淫羊藿素通过抑制TGF - β/Smad2信号通路发挥抗肝纤维化作用机制研究

Study on the mechanisms underlying the anti-fibrogenic effects of icaritin in the liver by inhibiting TGF-β/Smad2 signaling pathway

摘要

为研究淫羊藿素对TGF - β₁诱导活化人/大鼠肝星状细胞（HSC - LX - 2/ HSC - T6）的影响及相关作用机制，通过体外培养HSC - LX - 2和HSC - T6细胞，分为溶剂对照组、单给淫羊藿素组、TGF - β₁诱导组、TGF - β₁ + 淫羊藿素（低、中、高）浓度组.蛋白免疫印迹法检测TβRⅠ/Ⅱ、p - Smad2/t - Smad2、α - SMA、fibronectin、collagen Ⅰ蛋白表达水平；细胞免疫荧光染色法检测HSC - LX - 2和HSC - T6细胞p - Smad2在细胞内分布情况.结果表明，淫羊藿素不同浓度能显著抑制TGF - β₁活化肝星状细胞中TβRI、p - Smad2、α - SMA、fibronectin和collagen Ⅰ 的蛋白表达，且呈浓度依赖关系；细胞免疫荧光结果显示，淫羊藿素处理能明显抑制TGF - β₁诱导的p - Smad2入核.淫羊藿素抑制了TGF - β₁诱导的肝星状细胞活化及细胞外基质成分的合成，从而发挥体外抗肝纤维化作用，该作用可能与其抑制TGF - β/Smad2通路有关.

Abstract

To investigate the effects of icaritin on TGF - β₁ - induced activation of human/rat hepatic stellate cells （HSC - LX - 2/HSC - T6） and the related mechanisms， HSC - LX - 2 and HSC - T6 cells were cultured in vitro and divided into the solvent control group， icaritin - alone group， TGF - β₁ - induced group， and TGF - β₁ plus icaritin groups at low， medium， and high concentrations. The protein expression levels of TβRI/II， p - Smad2， t - Smad2， α - SMA， fibronectin， and collagen I were detected by Western blot. The intracellular distribution of p - Smad2 in HSC - LX - 2 and HSC - T6 cells was detected by immunofluorescence staining. The results showed that icaritin， at different concentrations， could significantly inhibit the protein expression of TβRI， p - Smad2， α - SMA， fibronectin， and collagen I in TGF - β₁ - activated hepatic stellate cells in a concentration - dependent manner. Immunofluorescence results showed that icaritin treatment significantly inhibited the TGF - β₁ - induced nuclear translocation of p - Smad2. Icaritin could prevent the activation of hepatic stellate cells and the synthesis of extracellular matrix components induced by TGF - β₁， thereby exerting an anti - hepatic fibrosis effect in vitro， which may be associated with the inhibition of the TGF - β/Smad2 pathway.

Graphical abstract

关键词

淫羊藿素 / TGF - β₁ / 肝纤维化 / 肝星状细胞 / Smad2

Key words

icaritin / TGF - β₁ / hepatic fibrosis / hepatic stellate cells / Smad2

肝纤维化是各种慢性肝病，如酒精、病毒性肝炎、药物、毒素、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性疾病等引起的慢性肝损伤状态，如果不及时治疗会演变为肝硬化甚至肝癌^［1］.肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是参与肝纤维化过程最重要的细胞，其活化、增殖是肝纤维化形成与发展的重要因素^［2］.在正常肝脏中，HSCs保持静止，并储存维生素A和脂滴；然而，在一些生长因子，如转化生长因子β1（transforming growth factor - β₁，TGF - β₁）刺激下，HSCs活化并表达α - 平滑肌肌动蛋白（alpha - smooth muscle actin， α - SMA）蛋白^［3］.激活的HSCs可合成大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分，如Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ）、纤维连接蛋白（fibronectin）等^［4］.因此，HSCs的激活在肝纤维化的发展过程中起着关键作用.抑制HSCs的激活，促进受损肝脏中活化的HSCs的清除，可能是治疗肝纤维化的有效策略.

