蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定紫皮石斛多糖的条件

Conditions for anthrone/phenol - vitriolic colorimetry in determining polysaccharides of Dendrobium devonianum

摘要

分别研究蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定紫皮石斛多糖的方法中显色溶液用量、显色温度和显色时间对吸光度值的影响.采用响应面法拟合优化影响人工大棚种植紫皮石斛多糖测定吸光度值的因素.实验数据显示，用蒽酮 - 硫酸法测定人工大棚种植紫皮石斛多糖吸光度值时，溶液显色时间影响最大，蒽酮溶液用量次之，显色温度影响最小；而使用苯酚 - 硫酸法进行测定时，苯酚溶液用量影响最大，显色时间次之，影响最小的是显色温度.多糖所制备的标准曲线拟合良好，精密度高、稳定好、回收率高，故2种测定方法在优化最佳实验条件下进行，均可作为测定人工大棚种植紫皮石斛多糖质量浓度的测定方法.使用2种测定方法分别测定铁皮石斛和紫皮石斛多糖的质量浓度时，实验数据存在较大差异.

Abstract

The effects of the volume of chromogenic solution， chromogenic temperature， and chromogenic time on the absorbance values were investigated separately using anthrone/phenol - vitriolic colorimetry for the determination of polysaccharides in Dendrobium devonianum. Response surface methodology was applied to model and optimize the factors influencing the absorbance of polysaccharides in artificially greenhouse - cultivated D. devonianum. Experimental results showed that in the determination of polysaccharides in artificially greenhouse - cultivated D. devonianum using the anthrone - sulfuric acid method， chromogenic time had the greatest effect on the absorbance， followed by the amount of anthrone solution， and finally the chromogenic temperature. In contrast， the application of the phenol - sulfuric acid method revealed that the volume of phenol solution exerted the greatest influence on the absorbance， followed by the chromogenic time， while the chromogenic temperature demonstrated the least effect. Both methods produced well - fitted standard curves with high precision， good stability， and high recovery rates under optimized conditions， confirming their suitability for determining polysaccharide concentrations in artificially greenhouse - cultivated D. devonianum. Significant discrepancies were observed in the experimental data with the application of these two methods for determining polysaccharide concentrations in D. officinale and D. devonianum， respectively.

Graphical abstract

关键词

蒽酮 - 硫酸法 / 苯酚 - 硫酸法 / 紫皮石斛 / 多糖

Key words

anthrone - vitriolic colorimetry / phenol - vitriolic colorimetry / D. devonianum / polysaccharides

紫皮石斛（Dendrobium devonianum Paxton）为附生多年生兰科石斛属草本植物，多生长于温暖湿润的高海拔地区^［1-5］.石斛作为治疗胃阴虚、肾阴虚症方面临床常用药已有两千多年历史.因此，铁皮石斛在《道藏》中有“九大仙草”的美誉^［6-7］.此外，石斛多糖还具有抗氧化^［8-9］、抗炎^［10］、美白保湿^［11-12］、皮肤光损伤的修复^［13］、抗衰老^［14］、抗肿瘤^［15-16］、免疫调节^［17］等功效.现如今石斛用量急剧增加，从野生采摘向人工培育转变，产量成数量级增长.同时人工培育石斛药用价值也遭到了质疑.石斛多糖和甘露糖等活性成分常作为评价石斛品质的重要指标，能鉴别石斛品质优劣.

近年来，石斛多糖相关的研究受到众多研究人员的青睐，主要涉及提取制备、分离纯化^［18］、空间结构特性和药理活性等方面的研究^［19-21］，多糖质量浓度测定方法主要有蒽酮 - 硫酸法和苯酚 - 硫酸法.目前，研究人员多偏向于研究2种测定方法在铁皮石斛多糖质量浓度测定中的优化^［22］，而关于紫皮石斛多糖质量浓度测定方法尚未涉及.因此本研究采用响应面方法优化人工紫皮石斛多糖质量浓度检测条件.对不同种石斛和不同种种植方式的石斛用Sevag试剂脱蛋白处理前后石斛多糖检测并评价，比较2种石斛多糖测定方法存在的异同以及不同种石斛种植方式对石斛多糖质量浓度的影响，为石斛未来多元化开发利用、质量评价、药食同源开发利用提供一定技术支持.

