川贝母基源植物鳞茎内生真菌产生物碱菌株筛选及活性测定

Screening of alkaloid-producing strains and activity determination of endophytic fungi from the bulbs of Fritillaria cirrhosa plants

摘要

从川贝母基源植物鳞茎内生真菌中筛选能代谢产生川贝母生物碱活性成分的菌株，并对其进行抗氧化活性和抑菌活性评价.结合生物碱显色反应、薄层层析（TLC）和高效液相－蒸发光散热（HPLC－ELSD）方法检测内生真菌菌株发酵产物的生物碱成分，采用DPPH自由基清除力测定、ABTS自由基清除力测定和铁离子还原/抗氧化能力测定（FRAP）方法对菌株发酵产物进行抗氧化活性评价，运用平板打孔法对其进行抑菌活性评价.研究发现4个镰刀菌属内生真菌菌株（Fusarium tricinctum、 Fu. oxysporum、Fu. solani和Fu. sp.）能产生与川贝母相近的西贝母碱、西贝母碱苷和贝母辛生物碱活性成分；1个镰刀菌属菌株（Fu. petersiae）的三氯甲烷提取成分具有较强的抗氧化活性，1个白腐菌属菌株（Phanerochaete sp.）的总生物碱成分具有较好的抑菌活性.综上所述，镰刀菌属的内生真菌可能产生川贝母生物碱活性成分，且其发酵产物具有较好的抗氧化活性，值得进一步研究和开发应用.

Abstract

Endophytic fungal strains from the bulbs of Fritillaria cirrhosa plants were screened for their ability to metabolize and produce the alkaloid active ingredients of F. cirrhosa， and their antioxidant and antibacterial activities were evaluated. Alkaloid color reaction， thin layer chromatography （（TLC）， and high - performance liquid chromatography - evaporative light scattering detection （HPLC - ELSD） were used to detect the alkaloid components in the fermentation products of the endophytic strains. The antioxidant activity of the fermentation products was evaluated by determining the DPPH free radical scavenging capacity， ABTS free radical scavenging capacity， and ferric reducing antioxidant power （FRAP）， while the antibacterial activity was evaluated using the agar well diffusion method. It was found that four endophytic fungi strains of Fusarium （Fu. tricinctum，Fu. oxysporum，Fu. solani and Fu. sp.） were able to produce the alkaloid active components of sipeimine， sipeimine - 3 - β - D - glucoside， and peimisine， which are the same as or similar to those found in F. cirrhosa. The trichloromethane extract of a Fu. petersiae strain exhibited strong antioxidant activity， and the total alkaloid components of a Phanerochaete sp. strain showed good antibacterial activity. In conclusion， endophytic fungi of the genus Fusarium demonstrate potential for producing alkaloid active ingredients characteristic of F. cirrhosa， and their fermentation products exhibit notable antioxidant activity， warranting further research and development for practical applications.

Graphical abstract

关键词

川贝母 / 内生真菌 / 生物碱 / 抗氧化活性 / 抑菌活性

Key words

Fritillaria cirrhosa / endophytic fungi / alkaloids / antioxidant activity / antibacterial activity

川贝母为为百合科（Liliaceae），贝母属（Fritillaria）植物，川贝母（F. cirrhosa ）、暗紫贝母（F. unibrocteoto ）、甘肃贝母（F. przewalskii ）、梭砂贝母（F.delovoyi ）、太白贝母（F. taipaiensis ）或瓦布贝母（F. unibracteata ）的干燥鳞茎.川贝母首载于《神农本草经》^［1］，药用历史悠久，是我国的传统名贵中药^{.它含有西贝碱、贝母辛、贝母素甲和贝母素乙等生物碱活性成分，具有清热润肺、化痰止咳、散结消痈的功效，用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、痰中带血、瘰疬、乳痈、肺痈（2020版《中国药典》）.川贝母基源植物野生资源的地理分布区域狭窄，主要分布于青藏高原西部的喜马拉雅－横断山区南部高原，包括四川西部、云南西北部、西藏东部及南部、青海东部及南部和甘肃南部等四川与云南、西藏、青海和甘肃交界处的高山地区［2］.由于供需矛盾加剧，过度采挖以及生态环境的改变，川贝母自然资源遭到严重破坏，日渐减少，稀缺珍贵［3-4］，其基源植物川贝母、暗紫贝母、梭砂贝母、甘肃贝母和太白贝母已被列为国家二级重点保护野生植物［5］.川贝母基源植物的人工培育也存在产量低、质量参差不齐等问题，因此川贝母基源植物野生资源日渐匮乏与其需求量与日俱增间的矛盾问题亟待解决［6］.}