TGF - β₁是一种促纤维化细胞因子，它参与了多种器官纤维化的发生.在TGF - β/Smad诱导肝纤维化的信号传导过程中，活化的TGF - β₁首先与Ⅱ型TGF - β受体（TβRⅡ）结合，后者招募并激活Ⅰ型TGF - β受体（TβRI），导致Smad2和Smad3磷酸化.随后，磷酸化的Smad2/3与Smad4形成寡聚复合物并转移到细胞核中，与靶基因启动子序列结合，进而启动下游α - SMA和细胞外基质成分等靶基因的转录，导致肝纤维化的发生^［5］.

淫羊藿（epimedium brevicornu）为小檗科淫羊藿属植物，最早记载见于《神农本草经》，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功效，用于肾阳虚衰，阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛.淫羊藿素（icaritin，ICT）是一种从淫羊藿中提取的异戊烯基黄酮类化合物，可由淫羊藿苷（icariin）水解而成^［6］.现代临床医学研究^［7-8］发现，淫羊藿素具有抗骨质疏松、抗炎、抗肿瘤、心血管保护和神经保护等作用.最近有研究^［9-10］发现，淫羊藿素在较高剂量下可激活TGF - β/Smad2非依赖的通路诱导HSCs凋亡.然而，淫羊藿素是否可能在相对低浓度处理条件下，抑制活化的HSCs内TGF - β/Smad2通路，从而发挥其抗肝纤维化作用，目前尚未见报道.因此，本文拟在体外加入TGF - β₁，建立HSCs活化模型，进而探讨淫羊藿素是否具有阻断活化HSCs内TGF - β/SMAD2信号通路作用，为将淫羊藿素应用于肝纤维化临床治疗提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞

人肝星状细胞（HSC - LX - 2）购自中国典型培养物保藏中心，大鼠肝星状细胞（HSC - T6）和人正常肝细胞（L - 02）购自中国科学院上海细胞库.

1.1.2 主要试剂

淫羊藿素购于中国德斯特生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）购于四季青公司；TGF - β₁购于proteintech公司；抗TβRI抗体购于abcam公司；抗p - Smad2和t - Smad2抗体购于美国Cell signaling Technology公司；抗fibronectin和collogen Ⅰ抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；抗β - actin抗体购于Origene公司；质量分数为4%多聚甲醛组织细胞固定液购于Solarbio 公司；Triton - 100购于Diamond 公司；Cy3标记羊抗兔IgG购于博奥森公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和抗TβRⅡ抗体购于proteintech公司；CCK8试剂盒购于MCE公司；抗α - SMA抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、RIPA 裂解缓冲液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；RPMI和DMEM高糖培养基购于美国Gibco公司；超敏ECL化学发光底物购于正能生物技术有限公司.

1.1.3 主要仪器

倒置显微镜购自Leica公司；激光共聚焦显微镜购自OLYMPUS公司；电泳仪购自Bio - Rad公司；CO₂培养箱购自Thermo公司；超净工作台购自Esco公司；C600凝胶成像系统购自Azure公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HSC - LX - 2用含体积分数10% FBS的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、体积分数5%的CO₂条件下培养，每隔2 d换液1次.当细胞密度达到80%后进行传代或冻存.

HSC - T6和L - 02细胞用含体积分数10% FBS的RPMI培养基，置于37 ℃、体积分数5%的CO₂条件下培养，每隔2 d换液1次.当细胞密度达到80%后进行传代或冻存.

1.2.2 细胞分组及加药

体外培养HSC - LX - 2和HSC - T6，将细胞分为溶剂对照组、单给淫羊藿素（1 μmol/L）组、TGF - β₁诱导组、TGF - β₁ + 淫羊藿素低、中、高浓度（0.25、0.5、1 μmol/L）组.当细胞密度达到80 %左右时，PBS漂洗细胞一次，用质量分数为0.25 %的胰酶消化1 min，按4×10⁸个/L密度将细胞接种于6孔板中.待细胞贴壁24 h后，用无血清的培养基同步化细胞12 h，随后用含体积分数1 % FBS的培养基进行加药处理，TGF - β₁诱导组和诱导加药组加入终质量分数为10 ng/mL的TGF - β₁；溶剂对照组和模型组加入相应体积的二甲基亚砜溶剂（DMSO，体积分数为0.1%），加药组加入相应浓度的淫羊藿素，继续培养24 或48 h后，提取细胞总蛋白进行蛋白免疫印迹实验.

