姜黄素通过NOX4 /ROS/GSDMD轴诱导焦亡抑制HepG2细胞生长

The NOX4/ROS/GSDMD axis in curcumin-induced pyroptosis and growth inhibition of HepG2 cells

摘要

研究姜黄素（curcumin，Cur）人肝癌细胞（HepG2）焦亡的作用及分子机制.采用CCK8法、膜联蛋白V&碘化丙啶（AnnexinⅤ&PI）染色法、2'，7' - 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH - DA）染色法、蛋白印迹法、酶联免疫吸附（Elisa）法探究姜黄素对HepG2细胞活力、焦亡、凋亡、氧化应激的作用及其调控细胞焦亡的机制.结果发现姜黄素呈剂量依赖性显著抑制HepG2细胞活力；姜黄素处理的HepG2细胞形态异常，出现大量空泡，乳酸脱氢酶 （LDH）、IL - 1β、和 IL - 18显著增加；姜黄素呈剂量依赖性显著上调HepG2细胞内活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）；此外，姜黄素还显著促进了HepG2细胞NF - κB磷酸化和NLRP3、NADPH氧化酶4 （NOX4）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 - 1（Caspase - 1）和消皮素D（GSDMD）蛋白表达水平上升.结果表明，姜黄素可能是通过激活NOX4/ROS/GSDMD轴促进NLRP3炎症小体组装，进而活化Caspase - 1并切割GSDMD，介导HepG2细胞焦亡，释放LDH、IL - 1β和IL - 18.

Abstract

The study explores the effects and molecular mechanisms of curcumin （Cur） on pyroptosis in human hepatocellular liver carcinoma cells （HepG2）. The effects of curcumin on cell viability， pyroptosis， apoptosis， and oxidative stress in HepG2 cells， along with its regulatory mechanism on pyroptosis， were investigated using CCK - 8 assay， Annexin V - FITC/PI double staining， DCFH - DA fluorescent probing， Western blot analysis， and enzyme - linked immunosorbent assay （ELISA）. The results showed that the viability of HepG2 cells was significantly inhibited by curcumin in a dose - dependent manner； curcumin - treated HepG2 cells displayed abnormal morphology with many vacuoles， and there was a significant increase in LDH， IL - 1β， and IL - 18. Intracellular levels of ROS and MDA in HepG2 cells were significantly up - regulated by curcumin in a dose - dependent manner. Furthermore， curcumin notably promoted the phosphorylation of NF - κB in HepG2 cells as well as increased the expression levels of NLRP3， NOX4， caspase - 1， and gasdermin D （GSDMD） proteins. The results suggest that curcumin may induce pyroptosis in HepG2 cells by activating the NOX4/ROS/GSDMD axis， promoting NLRP3 inflammasome assembly， which subsequently activates Caspase - 1 and cleaves GSDMD， leading to the release of LDH， IL - 1β， and IL - 18.

Graphical abstract

关键词

姜黄素 / NOX4 / GSDMD / HepG2细胞 / 细胞焦亡

Key words

curcumin / NOX4 / GSDMD / HepG2 cells / pyroptosis

癌症是全球第二大致死疾病，严重威胁着人类健康.肝细胞癌（HCC）死亡率在所有癌症中排名第二^［1-2］，五年生存率仅为18%.并且，中国是该疾病负担最重的国家，年发病例占全球50%以上^［3］.因此，寻找针对HCC的新靶点和治疗方法至关重要.细胞死亡的诱导与肿瘤抑制密切相关.在细胞程序性死亡的调控中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族起关键作用，尤其是Caspase - 1，其既能调控细胞凋亡，也能参与细胞焦亡^［4］.NADPH氧化酶4（NOX4）可直接调控细胞内活性氧（ROS）稳态，是氧化应激的关键调控因子.当细胞受到氧化应激时，可激活NF - κB和NLRP3信号通路^［5］，从而活化Caspase - 1，切割消皮素（GSDMD），诱发细胞焦亡^［6］.

