2，6-二甲氧基-1，4-苯醌通过抑制NLRP3炎症小体活化缓解小鼠的感染性休克

2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone alleviates septic shock in mice by inhibiting NLRP3 inflammasome activation

摘要

目的 探究发酵小麦胚芽提取物主要活性成分2，6-二甲氧基-1，4-苯醌（DMQ）抑制NLRP3炎症小体活化并缓解小鼠感染性休克的作用机制。 方法 细胞学水平： 在BMDM细胞中，经脂多糖（LPS）预处理、DMQ干预后，利用尼日利亚菌素（Nigericin）、ATP、尿酸钠结晶（MSU）分别活化经典NLRP3炎症小体以及胞内转染LPS活化非经典NLRP3炎症小体。利用聚脱氧腺苷酸（Poly A：T）活化AIM2炎症小体。在THP-1细胞中，利用Nigericin活化经典NLRP3炎症小体，通过Western blotting和ELISA方法测定NLRP3炎症小体活化产物的表达水平。蛋白分子水平：利用免疫共沉淀探究DMQ阻断NLRP3炎症小体活化的具体机制。动物水平：将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组、感染性休克LPS组、DMQ 20 mg/kg治疗组、DMQ 40 mg/kg治疗组，6只/组，待DMQ治疗组小鼠预注射相应浓度DMQ后，对照组小鼠注射无菌PBS，其余3组小鼠腹腔注射相同剂量LPS，利用ELISA检测DMQ干预对LPS诱导的小鼠感染性休克模型中血清和腹腔灌洗液中TNF-α和IL-1β分泌水平的影响。DMQ预处理后注射LPS观察记录小鼠36 h内的生存状态并绘制生存曲线。 结果 DMQ可有效抑制小鼠BMDM细胞和人THP-1细胞中经典NLRP3炎症小体活化（P<0.05），在小鼠BMDM细胞中对非经典NLRP3炎症小体活化也起到有效抑制作用（P<0.05），DMQ对AIM2炎症小体活化无影响（P>0.05）。进一步实验结果揭示DMQ可阻断ASC和NLRP3之间的相互作用。DMQ治疗组可显著降低小鼠血清和腹腔液中IL-1β的分泌水平（P<0.05）并延长小鼠生存时间（P<0.05）。 结论 发酵小麦胚芽提取物主要活性成分DMQ通过阻断ASC和NLRP3之间的相互作用有效抑制NLRP3炎症小体活化并缓解LPS诱导的小鼠感染性休克。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone (DMQ), an active ingredients in fermented wheat germ extract, for inhibiting NLRP3 inflammasome activation and alleviating septic shock in mice. Methods Cultured murine bone marrow-derived macrophages (BMDM) stimulated with lipopolysaccharide (LPS) were treated with DMQ, followed by treatment with Nigericin, ATP, and MSU for activating the canonical NLRP3 inflammasome; the non-canonical NLRP3 inflammasome was activated by intracellular transfection of LPS, and AIM2 inflammasome was activated using Poly A:T. In human monocytic THP-1 cells, the effect of Nigericin on inflammasome activation products was examined using Western blotting and ELISA. Co-immunoprecipitation was performed to explore the mechanism of DMQ-induced blocking of NLRP3 inflammasome activation. In a male C57BL/6J mouse model of LPS-induced septic shock treated with 20 and 40 mg/kg DMQ, the levels of IL-1β and TNF-α in the serum and peritoneal lavage fluid were determined using ELISA, and the survival time of the mice within 36 h was observed. Results Treatment with DMQ effectively inhibited LPS-induced activation of canonical NLRP3 inflammasome in mouse BMDM and human THP-1 cells and also inhibited non-canonical NLRP3 inflammasome activation in mouse BMDM, but produced no significant effect on AIM2 inflammasome activation. DMQ significantly blocked the binding between ASC and NLRP3. In the mouse models of septic shock, DMQ treatment significantly reduced the levels of IL-1β in the serum and peritoneal fluid and obviously prolonged survival time of the mice. Conclusion DMQ can effectively block ASC-NLRP3 interaction to inhibit NLRP3 inflammasome activation and alleviate LPS-induced septic shock in mice.