1.2.3 CCK - 8法测淫羊藿素对肝星状细胞以及正常肝细胞活力影响

将对数生长期的HSC - LX - 2、HSC - T6和L - 02细胞按照1 × 10⁴/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h待细胞贴壁后，将96孔细胞分为DMSO（体积分数为0.1%）组和淫羊藿素不同浓度组（0.125～16 μmol/L），每孔设6个复孔.培养箱继续培养48 h后，每孔加入10 μL CCK - 8溶液，在培养箱中孵育3 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度.

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测活化的肝星状细胞纤维化相关蛋白的表达

按照“1.2.2”项中的方法将细胞进行分组加药，在体积分数5%的CO₂培养箱孵育24 或48 h后，用PBS洗1次，提取细胞总蛋白，蛋白免疫印迹法检测淫羊藿素处理24 h后TβRI、TβRⅡ、p - Smad2和t - Smad2蛋白表达水平；在淫羊藿素处理48 h后，蛋白免疫印迹法检测HSCs激活标志物α - SMA，以及细胞外基质成分fibronectin和collagen Ⅰ蛋白表达水平.

1.2.5 细胞免疫荧光染色法检测p - Smad2的入核情况

如“1.2.2”的细胞处理方法，将细胞分别加入淫羊藿素（1 μmol/L）和/或TGF - β₁（10 ng/mL）处理24 h后，PBS洗涤细胞3次，用质量分数4 %的多聚甲醛室温固定20min，PBS洗涤3次，质量分数0.3%的Triton X - 100室温通透15 min，PBS洗涤3次，山羊血清封闭60 min，抗p - Samd2抗体（1∶50比例稀释）4 ℃孵育过夜.次日，PBS 洗涤细胞3次，荧光二抗（Goat Anti - rabbit IgG/Cy3，1∶50比例稀释）37 ℃ 孵育1 h，细胞核染料DAPI（5 mg/L）染细胞核5 min，用PBS洗涤5 次，甘油封片，最后在激光共聚焦显微镜下观察并拍照.

1.2.6 统计学方法

采用GraphPad Prism统计分析软件，数据以均值±标准差（x ± s）表示，采用单因素方差分析比较各组间差异，当差异显著时（P < 0.05），组间两两比较采用Tukey法；当P < 0.05，认为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 淫羊藿素对肝星状细胞以及正常肝细胞活力的影响

淫羊藿素不同浓度（0.125 ~ 16 μmol/L）处理HSC - LX - 2、HSC - T6以及L - 02细胞48 h后，与溶剂对照组比较，当淫羊藿素处理浓度高于2 μmol/L时，可见HSC - LX - 2和HSC - T6细胞活力随给药浓度的升高而逐渐下降，而该浓度对L - 02细胞的细胞活力无显著影响.因此选择对HSCs以及正常肝细胞无明显细胞毒作用的0.25、0.5、1 μmol/L浓度，考察淫羊藿素对HSC - LX - 2和HSC - T6 TGF - β/Smad2通路的影响.淫羊藿素对HSC - LX - 2和HSC - T6以及L - 02细胞的活力影响如图1所示.

2.2 淫羊藿素对活化的肝星状细胞激活及细胞外基质表达的影响

与溶剂对照组比较，TGF - β₁可诱导HSC - LX - 2和HSC - T6中α - SMA、collagen Ⅰ和fibronectin蛋白表达水平上调；与TGF - β₁刺激组比较，淫羊藿素各不同浓度处理48 h后，对TGF - β₁刺激的α - SMA、collagen Ⅰ和fibronectin蛋白表达水平，均有明显的抑制作用，并且呈现一定的浓度依赖性.单加淫羊藿素（1 μmol/L）处理后，HSC - LX - 2和HSC - T6表达α - SMA、collagen Ⅰ和fibronectin蛋白表达水平，与溶剂对照组比较，无明显差异.如图2所示.

2.3 淫羊藿素对活化的肝星状细胞TGF - β/Smad2信号传导通路相关蛋白表达水平的影响

与溶剂对照组相比，TGF - β₁刺激后的HSC - LX - 2和HSC - T6 TβRI/II以及p - Smad2表达水平明显增高；与TGF - β₁刺激组比较，淫羊藿素不同浓度处理后，细胞TβRI和p - Smad2蛋白表达受到明显抑制；而TβRII和t - Smad2的蛋白表达水平，与TGF - β₁刺激组比较，无显著差异；与溶剂对照组相比，单加淫羊藿素（1 μmol/L）处理后，HSC - LX - 2和HSC - T6内TβRI/Ⅱ、p - Smad2和t - Smad2蛋白表达水平，无显著差异.如图3所示.