尽管化疗药物在癌症治疗中已取得一定成效，但由于其毒副作用和耐药性等问题，仍面临诸多挑战^［7］.因此，天然产物在肿瘤治疗中的研究逐渐成为热点.研究^［8］发现，超过50%的现有药物来源于天然产物.许多天然产物通过调控氧化应激、炎症反应及细胞凋亡等机制抑制癌细胞生长^［9-11］.

姜黄素是中药姜黄的主要有效成分之一，因其广泛的药理作用备受关注.已有研究^［12-14］发现姜黄素在结肠癌和肺癌中表现出抗肿瘤作用.焦亡作为一种新型的细胞死亡方式，已被认为是癌症治疗中的关键机制.研究^［15-17］表明，丹参酮、雷公藤甲素和青蒿素等天然产物通过焦亡途径发挥抗肿瘤作用.然而，姜黄素对肝癌细胞焦亡作用及其机制尚未明确.因此，本研究旨在探讨姜黄素通过NOX4/ROS/GSDMD通路诱导人肝癌细胞（HepG2）焦亡的机制，为姜黄素等天然产物在HCC治疗中的应用提供理论支持和研究资料.

1 材料和方法

1.1 细胞

人肝癌细胞（HepG2，STCC10114G - 1）购自武汉赛维尔生物科技有限公司.

1.2 试剂

姜黄素（curcumin，2447 - 54 - 3），分析标准品，HPLC ≥ 98%，购自上海源叶生物科技有限公司；青霉素 - 链霉素 - 庆大霉素添加剂（G4014）、PBS（G4202）；胎牛血清（FBS）、MEM培养基购自美国Gibco公司； Trizol总RNA（15596018CN）提取、蛋白预染Marker（26616）试剂盒购赛默飞世尔科技公司；膜联蛋白V&碘化丙啶（AnnexinⅤ&PI）凋亡试剂盒（E - CK - A211B）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（E - BC - K020 - M）、丙二醛（MDA）试剂盒（E - BC - K028 - M）、酶联免疫吸附（Elisa）试剂盒IL - 1β和IL - 18（E - EL - H0253，E - EL - H0149）、2'，7' - 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH - DA） ROS检测试剂盒（E - BC - K138 - F）购自武汉Elabscience公司；RIPA裂解液（R0010）、ECL化学发光试剂盒（PE0010）购自索来宝科技有限公司；配胶试剂盒（P0901S）、TBST（ST677）、冻存液（C0210）购自上海碧云天生物技术有限公司.

1.3 仪器

低温离心机（赛默飞世尔科技公司，Sorvall™ Legend™ Micro 21R）；生物安全柜（鑫贝西生物，11228 BBC 86）；细胞培养箱（赛默飞世尔科技公司，Thermo Scientific™ Forma™ 310）；多功能酶标仪（PerkinElmer，EnSightTM）；凝胶成像分析系统（Bio - Rad，ChemiDoc MP Imaging System）；制冰机（Panasonic，SIM - F140BDL）；电子天平（赛多利斯，BSA124S - CW）；纯水制备仪（尼柯，NC - QY20）；凝胶电泳仪（Bio - Rad，Mini - PROTEAN^® Tetra）.

1.4 CCK8法检测细胞活力

将HepG2细胞以1 000个/孔的密度接种于96孔板，每孔添加100 μL培养液，24 h后加入姜黄素，调整至目标浓度（0、10、20、30 μmol/L），分为空白组（CON）、姜黄素低浓度组、姜黄素中浓度组和姜黄素高浓度组，每组设立6个复孔.分别于12、24、48 h后，加入CCK8试剂，置于37 ℃避光环境中孵育2 h，随后使用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度.

1.5 AnnexinⅤ&PI染色检测细胞凋亡水平

HepG2细胞以8 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，每孔添加2 mL培养液，24 h后加入姜黄素，调整至目标浓度（0、10、20、30 μmol/L）.24 h后用无血清培养基洗涤1次，用胰酶消化至EP管中，加入适量AnnexinⅤ&PI工作液覆盖细胞，室温下避光孵育20 min，通过流式细胞仪分析细胞凋亡水平.