Graphical abstract

关键词

2，6-二甲氧基-1，4-苯醌 / NLRP3炎症小体 / 感染性休克 / 发酵小麦胚芽提取物

Key words

2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone / NLRP3 inflammasome / septic shock / fermented wheat germ extract

核苷酸结合寡聚化结构域受体蛋白3（NLRP3）小体是由NOD样受体家族中NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白caspase-1前体组成的一类多聚蛋白复合物^［1］。NLRP3炎症小体是先天免疫系统的一个重要组成部分，普遍存在于免疫细胞中，它在多种刺激下（如微生物感染和细胞损伤）通过激活caspase-1，促进炎性细胞因子IL-1β/IL-18的分泌，从而介导炎症反应，同时还可剪切GSDMD进而诱导细胞焦亡^［2］。NLRP3炎症小体的正常活化对维持机体稳态至关重要^［3］。NLRP3炎症小体失调可导致大量炎性因子分泌，参与多种疾病的发生和发展，例如神经退行性疾病、代谢紊乱疾病、自身免疫炎性疾病与心血管疾病，其中包括癫痫^［4］、酒精性肝炎^［5］、慢性粒细胞白血病^［6］和动脉粥样硬化^［7］等。NLRP3炎症小体与多种炎性相关疾病的发生和发展有关。目前 NLRP3炎症小体相关疾病的临床治疗以IL-1β为靶点^［8］，例如IL-1β抑制剂Canakinumab。但是靶向IL-1β的治疗手段存在具有非特异性和局限性的弊端，因此筛选出一种特异性好且作用显著的NLRP3炎症小体抑制剂尤为重要。

发酵小麦胚芽提取物，商品名为爱维麦（Avamer），是一种在2002年在匈牙利被注册为可应用于癌症患者的特殊营养品。有研究表明爱维麦具有独特的抗癌的作用^［9］。爱维麦可导致肿瘤细胞中MHC Ⅰ类蛋白的下调，增加NK细胞识别、杀伤转移性肿瘤细胞的敏感性，可在化疗、手术、放疗后抑制转移性肿瘤的扩散和增殖^［10］。除此之外，在人HT29结肠癌细胞中，爱维麦可抑制细胞的核糖核苷酸还原酶活性，诱导细胞凋亡^［11］。天然化学物质2，6-二甲氧基-1，4-苯醌（DMQ）是发酵小麦胚芽提取物中的主要生物活性成分^［12］，存在于各种植物中，可以调节多种生物过程，例如电子传递活性^［13］和氧化磷酸化^［14］。DMQ通过调节AKT/mTOR信号通路和增强线粒体功能来增加骨骼肌质量和性能，可能有助于骨骼肌萎缩的治疗和预防^［15］。据报道，DMQ具有良好的抗炎活性，能剂量依赖性地抑制LPS诱导的NO生成^［16］。DMQ还具有显著的抗肿瘤活性，对TPA诱导的皮肤致癌作用有预防作用^［16］、对4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）诱导的小鼠肺肿瘤有明显抑制作用^［17］，还可以抑制胃癌细胞生长和诱导胃癌细胞凋亡。DMQ可以降低胃癌细胞中的mTOR信号通路Ki-67、磷酸化mTOR和磷酸化p70S6K的表达，是一种新型mTOR蛋白激酶抑制剂^［18］。除此之外，DMQ在脂肪生成抑制中也发挥重要作用，可显著降低各种脂肪形成转录因子的表达，包括过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARs-γ），CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPα）以及脂肪细胞蛋白2（aP2）和脂肪酸合酶^［19］。以上研究表明，DMQ对炎症、肿瘤以及脂肪生成均表现出良好的抑制效果，鉴于NLRP3炎症小体在恶性肿瘤、高脂诱发的2型糖尿病等疾病发生发展过程中发挥重要作用，但目前尚未有DMQ对NLRP3炎症小体活化影响的报道。因此，本研究通过体内外实验探究发酵小麦胚芽提取物主要活性成分DMQ对NLRP3炎症小体活化的影响，以期为NLRP3炎症小体相关炎性疾病的治疗提供潜在的药物治疗方案。