川贝母的主要活性成分是西贝母碱、贝母辛、贝母素甲和贝母素乙等甾体生物碱.这些生物碱成分能够止咳祛痰、平喘、镇痛，具有抗氧化和抗菌消炎等活性^［7-8］.川贝母基源植物鳞茎含有丰富的内生真菌，一些内生真菌能产生川贝母生物碱活性成分，且具有良好的抗氧化和抑菌活性.陈鹊等^［9］从甘肃贝母分离得到13株内生真菌，其中的接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）能产生多种生物碱物质.潘峰等^［6］报道镰刀菌（Fu. tricinctum）液体发酵培养后能产生川贝母生物碱贝母辛和贝母素乙.同时，研究^［10］发现川贝母内生真菌Fu. tricinctuml的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和乙醇提取物具有较强的抗氧化活性；甘肃贝母和暗紫贝母的内生真菌代谢产物生物碱类成分对金黄色葡萄球菌以及粪肠球菌有较好的抑制作用，瓦布贝母的内生真菌代谢产物对大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌等多种细菌具有显著的抑制作用^{［11－13］}.

前期从不同物种、不同分布地及不同生长年限－生理时期的川贝母基源植物鳞茎样品中分离培养共获得了527株内生真菌，隶属于9纲、20目、37科、57属、218种.本文将对这些川贝母基源植物鳞茎内生真菌菌株进行液体发酵培养，采用生物碱显色反应、TLC检识和HPLC－ELSD测定检测分析菌株发酵产物的生物碱成分，筛选能产生川贝母生物碱活性成分的内生真菌，并对其进行抗氧化和抑菌活性测定，挖掘具有开发应用潜力和价值的内生真菌菌株.本文为川贝母基源植物内生真菌资源的开发利用奠定了基础，对稀缺川贝母基源植物的资源保护和可持续利用具有实际意义.

1 材料、仪器与试剂

1.1 实验材料

来源于不同物种、不同分布地（云南维西县、云南喜洲花甸坝、云南巧家县和西藏类乌齐县）及不同生长年限－生理时期（2年生－成熟期、2年生－萌发期、4年生－花期和4年生－萌发期）的川贝母基源植物鳞茎利用组织培养技术分离、培养出来的527株内生真菌菌株.

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

SW－GJ－2FD超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；SPX－70BIII生化培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；TS－211B恒温摇床（上海天呈仪器制造有限公司）；Cary－100紫外分光光度计（美国安捷伦科技有限公司）；YXQ－100SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；HB10旋转蒸发仪（德国IKA集团广州仪科实验室技术有限公司）；101－1AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；DK－98－IIA电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SK3300H超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；CP114电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；华谱S6000高效液相色谱仪（华谱科技有限公司）；COSMOSIL色谱柱（月旭科技股份有限公司）.

1.2.2 试剂

氨苄青霉素钠购于上海蓝季科技发展有限公司；硫酸链霉素购于山东鲁抗医药股份有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖培养基（PDB）、营养肉汤培养基、MRS培养基、LB培养基均购于青岛日水生物技术有限公司；维生素C（Vc）、ABTS、TPTZ、琼脂、甘油、改良碘化铋钾试剂均购于北京索莱宝科技有限公司；MEA培养基购于青岛宾得生物技术有限公司；过硫酸钾、FeSO₄、冰醋酸、无水醋酸钠、次氯酸钠购于天津市风船化学试剂科技有限公司；无水乙醇购于成都市科隆化学品有限公司；薄层色谱显色剂（体积分数10%的硫酸乙醇溶液），甲醇、三氯甲烷、浓氨水、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等试剂为重蒸的工业或化学纯溶剂均购自利研科技有限公司；DPPH购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，FeCl₃^. 6H₂O购于广东光华科技股份有限公司，西贝母碱、西贝母碱苷、贝母素甲、贝母素乙和贝母辛标准品均购自北京中科质检生物技术有限公司.