1.6 比色法、酶联免疫吸附法（Elisa）检测细胞上清MDA、SOD、IL - 1β和IL - 18质量浓度

HepG2细胞以4 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，每孔添加2 mL培养液，24 h后加入姜黄素，调整至目标浓度（0、10、20、30 μmol/L）.24 h后用无血清培养基洗涤1次，加入2 mL无血清培养基继续放入培养箱中，24 h后收集培养液于4 ℃，1 200 r/min离心10 min，取上清按照流程操作，测定细胞培养上清液中MDA、SOD、IL - 1β、IL - 18的质量浓度.

1.7 DCFH - DA法检测细胞内ROS水平

HepG2细胞以8 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，每孔添加2 mL培养液，24 h后加入姜黄素，调整至目标浓度（0、10、20、30 μmol/L）.24 h后用无血清培养基洗涤1次，加入适量DCFH - DA工作液，置于培养箱中37 ℃避光孵育1 h，去除工作液，用无血清培养基洗涤3次，每次5 min，用胰酶消化至EP管中，1 200 r/min离心10 min收集细胞，用无血清培养基重悬后采用多功能酶标仪分析细胞内ROS水平.

1.8 蛋白免疫印迹法（Western - blot）法检测相关蛋白表达水平

HepG2细胞以8 × 10⁵ 个/孔的密度接种于6孔板中，每孔添加2 ml培养液，24 h后加入姜黄素，调整至目标浓度（0、10、20、30 μmol/L），24 h后用无血清培养基洗涤1次，加入裂解液，置于冰盒上充分裂解后，14 000 r/min离心10 min，取上清后用BCA检测蛋白浓度并将样本浓度调至一致；加入上样缓冲液于水浴锅煮沸5 min后进行凝胶电泳分离、转膜、封闭、孵育一抗兔抗人Survivin抗体（V_抗体∶V_TBST = 1∶2 000）、Cleaved caspase - 3抗体（V_抗体∶V_TBST = 1∶1 000）、NOX4抗体（V_抗体∶V_TBST =1∶1 000）、Caspase - 1抗体（V_抗体∶V_TBST = 1∶1 000）、GSDMD抗体（V_抗体∶V_TBST = 1∶2 000）、NLRP3抗体（V_抗体∶V_TBST = 1∶2 000）、NF - κB抗体 （V_抗体∶V_TBST = 1∶2 000）、内参GAPDH（V_抗体∶V_TBST = 1∶5 000）和二抗（V_抗体∶V_TBST = 1∶10 000），用TBST充分洗涤后，在化学发光仪器上进行显影曝光，采用Image J分析条带灰度值以反应蛋白表达水平.

1.9 数据统计学处理

使用统计软件进行统计分析，计量资料以均数 ± 标准差（\overline{x} ± s）表示，P < 0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 姜黄素对HepG2细胞活力的影响

为了研究姜黄素对HepG2细胞活力的影响，在12、24和48 h（IC₅₀分别为20.19、19.31、12.12 μmol/L）分别测量了用不同浓度姜黄素处理的HepG2细胞活力图1.结果显示在各个时间段姜黄素均能显著降低HepG2细胞活力（P < 0.01），并具有剂量依赖性，表明其可能抑制HepG2细胞增殖，促进细胞死亡，具有抗癌潜力.

2.2 姜黄素诱导HepG2细胞焦亡

根据文献［18］，淫羊藿素可诱导肝癌细胞焦亡，释放IL - 1β、IL - 18从而抑制肝癌进展.图2发现姜黄素处理的HepG2细胞显著膨胀、边缘模糊、形态异常，细胞内出现大量空泡，表明姜黄素可能引起细胞死亡；细胞焦亡是一种伴随促炎性细胞因子释放的细胞死亡形式.进一步检测发现姜黄素可以显著提高HepG2细胞上清中LDH、IL - 18和IL - 1β水平（图3），揭示其可诱导细胞焦亡从而引起癌细胞死亡.

