得到密码子在第3位上的A、T、C、G占比，并通过PR2 - plot绘图，图中纵坐标为A₃ /（A₃ + T₃），横坐标为G₃/（G₃ + C₃）.

1.4 最优密码子的确定

参考袁晓龙等^［18］实验方法，使用ENC值为参考，从两端各选择10%的基因构建高、低偏好性密码子库.ΔRSCU ≥ 0.08确定为高表达密码子，RSCU值 > 1确定为高频率密码子.最终，同时满足以上二者条件的密码子将被确定为最优密码子.

2 结果与分析

2.1 密码子组成特征分析

由表1可知，3种大麦GC占比均为GC₁ > GC₂ > GC₃，且 < 0.5，GC₁平均占比分别为46.74%、46.80%和46.63%，GC₂平均占比为39.47%、39.43%和39.43%，GC₃平均占比为29.80%、29.75%和30.25%.ENC均值分别为47.14、47.02和47.75.裸大麦与普通大麦叶绿体基因组CDS区ENC值均为38.03（psbA） ~ 60.25（infA），野生大麦ENC值分别38.03（psbA） ~ 60.81（ycf15），psbA基因展现出较强的密码子偏好性，而infA基因其密码子偏好性不强.

对GC₁、GC₂、GC₃、GC_all及ENC值进行相关性分析（表2）发现，3种大麦中，ENC值与GC₁、GC_all相关性不显著，与GC₃极显著相关，GC_all与GC₁、GC₂、GC₃极显著相关，GC₁和GC₂显著相关.在裸大麦与普通大麦中，ENC值与GC₂显著相关，GC₁与GC₂、GC₃相关性显著；在野生大麦中，ENC值与GC₂相关性不显著，GC₁仅与GC₂呈显著相关性.ENC值与3种大麦GC₃值均存在极显著相关性，且相关系数均大于0.5，表明密码子的选择受到其第3位碱基的组成的影响.

使用TBtools对叶绿体基因组密码子的RSCU值进行可视化分析发现，3种大麦有31个密码子的RSCU值 > 1（包括1个终止密码子 - UAA），13个密码子以A结尾，16个密码子以U结尾，其余2个分别以C/G结尾（图1）.其中编码亮氨酸（Leu）的密码子UUA其相对使用频率最大，在裸大麦和普通大麦中分别为2.091 0、2.093 4，在野生大麦中为2.063 4.且3种大麦均偏好使用UAA为终止密码子，RSCU值分别为1.620 0，1.620 0，1.471 8.同时，在3物种中，编码色氨酸（Trp）的密码子UGG并未出现偏倚，RSCU值均为1.

2.2 中性绘图分析

如图2所示，3种大麦的GC₃值位于0.220 4 ~ 0.443 6之间，GC₁₂值位于0.350 7 ~ 0.534 8之间，裸大麦与普通大麦的CDS基因分布在图中基本重合，可知二者的GC占比非常接近，且二者的全部CDS基因均位于图中对角线上方；而野生大麦的CDS基因有一个位于图中对角线下方.中性分析回归系数分别为0.172、0.152和0.154，表明3种大麦的叶绿体基因组密码子偏好性主要受到自然选择的影响.

2.3 ENC - plot分析

ENC - plot的分析（图3）结果表明，3种大麦分别有39、39和42个CDS基因ENC值 > 45，且大部分CDS基因位于标准曲线的附近的下方.ENC比值频数分布（表3）显示，3种大麦中，分布在0.05 ~ 0.15之内的CDS基因均为31个，占比分别为62%、62%和58.5%，即大部分CDS基因距ENC期望值较远，表明绝大多数基因密码子的偏好性受到选择的影响更大，而受突变压力的影响较小.

2.4 PR2 - plot分析

PR2 - plot绘图分析结果如图4所示，3种大麦各基因并未均匀分布在图中的4个区域内，且各CDS基因密码子第3位碱基的使用频率T > A，G < C.同样表明对造成3种大麦叶绿体基因组的密码子偏性，选择的影响较突变的影响更大.

2.5 最优密码子的筛选

裸大麦与普通大麦叶绿体基因组的CDS基因最优密码子筛选结果相同（表4），ΔRSCU ≥ 0.08的密码子个数均为21个，RSCU > 1的密码子均为30个，最优密码子有16个，分别为GCA、GCU、AGA、CGU、GAU、UGU、GGU、AUU、UUA、AAA、CCA、CCU、AGU、UCU、ACU和GUU，全部密码子以A/U结尾.野生大麦叶绿体基因组，ΔRSCU ≥ 0.08的密码子个数为22个，RSCU > 1的为30个，最优密码子19个，分别为GCU、CGU、GAU、UGU、GGU、AUU、UUA、AAA、UUU、CCA、CCU、AGU、UCA、UCU、ACA、ACU、UAU、GUA和GUU，均以A/U结尾.最优密码子中，GCA和AGA为裸大麦与普通大麦特有，UUU、ACA、UAU、GUA和UCA为野生大麦特有.

3 讨论与结语

在物种长期的适应性进化过程中，编码蛋白基因的密码子往往会对特定的氨基酸产生选择性，被称为密码子的偏好性.本研究对裸大麦、普通大麦和野生大麦叶绿体基因组的密码子偏好性展开分析，3种大麦的CDS平均GC占比为GC1（46.63% ~ 46.80%）、GC2（39.43% ~ 39.46%）和GC3（29.75% ~ 30.25%），较低的GC₃也说明密码子更偏好以A/U结尾，最优密码子的结果印证了这一点.该结果与水稻^［19］，小麦及棉花^［20］等叶绿体基因组密码子使用偏好性相似，这一定程度上表明叶绿体基因组在禾本科中比较保守，而且与高山松（Pinus densata）^［21］、云南油杉（Keteleeria evelyniana）^［22］等高等植物的叶绿体基因组碱基组成研究结果也一致，进一步支持Campbell和Gowri提出的“高等植物密码子倾向于使用A/T结尾的假设^［23］.

3种大麦ENC均值分别为47.14、47.02和47.75，均大于45，说明各物种密码子偏好性较弱.筛选出的最优密码子均以A/U结尾，无C/G结尾.与Qi等^［24］提出的从低等植物到高等植物（藻类、苔藓植物、蕨类植物、裸子植物和种子植物）偏向NNA/NNU的密码子模式类似.此特点与黄芩（Scutellari baicalensis）^［25］、滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）^［26］、金花茶（Camellia nitidissima）^［27］等植物中叶绿体密码子偏好NNA/NNU结果一致，说明高等植物不同物种之间密码子使用特性存在着一定的相似性.中性绘图分析与ENC - plot分析均表明，3种大麦叶绿体基因组密码子的偏好性受到自然选择的影响作用更大.突变和正向选择通常导致最优密码子的多样性增加，而突变和纯化选择则会减少最优密码子的多样性^［28］.野生大麦的叶绿体基因组最优密码子数量和类型均比栽培大麦多，表明野生大麦受到了更多的正向选择，这同样意味着在长期的驯化栽培过程中，栽培大麦在为了保持人类所需要的有益或稳定的性状，受到了更多的纯化选择.本文初步探究了禾本科3种大麦的密码子偏好性情况，为后续提高目的基因的表达效率，外源基因的优化以及相关的育种工程和遗传资源的开发提供参考.

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基金资助

云南省高层次人才培养支持计划项目(YNWR-QNBJ-2020-287)

国家中医药管理局全国中药资源普查项目(GZY-KJS-2018-004)