1 材料试剂和仪器

1.1 材料试剂

1.1.1 材料

2021年12月采于云南省保山市龙陵县境内的鲜石斛，鉴定为紫皮石斛（人工大棚种植紫皮石斛简称人工紫皮石斛，仿野生种植紫皮石斛简称仿野生紫皮石斛）和铁皮石斛（人工大棚种植铁皮石斛简称人工铁皮石斛，仿野生种植铁皮石斛简称仿野生铁皮石斛）.

1.1.2 试剂

标准品为D - 无水葡萄糖（CAS号：50 - 99 - 7），源自中国食品药品检定研究院；苯酚（CAS号：108 - 95 - 2）、蒽酮（CAS号：108 - 95 - 2）、浓硫酸（分析纯、CAS号：7664 - 93 - 9）、无水乙醇（分析纯、CAS号：64 - 17 - 5）、体积分数为95%乙醇（分析纯、CAS号：64 - 17 - 5）、氯仿（分析纯、CAS号：67 - 66 - 3）、正丁醇（分析纯、CAS号：71 - 36 - 3）等均购自上海国药集团；所使用水均采用德国默克公司超纯水设备自制.

1.2 仪器

电子分析天平AUW - 220D型（日本岛津）；分光光度计UNICO - 7200型（上海尤尼柯）；分光光度计UV - 1800型（日本岛津）；旋转蒸发仪RE - 52 - 05型（上海亚荣）；恒温水槽HWS - 28型（上海一恒）；离心机TDL - 40B型（上海安亭）；超纯水机（德国默克公司Milli - Q）等 .

2 方法

2.1 石斛样品的处理

取经鉴定的新鲜紫皮石斛（人工紫皮石斛和仿野生紫皮石斛）和铁皮石斛（人工铁皮石斛和仿野生铁皮石斛），经自来水洗净，纯化水润洗后，切成寸条，60 ℃干燥，粉碎过60目筛，备用.

2.2 石斛多糖的提取

石斛样品（人工紫皮石斛、仿野生紫皮石斛、人工铁皮石斛和仿野生铁皮石斛）参照2020版《中国药典》一部中铁皮石斛项下多糖提取方法^［23］.石斛样品前处理：取石斛粉末，加入无水乙醇，索氏提取1 h （去除脂溶性杂质），滤渣60 ℃ 烘干.分段加热回流提取石斛多糖：精密称量前处理过的石斛样品0.35 g于500 mL回流瓶中，量取纯化水200 mL，加热微沸回流2 h.降温后转移至250 mL容量瓶中，用纯化水多次润洗回流瓶，润洗液合并加入到以上容量瓶内，定容至瓶刻度.石斛提取液混合均匀后，用定性滤纸过滤制得石斛提取滤液.分段醇沉水溶法制备石斛多糖：精密移取20 mL石斛提取滤液于200 mL PE尖角离心管中，加入100 mL无水乙醇，混合均匀.离心管置于冰水混合物中2 h，取出离心管置于离心机离心20 min（4 000 r/min），舍弃乙醇溶液，离心管底部沉淀用体积分数为80%乙醇洗涤3次，每次100 mL，乙醇挥干后用纯化水溶解并转移至50 mL容量瓶中定容至瓶刻度，置于冷藏备用.

2.3 紫皮石斛多糖测定条件的优化

2.3.1 蒽酮 - 硫酸法优化测定紫皮石斛多糖的条件

1） 以人工紫皮石斛多糖为样品优化紫皮石斛多糖测定的条件

取“2.2”中人工紫皮石斛多糖溶液15 mL稀释至100 mL作为实验的供试样品.

2） 蒽酮硫酸显色溶液的配制

精准称定0.2 g蒽酮，依据文献［23］配制成质量分数为0.2%的蒽酮溶液（临用现配）.

3） 葡萄糖标准溶液的配制

取干燥至恒重的0.10 g无水葡萄糖，依据文献［24］配制成1.0 × 10^-3 g/mL的葡萄糖标准溶液，使用前稀释10倍，制成1.0 × 10^-4 g/mL的葡萄糖标准溶液.

4） 单因素实验设计

以吸光度值为指标进行考察，蒽酮溶液使用量分别为3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 mL，蒽酮溶液显色温度（T）对应73、78、83、88和93 ℃（云南地处高原，海拔基本在1 500 ~ 2 800 m，水沸点在93 ~ 95 ℃，考虑到方法的适用性最高温度选取93 ℃）、蒽酮溶液显色时间（t）对应2、5、8、11和14 min对人工紫皮石斛多糖吸光度值的影响.