1 材料和方法

1.1 实验动物和细胞株

6~8周龄的SPF级C57BL/6J雄性小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份技术有限公司，所有小鼠均饲养于无特定病原体（SPF）环境，温度22~24℃，光照时间为8：00~22：00，保持光照循环14 h光照10 h黑暗，定期观察小鼠生活状态，及时调整饲养条件，实验严格按照实验动物管理规范进行。急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。本研究所有动物实验均经蚌埠医科大学伦理委员会审核批准（伦动科批字［2020］第57号）。

1.2 试剂

2，6-Dimethoxy-1，4-benzoquinone（上海陶术生化，纯度99.46%）；高糖DMEM培养基；RPMI 1640培养基；OPTI-MEM培养基；胎牛血清（Gibco）；红细胞裂解液、NP-40裂解液（Beyotime）；巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（Navoprotein）；尼日利亚菌素（Nigericin，MCE）；三磷酸腺苷（ATP）、尿酸钠结晶（MSU）（Sigma）；聚脱氧腺苷酸（Poly A：T）、脂多糖（LPS）、三酰酯肽（Pam3CK4）、佛波醇（PMA）、Lipofectamine2000 （Invitrogen）；ELISA试剂盒（Mouse IL-1β、TNF-α、IL-6，Human IL-1β ELISA kit）（R&D）；Anti-mouse caspase-1（p20）、Anti-NLRP3（AdipoGen）；Anti-mouse IL-1β（R&D）、Anti-β-actin（Proteintech）；Anti-human p20、Anti-IgG、Anti-ASC（Cell Signaling Technology）；Protein G Agarose（Merck）。

1.3 细胞提取与培养

小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的获取与培养：首先选取SPF级6~8周龄的雄性小鼠，经颈脱臼法处死后，浸泡酒精消毒，取腿骨存放于1.5 mL EP管，在经紫外灭菌超30 min的超净工作台中剪去腿骨两端，用20 mL注射器吸取DMEM培养基反复冲洗获取腿骨中的细胞，离心后快速弃掉上清，根据细胞量加入2~3 mL红细胞裂解液，静置裂解2~3 min，于完全DMEM培养基中加入M-CSF用于分化细胞，置于细胞培养箱并及时观察细胞生长状态。BMDM细胞呈细长梭形贴壁生长，通过流式细胞术鉴定巨噬细胞表面标志物（F4/80⁺CD11b⁺）。THP-1细胞的复苏与培养：从液氮中取出冻存的THP-1细胞，在37 ℃水浴锅快速化冻，皿中提前加入1640完全培养基，离心后弃上清，重悬之后分入各皿中，置于细胞培养箱培养并及时观察细胞生长状态。

1.4 细胞刺激

镜下观察细胞生长密度和分化状态，选取生长状态良好的BMDM/THP-1细胞，接种至12孔细胞培育板培养过夜。LPS（100 ng/mL）预处理4 h后加入不同剂量DMQ，30 min后加入多种经典NLRP3炎症小体的激活剂，如Nigericin、ATP和MSU。其中Nigericin活化25 min、ATP活化35 min、MSU活化3.5 h。对于非经典NLRP3炎症小体，我们首先用Pam3CK4（200 ng/mL）对BMDM细胞预处理3.5 h后，胞内转染LPS（2 μg/mL）活化非经典NLRP3炎症小体。LPS（100 ng/mL）预处理4 h后，Poly A：T（1 μg/mL）胞内转染4 h活化AIM2炎症小体。