抑菌活性测定的指示菌株包括大肠杆菌（Escherichia coli， ATCC2592）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis， ATCC29212）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa， ATCC27853）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， ATCC29213）均购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心.

2 方法和步骤

2.1 内生真菌菌株液体发酵培养及发酵产物样品制备

内生真菌菌株于PDA试管斜面培养基中28 ℃活化培养4 d后，取直径约1 cm的菌块接种到马铃薯葡萄糖培养液（PDB，100或250 mL）、26 ℃、130 r/min培养7 d，获得菌株发酵产物.

菌株发酵产物静置2 h，在通风良好的环境中真空抽滤，将发酵液和菌丝体分开.菌丝体烘干，研碎，加10倍体积量的体积分数为80%乙醇，于60 ℃、50 Hz超声中提取1 h，过滤，滤液减压浓缩.发酵液过滤，浓缩至原体积的20%.将菌丝体滤液和发酵液浓缩液混合，浓氨水调节pH至10，加1.5倍体积的三氯甲烷震荡提取3次得到菌株发酵产物的总生物碱样品，备用.提取同上，将菌丝体滤液和发酵液浓缩液混合后用2倍体积量的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇分别震荡萃取2次.将收集到的5种提取物浓缩蒸干得浸膏，4 ℃保存备用.

2.2 产川贝母生物碱的内生真菌菌株筛选

精密称取西贝母碱、西贝母碱苷、贝母素甲、贝母素乙和贝母辛标准品各1.0 mg，分别溶于1.0 mL甲醇，制备成标准对照品溶液备用，以PDB空白培养基提取物为阴性对照.

生物碱显色反应.菌株发酵产物的总生物碱样品用甲醇复溶，调节pH值至4.5到6.0，以改良碘化铋钾为显色剂，进行生物碱显色反应.显橘色为生物碱成分阳性，显青褐色为生物碱成分阴性.重复测定3次.

薄层色谱（TLC）检识.取生物碱显色反应呈阳性的菌株总生物碱样品制备液，于V_氯仿∶V_甲醇=5∶1的展开缸中展开，经硫酸乙醇溶液显色，对比西贝母碱、西贝母碱苷、贝母素甲、贝母素乙和贝母辛等川贝母生物碱标准对照品进行检识.测定重复3次.

HPLC－ELSD检测.对生物碱显色反应和TLC检识初筛显示含有川贝母生物碱活性成分的内生真菌菌株总生物碱样品进行进一步的HPLC－ELSD检测.色谱条件为：色谱柱5C₁₈－PAQ（4.6 mm × 150 mm，5 µm），流动相V_乙腈∶V_{0.05%三乙胺水溶液} = 70∶30等度洗脱.进样量20 μL，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，蒸发光检测器（ELSD）检测，压缩空气为载气，漂移管温度75 ℃.

2.3 内生真菌菌株的活性评价

2.3.1 菌株抗氧化活性测定

将各个内生真菌菌株发酵产物的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇萃取物分别用甲醇稀释为5、4、3、2、1、0.5和0.1 mg/mL的样品，备用.

1） DPPH自由基清除能力测定

按照参考文献［14］配制DPPH溶液.取DPPH 0.8 mg溶于20 mL无水乙醇，配制成0.04 mg/mL DPPH溶液.吸取不同质量浓度的样品供试溶液200 µL，加入5 mL DPPH溶液，混匀，27 ℃水浴10 min.用紫外分光光度计在517 nm处测吸光度值，记为A_样品；以无水乙醇200 µL + DPPH 溶液5 mL混合物的吸光度值作为对照，记为A_对照；以待测样品70 µL + 无水乙醇200 µL混合物的吸光度值作为空白，记为A₀.测定重复3次.代入以下公式（1）即可得出DPPH自由基清除率.

