HPLC法测定雀嘴茶中熊果苷的质量分数

Determination of the mass fraction of arbutin in Que Zui tea by HPLC

摘要

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm），以甲醇和体积分数为0.1%的磷酸水溶液为流动相，建立了高效液相色谱（HPLC）测定雀嘴茶中熊果苷质量分数的方法，该方法在0.349～402.788μg/mL质量浓度范围内具有良好的线性关系，精密度、稳定性、重复性均较好，并优化了提取雀嘴茶中熊果苷的方法.这不仅为雀嘴茶中熊果苷的质量分数测定提供了可靠的分析手段，也为茶叶及其他植物性产品中的活性成分检测提供了新思路.

关键词

雀嘴茶 / 熊果苷 / 提取方法优化 / 质量分数测定

Key words

Que Zui tea / arbutin / extraction method optimization / mass fraction determination

雀嘴茶是在云南少数民族地区的日常饮品之一，主要是由樟叶越桔（Vaccinium dunalianum Wight）幼嫩的叶芽制作而成，在云南有着悠久的食用历史.樟叶越桔主要分布在我国云南、四川、贵州、西藏等省份^［1-2］.据报道，雀嘴茶茶味微苦、性微温，有祛风除湿、舒经活络之功效，主治风湿性关节疼痛^［3］.前期研究^［4-6］表明，雀嘴茶富含咖啡酸类、熊果苷类、以及黄酮类成分，具有保肝护肝、降血糖、改善脂质代谢等功效.

熊果苷（arbutin，对 - 羟基苯 - β - D- 吡喃葡萄糖苷），又名熊果素、熊果酚苷、熊果叶苷，呈白色针晶，水溶性较好^［7］.熊果苷具有很好的抗氧化、美白活性，显著抑制酪氨酸酶的活性和黑色素的沉积，是市场上常用的美白成分^［8］.此外，近年来研究^［9］表明，熊果苷还具有多种显著药理活性，如镇咳平喘、抗氧化、抗菌、增强免疫等.目前，商品级的熊果苷主要以化学合成的方式进行制备，而天然来源的熊果苷较少.前期研究表明雀嘴茶中熊果苷的质量分数较为可观，因此，雀嘴茶有望作为熊果苷的天然重要来源，对开发雀嘴茶资源具有重要的指导意义.本实验以雀嘴茶花芽为研究对象，采用高效液相色谱法建立雀嘴茶中熊果苷的质量分数测定方法，并对熊果苷的提取工艺进行分析比较，确定雀嘴茶中熊果苷的质量分数测定最优方法，可为化妆品及药品中熊果苷分析检测技术提升提供科学依据，同时也为雀嘴茶资源的质量控制提供有效方法.

1 仪器与材料

1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；SB - 800 DTD超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BSA224S - CW型电子天平（瑞士梅特勒 - 托利多公司）；SQP - QUINTIX224 - 1CN型电子天平（瑞士梅特勒 - 托利多公司）；DFY - 400摇摆式中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；HH - 2数显电热恒温水浴锅（国华电器有限公司）.

1.2 材料

雀嘴茶花芽样品采自云南武定，并通过云南濒科委司法鉴定中心进行了样品鉴定，样品来源信息见表1.熊果苷对照品购买于中国食品药品检定研究院（批号111951 - 201301），色谱纯乙腈、甲醇、磷酸购于默克公司，水为纯水.

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定雀嘴茶中熊果苷的质量分数

2.1.1 供试品溶液的制备

首先将雀嘴茶样品进行粉碎，然后过3号筛制备样品粉末.精密称取雀嘴茶粉末0.5 g，置于50 mL容量瓶中，加入纯水至刻度线，并称定质量.在超声波振荡器中进行超声提取，超声功率为250 W，频率40 kHz，时间为30 min，然后冷却至室温，再用纯水补足质量.然后将提取液通过0.22 μm微孔滤膜进行过滤，其过滤液即供试品溶液.

2.1.2 对照品溶液制备

精密称取熊果苷对照品适量，置于20 mL容量瓶，加入色谱级甲醇，然后置于超声波清洗机中震荡5 min， 冷却至室温后再加入甲醇至刻度线，制成0.2 mg/mL的对照品溶液.

2.1.3 色谱条件

色谱柱为Shiseido Capcell PAK色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；进样量5 μL；体积流量0.8 mL/min；柱温30 ℃；流动相为甲醇（A） - 体积分数为0.1%的磷酸水溶液（B），梯度洗脱，0～30 min：体积分数为5%（A）→体积分数60%（A）.结果见图1.

2.1.4 分析方法验证

1） 重复性试验

取雀嘴茶样品粉末，按“2.1.1”项下供试品溶液的制备方法配制1份供试品溶液，采用0.22 μm微孔滤膜过滤.按照“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，测定熊果苷峰面积，结果显示熊果苷峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.85%.

2） 精密度考察

取雀嘴茶样品粉末，按“2.1.1”项下供试品溶液的制备方法平行配制6份供试品溶液，采用0.22 μm微孔滤膜过滤.按照“2.1.3”项下色谱条件进行测定，测得供试品溶液中熊果苷平均质量分数为20.07 mg/g，RSD为0.75%.

3） 稳定性试验

取雀嘴茶样品粉末，按“2.1.1”项下供试品溶液的制备方法配制1份供试品溶液，采用0.22 μm微孔滤膜过滤.按照“2.1.3”项下色谱条件，放置0、2、4、6、8、12 h后分别进行测定，测得熊果苷峰面积的RSD为0.96%.