5） 响应面实验设计

基于蒽酮溶液使用量、显色温度、显色时间的单因素实验结果设计响应面，以多糖吸光度值为响应值，优化出人工紫皮石斛多糖测定的最佳显色条件，详见表1.

2.3.2 苯酚 - 硫酸法测定紫皮石斛多糖的条件优化

1） 以人工紫皮石斛多糖为样品优化石斛多糖测定的条件

取“2.2”项下中人工紫皮石斛多糖溶液10 mL稀释至25 mL作为实验的供试样品.

2） 苯酚溶液的配制

精准称定5 g苯酚，依据文献［25］配制成质量分数为5%的苯酚溶液备用.

3） 葡萄糖标准溶液的配制

用“2.3.1”项下 1）中的葡萄糖标准溶液.

4） 单因素实验设计

以吸光度值为指标分别考察，苯酚试剂使用量0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，苯酚试剂显色温度依次对应73、78、83、88和93 ℃，最高温度选取93 ℃ （选取原因同上），苯酚试剂显色时间（14 、17、20、23和 26 min）对人工紫皮石斛多糖吸光度值的影响.

5） 响应面实验设计

基于苯酚试剂使用量、显色温度、显色时间的单因素实验结果，设计响应面，以多糖吸光度值为响应值，优化出紫皮石斛多糖测定的最佳显色条件，详见表1.

2.4 蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定紫皮石斛多糖的方法学考察

2.4.1 蒽酮 - 硫酸法测定紫皮石斛多糖的方法学考察

1） 蒽酮 - 硫酸法葡萄糖标准曲线的制备

分别精密量取D - 葡萄糖标准溶液0.10、 0.20、 0.30、 0.40和0.50 mL置于10 mL具塞量筒中，按照响应面优化最佳条件分别加入蒽酮溶液用量V（a） 4.90 mL混合均匀，再加入硫酸1.0 mL，用纯化水补足8.0 mL，混合均匀后，置于蒽酮显色温度T（a） 89.4 ℃水浴锅中恒温加热，蒽酮显色时间t（a） 10 min，取出具塞量筒放入冷水中降温10 min，在波长为622 nm处测定吸光度值，制作蒽酮 - 硫酸法的葡萄糖标准曲线.

2） 蒽酮 - 硫酸法精密度测试

取“2.3.1”项下 1）中人工紫皮石斛多糖样品溶液1.0 mL，分别置于具塞比色管中，按“2.3.1”项下 5）中条件平行测定5次吸光度，并计算相对标准偏差（RSD）.

3） 蒽酮 - 硫酸法稳定性测试

取“2.3.1”项下 1）中人工紫皮石斛多糖样品溶液1.0 mL，分别置于具塞比色管中，按“2.3.1”项下 5）中试验条件，每5 min测定1次吸光度，考察该测定方法在25 min内的稳定性.

4） 蒽酮 - 硫酸法回收率测试

取0.5 mL“2.3.1”项下 1）中人工紫皮石斛多糖样品溶液5份，每份溶液中分别加入0.04 mg/mL葡萄糖标准溶液0.5 mL，取“2.3.1”项下 1）中人工紫皮石斛多糖样品溶液1.0 mL作为对照品，按照“2.3.1”项下 5）条件下优化最佳条件测定，使用公式（1）计算人工紫皮石斛多糖样品加标回收率.

\mathrm{多糖}\mathrm{加标}\mathrm{回收}\mathrm{率}(\mathrm{蒽酮}-\mathrm{硫酸}\mathrm{法})=\frac{\mathrm{多糖}\mathrm{检测}\mathrm{总值}-\mathrm{样品}\mathrm{多糖}\mathrm{质量}}{\mathrm{加标}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\%.（1）

2.4.2 苯酚 - 硫酸法测定紫皮石斛多糖的方法学考察

1） 苯酚 - 硫酸法葡萄糖标准曲线的制备

分别精密量取D - 葡萄糖标准溶液0.20、 0.40、 0.60、 0.80和1.00 mL置于10 mL具塞量筒中，按照响应面优化最佳条件分别加入质量分数5%苯酚溶液用量V（b） 1.0 mL混合均匀，再加入硫酸5 mL，用纯化水补足8.0 mL.混合均匀后，置于苯酚显色温度T（b） 89.0 ℃恒温水浴锅中水浴加热，苯酚显色时间t（b） 27 min显色，取出具塞量筒放入冷水中降温10 min，在波长488 nm处测定吸光度值，制作苯酚 - 硫酸法的葡萄糖标准曲线.