2.4 淫羊藿素对活化肝星状细胞p - Smad2细胞内分布的影响

TGF - β₁诱导HSC - LX - 2和HSC - T6 24 h后，可见p - Smad2红色荧光在核内聚集；而淫羊藿素（1 μmol/L）处理24 h后，可明显抑制TGF - β₁诱导的p - Smad2入核，此时，p - Smad2荧光信号大部分均匀分布于胞浆.蓝色荧光为DAPI染色的HSCs胞核，红色荧光为Cy3染色标记的p - Smad2.如图4所示.

3 讨论

肝纤维化是由多种慢性肝病引起的病理状态，如果不及时治疗可能会发展为肝硬化甚至肝癌^［1］.慢性肝损伤的终止导致肝纤维化的消退，伴随着富含细胞因子的炎症组织微环境的缓解，以及活化的HSCs减少或丧失.活化的HSCs的减少可能有3种机制：凋亡、衰老和逆转^［11］.无论肝纤维化的发生原因是什么，灭活或减少HSCs激活可能是一种抗肝纤维化策略.

淫羊藿素作为传统中药淫羊藿中分离得来的天然产物，在2022年被中国食品药品监督管理局批准用于晚期肝细胞癌的治疗.目前，关于淫羊藿素治疗骨质疏松症的1期临床试验也正在进行中^［12］.Wu等^［13］发现，淫羊藿素通过其拟雌激素类特性，激活雌激素受体及其下游ERK1/2和p38信号通路，诱导MC3T3 - E1亚克隆14细胞分化；Liu等^［14］研究发现，淫羊藿苷通过雌激素样抗氧化作用，不仅可以缓解四氯化碳诱导的急性肝损伤，同时，还可减轻了多西他赛诱导的皮肤损伤.

在器官纤维化的防治方面，Hua等^［15］研究发现，淫羊藿素可以通过激活PPARγ，发挥抗肺纤维化作用.此外，Li等^［10］研究发现，淫羊藿素在较高剂量下，通过线粒体介导的凋亡信号途径，诱导活化的HSCs发生凋亡，并改善大鼠肝纤维化的发展进程.钱海华等^［16］也发现，淫羊藿素可以通过抗氧化损伤作用，延缓CCl₄诱导的大鼠肝纤维化向肝硬化发展的进程.刘进锴等^［9］发现，淫羊藿素可通过抑制MAPK通路的磷酸化，抑制HSC - T6的增殖与活化，从而起到治疗肝纤维化的作用.

本文研究发现淫羊藿素对正常肝细胞低毒剂量下，可以抑制TGF - β₁诱导的HSCs激活标志物α - SMA蛋白，以及collagen I和fibronectin等细胞外基质成分的表达，提示淫羊藿素在较低剂量下具有良好抑制HSCs活化的作用.Smad依赖通路被认为是TGF - β₁介导HSCs活化最重要的通路之一.进一步研究结果提示，淫羊藿素处理，可抑制Smad2的磷酸化和核易位，这部分作用可能是淫羊藿素通过抑制HSCs表达TβRI蛋白而实现.TGF - β₁通过结合TβRI，还可激活下游多条Smad非依赖的促纤维化信号通路，如MAPK和Notch信号通路等^［9，17］.钱海华等^［16］研究发现，淫羊藿素通过抗氧化损伤作用，延缓CCl₄诱导的大鼠肝纤维化发展进程.现有研究已证实，肝星状细胞中发生氧化应激，与肝纤维化的发生密切相关^［18］.因此，淫羊藿素是否可以通过抗氧化应激通路，特异性抑制Smad依赖和/或非依赖的肝星状细胞激活途径，实现其抗肝纤维化作用，值得下一步深入研究.

4 结语

淫羊藿素通过抑制TβRI表达，进而抑制Smad2磷酸化激活，从而阻抑了TGF - β₁诱导的HSCs活化和细胞外基质成分的合成，实现其体外抗肝纤维化作用，上述研究结果将为将淫羊藿素发展为抗肝纤维化治疗药物提供实验依据.