4） 线性关系考察

取质量浓度为503.485 μg/mL的熊果苷对照品储备液适量，加甲醇配制得50.349、100.697、201.394、302.091和402.788 μg/mL的对照品溶液，摇匀.分别进样5 μL，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.标准曲线回归方程为Y = 2.818 9X - 0.271 9（r = 0.999 97），本品在50.349 ~ 402.788 μg/mL的范围内线性关系良好.

5） 准确度

精密称取同一批已知质量浓度的雀嘴茶样品粉末9份，每份约0.25 g，分别准确加入50%、100%、150%平均质量分数的熊果苷对照品，按“2.1.1”项下供试品溶液的制备方法配制供试品溶液，按照“2.1.3”项下色谱条件进行测定，计算平均回收率得96.51%.

以上分析方法验证结果表明，该分析方法重复性、精密度、稳定性均良好，线性关系、准确度符合规定.

2.1.5 9批雀嘴茶样品中熊果苷的质量分数测定

取“1.2”项下9批干燥雀嘴茶样品打粉，按“2.1.1”项下供试品溶液的制备方法配制供试品溶液，按照“2.1.3”项下色谱条件进行测定，液相色谱图见图2.计算9批雀嘴茶供试品中熊果苷的质量分数，计算结果见表2，表明不同产地雀嘴茶样品中熊果苷的质量分数存在一定差异，但熊果苷总体质量分数均较高.

2.2 提取方法的优化

2.2.1 提取方式考察

取雀嘴茶样品粉末6份，随机分成3组，采用甲醇为提取溶剂，分别加热回流30 min、冷浸提取3 h、超声30 min.然后，收集滤液过0.22 μm微孔滤膜，按照“2.1.3”项下色谱条件进行测定，计算熊果苷信质比，结果见表3.由表3可知，甲醇为溶剂时，超声法优于冷浸法和加热回流法提取.因此，确定超声提取法作为本研究的提取方法.

2.2.2 提取时间考察

取雀嘴茶样品粉末6份，随机分成3组，采用甲醇作为提取溶剂，分别超声20、30、40 min，收集滤液过0.22 μm微孔滤膜.按照“2.1.3”项下色谱条件进行测定，比较熊果苷的信质比.由表4可知，超声提取30 min时熊果苷信质比较高，故确定超声处理时间为30 min.

2.2.3 提取溶剂考察

取样品粉末6份，精密称定，随机分成3组，分别精密加入纯水、甲醇及乙醇各50 mL，称定质量.超声处理30 min冷却至室温，补足质量，摇匀，收集滤液过0.22 μm微孔滤膜，按照“2.1.3”项下色谱条件进行测定.表5中的结果表明，当提取溶剂为纯水时，雀嘴茶中熊果苷的提取率较高，且该情况下，被测成分色谱峰峰型较好（见图3），因此确定纯水为提取溶剂.

3 讨论与结论

3.1 流动相选择

分别采用甲醇-体积分数为0.1%的磷酸水溶液和乙腈 - 体积分数为0.1%的磷酸水溶液做为HPLC流动相体系，考察雀嘴茶样品中熊果苷的出峰时间、分离度及理论塔板数等系统适用性试验考察指标，结果表明甲醇体积分数为-0.1%的磷酸水溶液为最佳流动相体系.

3.2 检测波长选择

采用安捷伦1260 DAD检测器对熊果苷进行全波长扫描（图4），通过比较熊果苷对照品的特征吸收波长和化合物的峰形、峰高及峰面积，确定280 nm为最佳检测波长.

3.3 柱温选择

在其他因素不变的情况下，考察不同柱温对熊果苷质量分数测定的影响（表6）.结果表明，柱温为25、30和35 ℃时，虽对保留时间和峰面积积分值有一定影响，但对供试品与熊果苷对照品的峰面积比值影响不明显.因此，不探讨柱温设置要求.

3.4 流速选择

在其他因素不变的情况下，考察不同流速对熊果苷质量分数测定的影响.由表7可见，流速变化虽对保留时间和峰面积积分值有明显影响，但对供试品与熊果苷对照品的峰面积比值无明显影响.选择较低流速时，可避免熊果苷的保留时间过短.

3.5 不同品牌的同类型色谱柱考察

在其他因素不变的情况下，考察不同品牌的同类型色谱柱对熊果苷质量分数测定的影响.由表8可见，不同品牌的同类型（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱，虽对保留时间有一定影响，但对供试品和熊果苷对照品峰面积积分值和峰面积比值影响不大，对被测成分色谱峰的分离度无明显影响.因此，本研究可不受色谱柱品牌限制.

3.6 结语

以雀嘴茶花芽为研究对象，采用高效液相色谱仪，对熊果苷的质量分数进行测定.确定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇（A） - 体积分数为0.1%的磷酸水溶液（B）为流动相，0 ~ 30 min：体积分数为5%→体积分数为60%的A梯度洗脱，检测波长280 nm，进行了准确度、线性关系、精密度、稳定性、重复性等分析方法验证试验考察，结果表明该方法操作简便，重复性和稳定性好，且柱温、流速及色谱柱的选择灵活.同时优化了雀嘴茶中熊果苷的提取方法，超声辅助水溶液提取30 min，熊果苷的提取效率较高.本研究可为雀嘴茶资源的质量标准化和规范化控制提供参考依据，同时也为化妆品及药品中熊果苷分析检测技术提升提供科学依据.

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基金资助

云南省“生物医药领域”科技计划项目(2019ZF010)