2） 苯酚 - 硫酸法精密度测试

取“2.3.2”项下 1）中人工紫皮石斛多糖样品溶液1.0 mL，分别置具塞比色管中，按“2.3.1”项下 5）中条件平行测定5次吸光度，并计算RSD.

3） 苯酚 - 硫酸法稳定性测试

取“2.3.2”项下 1）中人工紫皮石斛多糖样品溶液1.0 mL，分别置于具塞比色管中，按“2.3.2”项下 5）中试验条件，每5 min测定1次吸光度，考察该测定方法在25 min内的稳定性.

4） 苯酚 - 硫酸法回收率测试

取0.5 mL“2.3.2”项下 1）中人工紫皮石斛多糖样品溶液5份，每份溶液中分别加入0.04 mg/mL葡萄糖标准溶液0.5 mL，取“2.3.2”项下 1）中人工紫皮石斛多糖样品溶液1.0 mL作为对照品，按照“2.3.1”项下 5）优化最佳条件测定，使用公式（2）计算人工紫皮石斛多糖样品加标回收率.

\mathrm{多糖}\mathrm{加标}\mathrm{回收}\mathrm{率}(\mathrm{苯酚}-\mathrm{硫酸}\mathrm{法})=\frac{\mathrm{多糖}\mathrm{检测}\mathrm{总值}-\mathrm{样品}\mathrm{多糖}\mathrm{质量}}{\mathrm{加标}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（2）

2.5 蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定测定紫皮石斛多糖及质量浓度计算

2.5.1 蒽酮 - 硫酸法测定紫皮石斛多糖

取“2.2”中处理的多糖溶液15 mL，稀释至100 mL备用，取1 mL，按照“2.4.1”项下 1）条件下测定，计算石斛多糖质量浓度.

2.5.2 蒽酮 - 硫酸法石斛多糖质量浓度计算

使用公式（3）计算蒽酮 - 硫酸法石斛多糖质量分数.

\mathrm{石斛}\mathrm{多糖}\mathrm{质量}\mathrm{分数}(\mathrm{蒽酮}\mathrm{法})=\frac{x_{\mathrm{1}}\times n_{\mathrm{1}}\times V_{\mathrm{1}}}{\mathrm{1}\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{6}}\times m_{\mathrm{1}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（3）

式中，x₁为蒽酮 - 硫酸法测定石斛样品的多糖质量浓度，单位为μg/mL；V₁为蒽酮 - 硫酸法测定石斛样品的体积，单位为mL；y₁为蒽酮 - 硫酸法测定石斛样品的吸光度值；n₁ 为石斛样品稀释倍数；m₁ 为石斛样品质量，单位为g.

2.5.3 苯酚 - 硫酸法测定紫皮石斛多糖

取“2.2”中处理的多糖溶液10 mL稀释至25 mL备用，取1 mL，按照“2.4.1”项下 1）条件下测定，计算石斛多糖质量浓度.

2.5.4 苯酚 - 硫酸法石斛多糖质量浓度计算

使用公式（4）计算苯酚 - 硫酸法石斛多糖质量分数.

\mathrm{石斛}\mathrm{多糖}\mathrm{质量}\mathrm{分数}(\mathrm{苯酚}\mathrm{法})=\frac{x_{\mathrm{2}}\times n_{\mathrm{2}}\times V_{\mathrm{2}}}{\mathrm{1}\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{6}}\times m_{\mathrm{2}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（4）

式中，x₂为苯酚 - 硫酸法测定石斛样品的多糖质量浓度，单位为μg/mL；V₂为苯酚硫酸法测定石斛样品的体积，单位为mL；y₂为苯酚 - 硫酸法测定石斛样品的吸光度值；n₂ 为石斛样品稀释倍数；m₂ 为石斛样品质量，单位为g.