\mathrm{D}\mathrm{P}\mathrm{P}\mathrm{H}\mathrm{自由}\mathrm{基清}\mathrm{除率}=\left(\mathrm{1}-\frac{(A_{\mathrm{样品}}-A_{\mathrm{0}})}{A_{\mathrm{对照}}}\right)\times \mathrm{100}\%.（1）

2） 自由基清除能力测定

ABTS工作液配制参考文献［15］.取7 mol/L ABTS溶液和2.45 mol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、闭光条件下放置12 h，得到稳定的ABTS母液.不同浓度的样品供试溶液15 µL分别加入5 mL ABTS工作液，37 ℃避光孵育30 min，蒸馏水调零，于734 nm测定吸光度值，记为K_样品；15 µL甲醇加入ABTS工作液5 mL作为空白，记为K_空白，测定重复3次，参照公式（2）计算ABTS清除率.

\mathrm{A}\mathrm{B}\mathrm{T}\mathrm{S}\mathrm{清除}\mathrm{率}=(\mathrm{1}-\frac{K_{\mathrm{样品}}}{K_{\mathrm{空白}}})\times \mathrm{100}\%.（2）

3） 铁离子还原/抗氧化能力测定

按照参考文献［16］ FeSO₄溶液配制及标准曲线绘制.FRAP工作液（现配现用）为0.3 mmol/L，pH 3.6的醋酸钠缓冲液，10 mmol/L TPTZ（用40 mmol/L盐酸配制），20 mmol/L FeCl₃溶液以体积比10∶1∶1比例配制，37 ℃预热备用.称取0.695 g FeSO₄·7H₂O溶于适量水中，加水定容至250 mL，配制成10 mmol/L FeSO₄溶液.分别量取15、12.5、10、7.5、5、2.5 mL上述溶液至50 mL容量瓶，加水定容，得到浓度为3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5 mmol/L的FeSO₄溶液.取不同浓度的FeSO₄溶液各50 µL与4.9 mL的TPTZ工作液37 ℃下反应10 min，于593 nm处测定吸光度.以FeSO₄溶液浓度C为横坐标，吸光值Y为纵坐标，绘制标准曲线.取不同浓度的样品溶液50 µL，加入4.9 mL预热的FRAP工作液，摇匀后37 ℃水浴10 min，于593 nm处测定其吸光度A_j.甲醇加入FRAP工作液为空白.测定重复3次.根据FeSO₄标准曲线，将A_j代入曲线求得相应的FeSO₄浓度，定义为FRAP值.FRAP值越大，抗氧化活性越强.

2.3.2 菌株抑菌活性测定

将金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌用营养肉汤培养基，大肠杆菌用LB培养基，粪肠球菌则用MRS培养基在37 ℃，60 r/min下活化培养24 h后，将各培养产物加入到LB培养基中，37 ℃、300 r/min继续培养24 h.随后采用比浊法，用生理盐水将菌液稀释成（1 ~ 5） × 10⁶ CFU/mL的菌悬液^［12］.

每个平皿加入100 µL细菌菌悬液，涂布均匀.每个浓度菌株样品一个平板，每个平板打3个孔，每个孔加入20 µL样品溶液.铜绿假单胞菌30 ℃，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌37 ℃培养16 h.十字交叉法测量抑菌圈.以0.3 mg/mL氨苄青霉素钠和0.5 mg/mL硫酸链霉素为阳性对照，乙酸乙酯为阴性对照.