1.5 酶联免疫吸附实验（ELISA）

将捕获抗体稀释后包被于固相载体上，室温孵育过夜，PBST洗板洗去未结合捕获抗体。加入封闭液孵育2 h，PBST洗板去除残余封闭液。加入待测样本（细胞上清液/血清/腹腔灌洗液）孵育1.5 h，PBST洗板去除未结合样本。加入检测抗体孵育1 h，PBST洗板去除未结合检测抗体。加入辣根过氧化物酶（HRP），避光孵育25 min，PBST洗板去除多余HRP。加入底物TMB后等待显色，10 min后加入10%H₂SO₄终止反应，5 min内于450 nm处读取吸光度，绘制标准曲线并计算各细胞因子分泌水平。

1.6 Western blotting检测

检测caspase-1（p20）和IL-1β蛋白分子的表达：首先收集细胞上清液，离心弃细胞沉淀，利用甲醇氯仿法提取蛋白，加入1.5×Sample Buffer，金属浴10 min。检测Pro-caspase-1（Pro-casp1）、Pro-IL-1β蛋白表达：向细胞培养板中加入1.5×Sample Buffer，裂解后收集至1.5 mL EP管中，100 ℃金属浴10 min。电泳步骤：首先根据蛋白分子量选择适当浓度的聚丙烯酰胺凝胶，之后将蛋白转印到经甲醇激活的PVDF膜上，室温条件下用5 %BSA封闭1 h，使用PBST洗除残余BSA。随后，加入一抗抗体并于4 ℃条件孵育过夜，次日PBST洗去未结合一抗抗体。加入二抗抗体在室温条件下孵育1.5 h，PBST洗去未结合二抗抗体，及时使用凝胶成像系统对条带进行显影。

1.7 免疫共沉淀

选取生长状态良好的BMDM细胞接种至6孔板中，用LPS进行预刺激，3 h后加DMQ于37 ℃温箱孵育30 min，加入Nigericin活化NLRP3炎症小体。待细胞活化后弃上清，加入NP-40裂解液充分裂解细胞，离心取上清，分为Input组和IP组。Input组直接加入5×Sample Buffer，于100 ℃金属浴煮10 min。IP组加入相应抗体（Anti-IgG/Anti-NEK7/Anti-ASC），转盘4 ℃过夜。离心10 min弃上清加入Beads（Protein G），转盘于4 ℃条件孵育1 h，离心弃上清后加入5×Sample Buffer，金属浴10 min。

1.8 构建动物模型

1.8.1 构建小鼠感染性休克模型

挑选SPF级8周龄、体质量在20~21 g的雄性C57BL/6J小鼠随机分组（6只/组）：空白对照组（Control组）、感染性休克组（LPS组）、DMQ 20 mg/kg治疗组（LPS+DMQ 20 mg/kg）和DMQ 40 mg/kg治疗组（LPS+DMQ 40 mg/kg）。DMQ治疗组小鼠腹腔注射DMQ（20 mg/kg、40 mg/kg） 50 min后，Control组小鼠注射无菌PBS，另外3组小鼠腹腔注射等剂量的LPS（20 mg/kg），4 h后摘眼球取血、室温静置3 h离心获得眼球血上层血清。颈脱臼法处死小鼠，用1 mL注射器收集小鼠腹腔灌洗液。ELISA检测各组小鼠血清和腹腔灌洗液中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α分泌水平。

1.8.2 绘制生存曲线

用两种浓度（20 mg/kg、40 mg/kg）的DMQ预处理小鼠50 min后，注射LPS后观察各组小鼠36 h内的死亡时间和存活率，使用GraphPad Prism 8.0软件绘制模型生存曲线。

1.9 统计学分析

数据分析和生存曲线的绘制均使用GraphPad Prism 8.0软件完成。所有数据结果以均数±标准差表示，并采用独立样本t检验来分析两组数据的差异，生存曲线采用Log-rank法比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DMQ抑制Nigericin诱导的经典NLRP3炎症小体活化