2.6 蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定Sevag试剂对铁皮石斛和紫皮石斛多糖脱蛋白前后的石斛多糖质量浓度

将铁皮石斛和紫皮石斛按照“2.2”进行样品处理，蒽酮 - 硫酸法按照“2.3.1”项下 1）进行样品稀释，苯酚 - 硫酸法按照“2.3.2”项下 1）进行样品稀释.分别按照“2.4.1”项下 2）和“2.4.2”项下 2）中的实验方法平行测定吸光度值3次，按照蒽酮 - 硫酸法葡萄糖准曲线方程和苯酚 - 硫酸法葡萄糖标准曲线计算石斛多糖样品中多糖的质量浓度并计算RSD.

将铁皮石斛和紫皮石斛按照“2.2”进行样品处理后，分别取出多糖样品25 mL，取Sevag试剂75 mL加入到溶液中，混合均匀后离心，脱蛋白处理进行3次，定容至25 mL.按照“2.5”中的方法进行实验，计算出各样品脱蛋白后的多糖质量浓度.比较Sevag试剂脱蛋白对仿野生紫皮石斛、人工紫皮石斛、仿野生铁皮石斛、人工铁皮石斛多糖质量浓度测定的影响.

3 结果与分析

3.1 蒽酮/苯酚 - 硫酸法方法学考察结果

3.1.1 蒽酮/苯酚 - 硫酸法葡萄糖标准曲线

在响应面优化得到最佳实验条件下，以吸光度值为参数，测定不同质量浓度的葡萄糖标准品溶液，制作蒽酮 - 硫酸法与苯酚 - 硫酸法葡萄糖标准曲线.蒽酮 - 硫酸法制作葡萄糖标准曲线方程为y_{\mathrm{1}}=\mathrm{0.017}\mathrm{29}{x}_{\mathrm{1}}+\mathrm{0.000}\mathrm{5}（R₁² = 0.999 9），葡萄糖质量浓度（10～50 μg/mL）与吸光度值线性关系良好（图1a）.苯酚 - 硫酸法制作葡萄糖标准曲线方程为y_{\mathrm{2}}=\mathrm{0.007}\mathrm{17}{x}_{\mathrm{2}}-\mathrm{0.000}\mathrm{8} （R{}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{2}} = 0.999 6），葡萄糖质量浓度（20～100 μg/mL）与吸光度值线性关系良好（图1b）.在有效的葡萄糖浓度范围内，线性方程均可用于石斛多糖的质量浓度测定.

3.1.2 蒽酮/苯酚 - 硫酸法精密度测试

蒽酮/苯酚 - 硫酸法分别进行5次精密度测试，对应的RSD分别为0.64%和0.42%（表2），实验表明蒽酮 - 硫酸法和苯酚 - 硫酸法在最佳优化实验条件下测定人工紫皮石斛多糖质量浓度的重现性良好.

3.1.3 蒽酮/苯酚 - 硫酸法稳定性测试

蒽酮/苯酚 - 硫酸法分别进行5次稳定性测试，结果如表3.RSD分别为0.05%和0.03%，实验表明蒽酮 - 硫酸法与苯酚 - 硫酸法在该优化实验条件下测定人工紫皮石斛多糖质量浓度的稳定性良好.

3.1.4 蒽酮/苯酚 - 硫酸法回收率测试

蒽酮/苯酚 - 硫酸法分别进行加样回收率测试，结果如表4.加葡萄糖标准品回收率分别为99.42%和99.82%，RSD分别为2.15%和0.99%，实验表明蒽酮/苯酚 - 硫酸法在该优化实验条件下测定人工紫皮石斛多糖质量浓度回收率和稳定性良好.

3.2 蒽酮 - 硫酸法测定人工紫皮石斛粗多糖的单因素实验结果

3.2.1 蒽酮溶液用量对多糖吸光度的影响

如图2a所示，蒽酮溶液体积为2.0～5.0 mL范围内，吸光度值随着蒽酮溶液体积的增加呈增长趋势，蒽酮溶液体积为5.0 mL时，吸光度值最大.蒽酮溶液体积为5.0～6.0 mL范围内，吸光度值随着蒽酮溶液体积的增加呈减少趋势.石斛多糖脱水与蒽酮溶液反应生成糠醛或其衍生物，在波长622 nm处有强吸收峰，开始石斛多糖过剩且蒽酮溶液不足，石斛多糖未能完全反应.随着蒽酮溶液体积的增加，石斛多糖与蒽酮溶液反应生成更多的糠醛或其衍生物，吸光度值呈增长趋势.当全部石斛多糖与蒽酮溶液反应时，生产的糠醛或其衍生物不再增加，吸光度值达到最大.继续增加蒽酮溶液用量，未参加反应的蒽酮溶液与生成的糠醛或其衍生物形成混合干扰，导致吸光度值呈下降趋势.说明试验中蒽酮溶液用量为5.0 mL时，蒽酮与脱水的石斛多糖生成的糠醛或其衍生物反应完全.因此蒽酮溶液用量确定为5.0 mL.