参考文献

[1] KOYAMA Y， BRENNER D A. New therapies for hepatic fibrosis［J］. Clin Res Hepatol Gastroenterol， 2015， 39（1）：S75 - S79.

[2] TSUCHIDA T， FRIEDMAN S L. Mechanisms of hepatic stellate cell activation［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2017，14（7）： 397 - 411.

[3] PUCHE J E， SAIMAN Y， FRIEDMAN S L， et al. Hepatic stellate cells and liver fibrosis［J］. Compr Physiol，2013，3（4）：1473 - 1492.

[4] BLANER W S， O'BYRNE S M， WONGSIRIROJ N， et al. Hepatic stellate cell lipid droplets： a specialized lipid droplet for retinoid storage［J］. Biochim Biophys Acta，2009，1791（6）：467 - 473.

[5] NAKAO A， AFRAKHTE M， MOREN A， et al. Identification of Smad7， a TGFbeta - inducible antagonist of TGF - beta signalling［J］. Nature， 1997，389（6651）：631 - 635.

[6] 赖丽娟，谢佳丽，黄志华，等.淫羊藿素的抗肿瘤作用及机制研究进展［J］.中药药理与临床，2016，32（6）：235 - 238.

[7] LIM R， LI L， CHEW N， et al. The prenylflavonoid Icaritin enhances osteoblast proliferation and function by signal transducer and activator of transcription factor 3 （STAT - 3） regulation of C - X - C chemokine receptor type 4 （CXCR4） expression［J］. Bone，2017，105： 122 - 133.

[8] BAILLY C. Molecular and cellular basis of the anticancer activity of the prenylated flavonoid icaritin in hepatocellular carcinoma［J］. Chem Biol Interact，2020，325：109124.

[9] 刘进锴，阙任烨，龙建云，等.淫羊藿素对大鼠肝星状细胞HSC - T6的抑制作用［J］.肝胆胰外科杂志，2014，26（4）：317 - 322.

[10] LI J， LIU P， ZHANG R， et al. Icaritin induces cell death in activated hepatic stellate cells through mitochondrial activated apoptosis and ameliorates the development of liver fibrosis in rats［J］. J Ethnopharmacol，2011，137（1）：714 - 723.

[11] MARCELLIN P， GANE E， BUTI M， et al. Regression of cirrhosis during treatment with tenofovir disoproxil fumarate for chronic hepatitis B： a 5 - year open - label follow - up study［J］. Lancet，2013，381（9865）：468 - 475.

[12] GAO L， ZHANG S Q. Antiosteoporosis effects pharmacokinetics and drug delivery systems of icaritin： advances and prospects［J］. Pharmaceuticals （Basel），2022，15（4）：397.

[13] WU Z， OU L， WANG C， et al. Icaritin induces MC3T3 - E1 subclone14 cell differentiation through estrogen receptor - mediated ERK1/2 and p38 signaling activation［J］. Biomed Pharmacother，2017，94：1 - 9.

[14] ZOU J， XU MX， LI F， et al. Icaritin alleviates docetaxel - induced skin injury by suppressing reactive oxygen species via estrogen receptors［J］. Thorac Cancer，2022，13（2）：190 - 201.

[15] HUA Q， HUANG X， XIE W， et al. PPARγ mediates the anti - pulmonary fibrosis effect of icaritin［J］. Toxicol Lett，2021，350：81 - 90.

[16] 钱海华，刘鹏，李晶，等.淫羊藿素通过抗氧化损伤延缓CCl₄诱导的大鼠肝硬化进程［J］.第二军医大学学报，2011，32（6）：625 - 629.

[17] ZHANG X， XU Y， CHEN J M， et al. Huang Qi decoction prevents BDL - induced liver fibrosis through inhibition of notch signaling activation［J］. Am J Chin Med，2017，45（1）：85 - 104.

[18] ZHOU Y， LONG D， ZHAO Y， et al. Oxidative stress - mediated mitochondrial fission promotes hepatic stellate cell activation via stimulating oxidative phosphorylation［J］. Cell Death Dis，2022，13（8）：689.

基金资助

国家自然科学基金(31960095)

云南省应用基础项目(202101AS070022)