在鼠BMDM细胞中，Western blotting检测结果显示，IL-1β和p20蛋白表达随DMQ增加呈剂量依赖性的降低趋势（P<0.05，图1A），但对Pro-IL-1β和Pro-casp1蛋白表达无影响（P>0.05，图1A）。ELISA结果显示，IL-1β的分泌可随DMQ增加呈剂量依赖性的抑制趋势（P<0.05，图1B），但对NF-κB信号通路产生的促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌无显著影响（P>0.05，图1C、D）。在人THP-1细胞中，Western blotting结果显示，p20蛋白表达随DMQ剂量增加呈降低趋势（P<0.05，图1E），但对Pro-casp1的蛋白表达无显著影响（P>0.05，图1E）。ELISA结果显示，IL-1β的分泌可被DMQ剂量依赖性地抑制（P<0.05，图1F）。

2.2 DMQ抑制ATP、MSU诱导的经典NLRP3炎症小体活化

Western blotting结果显示，IL-1β和p20蛋白表达随DMQ剂量增加而降低（P<0.05，图2A），但对Pro-IL-1β和Pro-casp1蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05，图2A）。ELISA结果显示，在ATP、MSU诱导经典NLRP3炎症小体活化后，IL-1β的分泌可随DMQ增加呈剂量依赖性的抑制趋势（P<0.05，图2B、C）在MSU诱导经典NLRP3炎症小体活化后，Western blotting结果显示，IL-1β和p20蛋白表达随DMQ增加呈剂量依赖性的降低趋势（P<0.05，图2D），但对Pro-IL-1β、Pro-casp-1蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05，图2D）。

2.3 DMQ抑制胞内转染LPS诱导的非经典NLRP3炎症小体

Western blotting结果显示，IL-1β和p20蛋白表达随DMQ增加呈剂量依赖性的抑制趋势（P<0.05，图3A），但对Pro-IL-1β和Pro-casp1蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05，图3A）。ELISA结果显示，IL-1β的分泌可随DMQ增加，呈剂量依赖性的抑制趋势（P<0.05，图3B）。

2.4 DMQ对Poly A：T诱导的AIM2炎症小体无影响

Western blotting结果显示，与DMQ抑制Nigericin活化的NLRP3炎症小体相比，DMQ对AIM2炎症小体活化产生的各组分蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05，图4A~E）。ELISA结果显示，DMQ可显著抑制Nigericin诱导的IL-1β分泌，但对Poly A：T诱导的IL-1β分泌无抑制作用（P>0.05，图4F）。

2.5 DMQ抑制NLRP3和ASC的相互作用

免疫共沉淀结果显示，NEK7、ASC与NLRP3存在相互作用，加入DMQ未能阻断NLRP3和NEK7之间的相互作用（P>0.05，图5A~C），但可显著抑制下游NLRP3和ASC之间的相互作用（P<0.05图5D~F）。

2.6 DMQ可有效缓解LPS诱导的小鼠感染性休克

ELISA结果显示，与空白对照组相比，腹腔注射LPS可导致感染性休克组小鼠血清和腹腔灌洗液中IL-1β、TNF-α的分泌明显增加，DMQ治疗组中小鼠血清和腹腔灌洗液中IL-1β的分泌水平随DMQ浓度增加呈而下降（P<0.05，图6A、C），但对TNF-α的分泌水平无影响（P>0.05，图6B、D）。DMQ给药50 min后腹腔注射LPS，观察并及时记录小鼠36 h内生存状态。结果显示，感染性休克组小鼠于第10 h开始死亡，29 h时小鼠全部死亡。DMQ 20 mg/kg治疗组于25 h开始有小鼠死亡（P<0.05，图6E），DMQ 40 mg/kg治疗组于28 h开始有小鼠死亡（P<0.05，图6E）。

3 讨论

NLRP3炎症小体在人类先天免疫系统扮演着不可或缺的角色，其正常活化对维持机体稳态至关重要，激活caspase-1并促进Pro-IL-1β和Pro-IL-18剪切为成熟的IL-1β和IL-18，以响应微生物感染和细胞损伤^{［20， 21］}，但其异常失调可导致大量炎性因子释放并引发多种炎性相关疾病，如感染性休克^［22］、冷吡啉相关周期性综合征^［23］、类风湿关节炎^［24］和缺血性中风^［25］等，因此，靶向抑制NLRP3炎症小体活化可以成为干预相关炎性疾病的新思路^［26］。