3.2.2 蒽酮溶液显色温度对多糖吸光度的影响

如图2b所示，吸光度值随显色温度的升高增大，显色温度高于88 ℃，曲线呈缓慢上升趋势.因为石斛多糖脱水与蒽酮溶液发生反应生成糠醛或其衍生物，在反应过程中反应的速度受温度的影响较为明显，温度越高反应越激烈，且反应越彻底.88 ℃后，温度对反应激烈程度的影响较小，因此反应温度确定为88 ℃.

3.2.3 蒽酮溶液显色时间对多糖吸光度的影响

如图2c所示，吸光度值随显色时间增加呈先增高后下降的趋势，在显色时间为11 min 时，吸光度值最大.因石斛多糖脱水与蒽酮生成糠醛或其衍生物，故在该反应中随着反应时间增加，生成的糠醛或其衍生物生产越多，吸光度值越大.反应时间增加到一定程度时，石斛多糖已经全部与蒽酮生成糠醛或其衍生物达到了平衡转态，此时吸光度值不再增加.若持续延长反应时间，生成物会在高温硫酸作用下被降解，因此反应时间确定为11 min.

3.3 苯酚 - 硫酸法测定人工紫皮石斛粗多糖的单因素实验结果

3.3.1 苯酚溶液用量对多糖吸光度的影响

如图3a所示，苯酚溶液为0.6～1.0 mL时，吸光度值随着苯酚溶液体积的增加呈增长趋势，在苯酚溶液为1.0 mL时吸光度值最大；在苯酚溶液为1.0～1.4 mL时，吸光度值随着苯酚溶液体积的增加呈减少趋势.石斛多糖在浓硫酸的作用下会水解成单糖，单糖与苯酚生成糠醛衍生物呈橙黄色.在波长为488 nm处有强吸收峰，刚开始石斛多糖过剩且苯酚溶液不足，石斛多糖未能完全反应.随着苯酚溶液体积的增加，石斛多糖与苯酚溶液发生反应生成更多的糠醛衍生物，吸光度值呈增长趋势.当石斛多糖全部与苯酚溶液反应时，生成的糠醛衍生物不再增加或达到动态平衡时，吸光度值达到最大.此时继续增加苯酚溶液用量，会导致未参加反应的苯酚溶液与生成的糠醛衍生物络合，进而干扰导致吸光度值呈缓慢增长趋势.经实验，苯酚溶液用量为1.0 mL时，多糖与苯酚反应完全或达到最大动态平衡，故苯酚溶液用量确定为1.0 mL.

3.3.2 苯酚溶液显色温度对多糖吸光度的影响

如图3b所示，吸光度值随显色温度的升高缓慢增大，当显色温度达到88 ℃后趋于平缓.石斛多糖脱水与蒽酮溶液发生反应生成糠醛衍生物，在反应过程中，反应的速度受温度的影响较小，温度越高反应越激烈，反应物转化也越彻底.但88 ℃后，温度对反应激烈程度影响效果不明显，故反应温度确定为88 ℃.

3.3.3 苯酚溶液显色时间对吸光度的影响

如图3c所示，吸光度值随反应时间增长呈增长趋势，当显色时间为25 min 时吸光度最大，当显色时间大于25 min时，吸光度值随反应时间增加而呈较小趋势.在硫酸作用下，石斛多糖脱水水解成单糖，与苯酚反应生成糠醛衍生物.反应随着时间增加，生成的糠醛衍生物越多，吸光度值越大，石斛多糖与苯酚溶液生成糠醛衍生物反应完全或达到动态平衡.增加反应时间，苯酚与糠醛衍生物发生络合反应，导致吸光度值缓慢减小，因此反应时间确定为25 min.