3 结果

3.1 产川贝母生物碱内生真菌菌株筛选

生物碱显色反应和TLC薄层检识显示，川贝母基源植物鳞茎的17属24种32株内生真菌菌株发酵产物可能含有贝母素甲、贝母素乙、贝母辛、西贝母碱和西贝母碱苷等川贝母生物碱活性成分（表1）.进一步的HPLC－ELSD检测显示，菌株Fu. tricinctum（分离自维西县的4年生－休眠期栽培川贝母植株）、Fu. oxysporum（分离自维西县的1年生－休眠期栽培川贝母植株）、 Fu. solani（分离自维西县的3年生－果期栽培川贝母植株）和Fu. sp.（分离自大理苍山的2年生－花期川贝母植株）可能含有与川贝母相同或相近的贝母辛、西贝母碱和西贝母碱苷生物碱活性成分（表1，图1）.

3.2 内生真菌菌株的活性评价

3.2.1 内生真菌菌株抗氧化活性评价

采用DPPH自由基清除力测定、ABTS自由基清除力测定和亚铁离子螯合活性3种方法对镰刀菌属的8种17株内生真菌菌株进行抗氧化活性进行测定，结果显示，菌株发酵产物的三氯甲烷和乙酸乙酯提取成分具有相对较好的抗氧化活性（表2）.其中，菌株Fu. petersiae（来源于维西县的三年生－果期栽培川贝母植株）的抗氧化活性较强，其三氯甲烷提取物的ABTS自由基清除率为8.457 5%，高于同等浓度的维生素C阳性对照.

3.2.2 内生真菌菌株抑菌活性评价

对25属39种共68株内生真菌菌株发酵产物总生物碱进行抑菌活性测定，结果显示，其中2株菌株对4种指示细菌的抑菌结果较好（表3）.菌株Phanerochaete sp.（来源于维西县的3年生－果期栽培川贝母植株）对大肠杆菌的抑菌圈平均值为（15.07 ± 2.68） mm，抑菌活性强于阳性对照硫酸链霉素（14.79 ± 0.52） mm和阳性对照氨苄青霉素钠（12.08 ± 0.25） mm，对其它3种指示菌株也有一定的抑制作用，见表3.菌株Trichoderma gamsii（来源于维西县的两年生－休眠期栽培川贝母植株植株）的抑菌圈平均值为（13.24 ± 3.20） mm，其抑菌活性强于阳性对照硫酸链霉素（12.08 ± 0.25） mm.

4 讨论与结语

潘峰等^［17］的研究表明，镰刀菌属真菌为瓦布贝母等川贝母基源植物的优势内生真菌菌群，能够代谢产生川贝母生物碱，且具有良好的ABTS阳离子自由基清除能力和亚铁离子螯合能力等抗氧化活性.本文也发现，川贝母基源植物鳞茎内生真菌中，镰刀菌属真菌的多样性较高，分离培养获得的57属218种348株内生真菌中，10种111株隶属于镰刀菌属.该属内生真菌（Fu.tricinctum，Fu.oxysporum，Fu.solani和Fu.sarium.sp.）可能代谢产生与川贝母相同或相近的生物碱活性成分.同时，菌株（Fu.petersiae）具较好的抗氧化活性.可见镰刀菌属内生真菌具有很大的研究开发潜力.今后研究工作中，需要对该属内生真菌开展进一步的物种多样性和活性代谢产物研究，挖掘其活性成分和生物活性，以期为川贝母内生真菌资源开发利用，及川贝母基源植物资源可持续利用作出贡献.

苏天娇^［18］的研究表明，川贝母的内生真菌具有较好的生物活性.本文发现，少数种类川贝母基源植物鳞茎内生真菌的菌株发酵产物具有一定的抗氧化和抑菌活性.菌株Fu.petersiae的三氯甲烷提取成分具有较好的抗氧化活性，菌株Phanerochaete sp.的生物碱成分具有较好的抑菌活性.下一步研究工作中，需要对上述菌株开展进一步的活性成分研究，分离获得其天然抗氧化活性成分和抑菌活性成分.同时，对川贝母基源植物鳞茎内生真菌发酵产物进行更加全面深入的活性代谢产物研究.以期更好的开发利用川贝母基源植物内生真菌资源.

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基金资助

云南省科学技术厅云南中医学院应用基础研究联合专项资金（2018FF001（- 038

2017FF116（- 005）

云南省科技人才和平台计划(202105AG070012)