2.3 姜黄素促进HepG2细胞凋亡

为了确认凋亡是否也参与姜黄素导致的HepG2细胞死亡，在Annexin V/PI染色后用流式细胞仪测定HepG2细胞的凋亡水平，并用蛋白印迹法检测了细胞凋亡标志Cleaved Caspase - 3和Survivin的蛋白表达水平.如图4 ~ 6所示，凋亡细胞以剂量依赖的方式显著增加（P < 0.01，P < 0.001），并且伴随着凋亡相关蛋白Cleaved caspase - 3和Survivin的显著上升（P < 0.01），表明姜黄素可通过细胞焦亡、凋亡等多种途径导致细胞死亡.

2.4 姜黄素诱导HepG2细胞氧化应激

最近的研究^［19］表明，ROS的过量积累可以导致细胞发生焦亡.这种由氧化应激介导的细胞死亡被广泛认为是癌症治疗中的一个重要机制.图7 ~ 8可知，姜黄素呈剂量依赖性导致HepG2细胞中ROS、MDA水平显著升高，SOD水平显著降低（P < 0.01， P < 0.001），表明姜黄素可以促进HepG2细胞氧化应激，提示其可能通过诱导细胞氧化应激，促进HepG2细胞凋亡和焦亡.

2.5 姜黄素对HepG2细胞NF - κB和NLRP3蛋白表达的影响

研究^［20-21］显示，NF - κB和NLRP3受氧化应激的调节，在细胞凋亡和焦亡中具有重要的调控作用.如图9所示，经姜黄素处理的HepG2细胞的NF - κB磷酸化水平显著上升（P < 0.01），表明NF - κB通路被激活；此外，姜黄素也引起HepG2细胞中NLRP3蛋白水平显著上升（P < 0.01），表明其可能通过诱导HepG2细胞氧化应激，调控NF - κB信号通路，促进细胞炎症反应，诱导细胞发生焦亡.

2.6 姜黄素对HepG2细胞焦亡相关蛋白表达的影响

天然产物杨梅素被证明可以上调NOX4，导致细胞内脂质过氧化，从而抑制胃癌进展^［22］.如图10所示，姜黄素处理的HepG2细胞NOX4蛋白水平上升，揭示其通过促进NOX4表达，引起ROS增多，诱导氧化应激.NLRP3是炎症小体的核心组成部分，通过激活Caspase - 1进而裂解GSDMD启动细胞焦亡的下游过程.GSDMD是细胞焦亡中关键的效应分子，经Caspase - 1切割后与细胞膜相互作用，从而破坏细胞膜的完整性，引起细胞焦亡.与空白组相比，经姜黄素处理的HepG2细胞的Caspase - 1蛋白水平显著上升（P < 0.05， P < 0.01），并呈现出剂量依赖性.此外，GSDMD - N（GSDMD的N端片段）的蛋白水平随着姜黄素浓度的增加显著上升.这些结果表明姜黄素可能通过激活NOX4/ROS/Caspase - 1轴，促进GSDMD的裂解并生成其N端片段诱导HepG2细胞焦亡.

3 结语

首次系统地探讨了姜黄素对HepG2细胞焦亡的作用及其分子机制.研究结果表明，姜黄素通过激活NOX4/ROS/GSDMD轴促进NLRP3炎症小体的组装，激活Caspase - 1并切割GSDMD，进而诱导HepG2细胞焦亡，释放LDH、IL - 1β和IL - 18，最终引起癌细胞死亡.这为姜黄素在肝癌治疗中的潜在应用提供了新的分子机制支持.尽管本研究揭示了姜黄素诱导HepG2细胞焦亡的机制，但仍存在一定的局限性.本实验主要基于体外细胞模型，尚缺乏动物模型以及临床水平的研究数据.此外，虽然研究表明姜黄素能够通过NOX4/ROS/GSDMD轴介导细胞焦亡，但其他可能的机制尚未得到充分探索.因此，未来的研究将重点关注姜黄素在动物模型中的抑癌效果，并探索其与其他信号通路的相互作用，以期为姜黄素在肝癌治疗中的临床应用提供更全面的理论依据.

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基金资助

全国名老中医传承工作室项目(皖中医药发展秘［2022］19号)