3.4 蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖质量浓度响应面实验设计及结果

3.4.1 蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖质量浓度回归模型的建立与显著性分析

蒽酮 - 硫酸法测定石斛多糖以吸光度值E（a）为响应值，蒽酮溶液用量V（a）、蒽酮显色温度T（a）、蒽酮显色时间t（a）为响应面设计因素；苯酚 - 硫酸法测定石斛多糖以吸光度值E（b）为响应值，苯酚溶液用量V（b）、苯酚显色温度T（b）、苯酚显色时间t（b）为响应面设计因素.蒽酮/苯酚 - 硫酸法响应面实验设计见表1，结果见表5.经实验后确定拟合回归方程（5）和（6）.

E（a） = 0.67 - 0.018 × V（a） + 0.014 × T（a） - 0.053 × t（a） + 0.014 × 10^-3 × V（a）T（a） + 9.13 × 10^-3 × V（a）t（a） - 6.98 × 10^-3 × T（a） t（a） - 0.081 × V（a）² - 0.027 × T（a）² - 0.1 × t（a）².（5）

E（b） = 0.70 - 0.019 × V（b） + 4.137 × 10^-3 × T（b） + 0.017 × t（b） - 8.050 × 10^-3 × V（b）T（b） + 8.975 × 10^-3 × V（b）t（b） + 8.775 × 10^-3 × T（b）t（b） - 0.11 × V（b）² - 0.022 × T（b）² - 0.028 × t（b）² .（6）

蒽酮 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖模型的F检验及方差分析，结果详见表6.该模型具有较低的P值（P < 0.000 1 < 0.001）和较高的F值（578.7），说明该响应面模型具有高度显著水平；失拟项值P = 0.598 8 > 0.05，说明该响应面回归模型理论值与实验数值差异不显著，该响应面模型稳定性好；实验相关系数R² = 0.999 0 > 0.95，说明该响应面模型拟合度好，能比较好的反应实验真实的情况，调整后的决定系数R_adj ² = 0. 999 73 > 0.80，变异系数CV = 0.72%，说明该响应面模型只有0.72%的变异不能解释.进一步说明模型拟合度好，表明该响应面模型拟合方程对人工紫皮石斛多糖质量浓度的测定和分析是可靠的.回归拟合方程显著性分析结果可知：交互项T（a）t（a）对吸光度值影响显著；交互项V（a）T（a）、V（a）t（a）对吸光度值影响高度显著；一次项V（a）、T（a）、t（a）和二次项V（a）²、T（a）²、t（a）²对吸光度值影响为极显著.由表中F值与P值可知，各影响因素对吸光度值E的影响程度依次是t（a）>V（a）>T（a）.

苯酚 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖模型的F检验及方差分析结果详见表7.该模型具有较低的P值（P<0.001）和较高的F值（250.59），说明该响应面模型具有高度显著水平；失拟项值P为0.2094 > 0.05，说明该响应面回归模型理论值与实验数值差异不显著，模型稳定性好.相关系数R² = 0. 9978 > 0. 95，说明该响应面模型拟合度良好，能很好的反应实验真实的情况；调整后的决定系数R_adj ² = 0. 9938 < 0.80，变异系数CV = 0.80%，说明该响应面模型只有0.80%的变异不能解释.进一步说明模型拟合度好，表明该响应面模型拟合方程对人工紫皮石斛多糖质量浓度的测定和分析是可靠的.回归拟合方程显著性分析结果可知，一次项T（b）显色温度对吸光度影响不显著；交互项V（b）T（b）、V（b）t（b）、T（b）t（b）对吸光度影响显著；一次项V（b）苯酚溶液用量、t（b）显色时间，二次项V（b）²、T（b）²、t（b）²对吸光度影响为极显著.由表中F值与P值可知，各影响因素对吸光度值E的影响程度依次是苯酚溶液用量V（b） > 显色时间t（b） > 显色温度T（b）.

3.4.2 蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖中吸光度值显色条件的响应面优化与分析

把蒽酮 - 硫酸法中的实验数据通过二次多元回归拟合方式，制作蒽酮 - 硫酸法影响测定人工紫皮石斛多糖中对吸光度值因素的三维响应面图和二维等高线图，可以看出蒽酮 - 硫酸法影响吸光度值的因素中，两两因素对吸光度值交互作用的影响.响应面优化与分析结果如图4所示，蒽酮 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖的过程中，显色条件的交互作用，包括显色温度与蒽酮溶液用量、显色时间与蒽酮溶液用量，以及显色时间与显色温度，均达到显著水平.