小麦胚芽含有多种矿物质和微量元素以及人体必需的营养物质，具有高营养、低毒性、易获取的优点。由于小麦胚芽易受氧化影响，为方便保存，日常食用的小麦在加工过程中基本去除了富含营养的胚芽，造成多种营养素流失。被去除的小麦胚芽多作为副产品或用于制作动物饲料，故深度开发和有效利用小麦胚芽资源尤为重要。近年来对于发酵小麦胚芽提取物的研究主要集中在其抗癌方面，对其抗炎功效研究不足。

当机体感受到病原微生物或其他危险信号的攻击时，NLRP3炎症小体被活化从而介导炎症反应，维持机体免疫稳态^［27］。本研究利用Nigericin活化NLRP3炎症小体，通过检测Pro-casp1、Pro-IL-1β和活化后的caspase-1（p20）以及IL-1β分泌水平来观察DMQ对NLRP3炎症小体活化的影响，明确DMQ可以抑制NLRP3炎症小体的活化，但不影响Pro-IL-1β、Pro-casp1蛋白表达水平，相比于其他mTOR抑制剂如红景天苷（Salidroside）对Nigericin抑制浓度为50 μmol/L^［28］，醌类化合物如大黄素（Emodin）对Nigericin抑制浓度约为50 μmol/L^［29］，DMQ仅在10 μmol/L浓度就表现出更显著的抑制作用。此外， DMQ在经典NLRP3炎症小体的激活剂ATP、MSU诱导的NLRP3炎症小体活化中也表现出良好的抑制效果，证明了DMQ抑制NLRP3炎症小体活化的非单一性。Caspase-11可通过识别胞内LPS激活非经典NLRP3炎症小体^［30］，实验结果表明，DMQ同样可以抑制非经典NLRP3炎症小体的活化。

AIM2炎症小体和NLRP3炎症小体一样，可以活化caspase-1，在抗病毒免疫反应中起重要作用^［31］，为探究DMQ对NLRP3炎症小体的作用是否具有特异性，利用DMQ干预Poly A：T激活AIM2炎症小体，实验结果表明DMQ对AIM2炎症小体激活并无抑制作用，表明DMQ仅特异性抑制NLRP3炎症小体活化。

免疫共沉淀结果显示，DMQ可有效抑制NLRP3和ASC之间的结合，但对NEK7和NLRP3之间的结合无抑制作用，表明DMQ可直接影响NLRP3炎症小体组装活化。

在LPS诱导的小鼠感染性休克模型中，LPS使炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌显著增加，DMQ在20 mg/kg的浓度即可降低IL-1β的分泌水平，有效缓解小鼠感染性休克，延长小鼠生存时间。与天然产物二氢丹参酮Ⅰ缓解小鼠感染性休克的效果相比，DMQ在40 mg/kg药物浓度时效果更明显，小鼠存活率高于二氢丹参酮Ⅰ^［32］。DMQ对于TNF-α的分泌水平无显著影响。以上结果表明DMQ可有效缓解NLRP3炎症小体介导的感染性休克，提示DMQ有作为治疗NLRP3炎症小体相关疾病候选药物的潜力。

综上所述，DMQ能够有效地抑制多种刺激剂在鼠BMDM细胞和人THP-1细胞中诱导的NLRP3炎症小体活化，阻断ASC和NLRP3之间的相互作用，进而影响NLRP3炎症小体的组装和活化过程，缓解LPS诱导的小鼠感染性休克。本研究结果表明，DMQ对调节NLRP3炎症小体活化中有着明显抑制作用，这为日后探索进一步DMQ抑制NLRP3炎症小体活化的作用机制提供了实验依据，有利于更好的深度开发和有效利用小麦胚芽的资源，同时为感染性休克及其他NLRP3炎症小体相关炎性疾病了治疗提供新的选择和思路。

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