为考察各因素对苯酚 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖吸光度值的影响，基于实验数据建立了二次多元回归模型，并据此绘制了三维响应面图与二维等高线图.可以看出在苯酚 - 硫酸法影响吸光度值的因素中，两两因素对吸光度值交互作用的影响.响应面优化与分析结果如图5所示，在苯酚 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖中吸光度值显色条件的交互作用显色温度与显色试剂苯酚溶液用量、显色时间与显色溶液苯酚溶液用量、显色时间与显色温度均显著.

3.4.3 蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖质量浓度中吸光度模型优化及验证

运用回归模型拟合的方法，得出蒽酮 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖中吸光度值的最佳显色实验条件： 蒽酮溶液用量4.90 mL，蒽酮显色温度89.35 ℃，蒽酮显色时间10.17 min.在该实验条件下，吸光度值E为0.681 1，蒽酮 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖质量浓度条件的可操作性和可靠性，将影响人工紫皮石斛多糖质量浓度测定中吸光度值的最佳实验条件进行修正，即蒽酮溶液用量4.90 mL、蒽酮显色温度89.4 ℃、蒽酮显色时间10 min.对吸光度值平行测定3次，平均值为0.683 0，RSD为1.25% < 3%，测定结果与理论值具有一致性.

运用回归模型拟合的方法，得出苯酚 - 硫酸法测定人工紫皮石斛多糖中吸光度值的最佳显色实验条件：苯酚溶液用量0.98 mL，苯酚显色温度88.84 ℃，苯酚显色时间26.55 min.在该实验条件下，吸光度值E为0.699 9，通过评估蒽酮 - 硫酸法的可操作性与可靠性，对人工紫皮石斛多糖质量浓度测定的最优条件进行了修正，即苯酚试剂用量1.0 mL、苯酚显色温度89.0 ℃、苯酚显色时间27 min.对吸光度值平行测定3次，平均值为0.718，RSD = 0.25% < 3%，测定结果与理论值具有一致性.

3.5 紫皮石斛多糖质量浓度的测定结果

在优化最佳实验的条件下对石斛样品多糖提取液进行测定.其中，蒽酮 - 硫酸法中蒽酮溶液用量为4.9 mL，蒽酮显色温度为89.3 ℃，蒽酮显色时间为10 min；苯酚 - 硫酸法中苯酚溶液用量为1.0 mL，苯酚显色温度为89.0 ℃，苯酚显色时间为27 min.基于以上条件分别对吸光度值平行测定3次，根据蒽酮 - 硫酸法和苯酚 - 硫酸法葡萄糖标准曲计算各石斛样品中多糖质量浓度.如图6所示，同一种石斛样品采用2种检测方法测定多糖质量浓度时，蒽酮 - 硫酸法测定结果高于苯酚 - 硫酸法；在Sevag试剂脱蛋白后，同一种石斛样品采用2种检测方法测定多糖质量浓度时，蒽酮 - 硫酸法测定结果高于苯酚 - 硫酸法，但是与同种测定方法的脱蛋白前多糖质量浓度比较均有所下降.蒽酮 - 硫酸法测定的是所有的碳水化合物，是石斛中全部水溶性碳水化合物总和，而苯酚 - 硫酸法则测定的是多聚糖、戊糖和甲基化糖，并且该方法的测定结果不易受样品中蛋白质的干扰.所以，同一种石斛样品采用2种测定方法检测石斛多糖时，蒽酮 - 硫酸法高于苯酚 - 硫酸法.

4 结语

蒽酮/苯酚 - 硫酸法测定紫皮石斛多糖，通过条件优化、方法学考量其精密度、稳定性和回收率响应效果均比较好，且方法简单易于操作，从原理上均可作为紫皮石斛多糖测定的方法.使用2种方法测定同种石斛或不同种植方式的石斛时，石斛多糖浓度均存在明显差异.使用Sevag试剂脱蛋白后的石斛多糖质量浓度均低于未脱蛋白的.可能是因为蒽酮 - 硫酸法测定石斛中全部水溶性碳水化合物总和，苯酚 - 硫酸法则测定的是多聚糖、戊糖和甲基化糖总和.后续将对同种石斛不同产地的石斛及不同种石斛进行研究分析，通过大量的试验研究以得出更加准确结论.

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