康柏西普可逆转TGF-β₂诱导的晶状体上皮细胞发生上皮间质转化：基于调节TGF-β/Smad信号通路

Conbercept reverses TGF‑β₂-induced epithelial-mesenchymal transition in human lens epithelial cells by regulating the TGF-β/Smad signaling pathway

摘要

目的 探讨康柏西普（conbercept）对转化生长因子-β₂（TGF-β₂）诱导人晶状体上皮细胞（HLECs）发生上皮间质转化（EMT）的逆转机制。 方法 体外培养HLEC-SRA01/04细胞并分为对照组、TGF-β₂组、conbercept组、TGF-β₂+conbercept组。采用MTT法、流式细胞术、划痕实验、Transwell检测细胞增殖、凋亡与迁移，Western blotting 和qRT-PCR 检测EMT相关上皮细胞标记物E-Cadherin、α-SMA、snail、细胞外基质和TGF-β/Smad信号通路相关基因的表达。 结果 TGF-β₂+conbercept组EMT程度明显减轻，细胞间充质及细胞外基质标志物α-SMA、snail、collagen Ⅰ、collagen Ⅳ、FN1的表达量均明显减少，与TGF-β₂组的差异有统计学意义（P<0.05）。上皮细胞相关标志物E-Cadherin的蛋白及mRNA的表达上调（P<0.05）。Transwell结果显示，与TGF-β₂组相比，TGF-β₂+conbercept组细胞迁移能力减弱（P<0.05）。此外，TGF-β₂诱导HLEC-SRA01/04细胞发生EMT过程中发生Smad2/3磷酸化水平升高现象可被康柏西普抑制（P<0.01）。 结论 康柏西普可能通过TGF-β/Smad信号通路抑制HLEC-SRA01/04细胞EMT过程，具有预防及治疗PCO的能力。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which conbercept reverses transforming growth factor-β₂ (TGF‑β₂)-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human lens epithelial cells (HLECs). Methods Cultured HLEC SRA01/04 cells were treated with TGF‑β₂, conbercept, or both, and the changes in cell proliferation, apoptosis, and migration were observed using MTT assay, flow cytometry, scratch assay, and Transwell assay. Western blotting and qRT-PCR were used to detect the changes in the expression of EMT-related epithelial cell markers (E-Cadherin, α‑SMA, and Snail), extracellular matrix components, and genes related to the TGF-β/Smad signaling pathway. Results Conbercept significantly reduced TGF-β₂-induced EMT of SRA01/04 cells, decreased the expression levels of mesenchymal and extracellular matrix markers α-SMA, Snail, collagen I, collagen IV, and FN1, and upregulated the protein and mRNA expressions of E-cadherin (P<0.05). Transwell assay showed significantly lower cell migration ability in TGF-β₂+conbercept group than in TGF-β₂ group (P<0.05). Conbercept also inhibited the increase in Smad2/3 phosphorylation levels in HLEC-SRA01/04 cells with TGF-β₂-induced EMT (P<0.01). Conclusion Conbercept inhibits TGF‑β₂ induced EMT by downregulating the expression of pSmad2/3 in TGF‑β/Smad signaling pathway, indicating a potential therapeutic strategy against visual loss induced by posterior capsule opacification.

Graphical abstract

关键词

后发性白内障 / 康柏西普 / 上皮间质转化 / 转化生长因子-β₂

Key words

posterior capsule opacification / conbercept / epithelial-to-mesenchymal transition / transforming growth factor-β₂

后发性白内障（PCO）是白内障囊外摘除术后视力再次下降的主要原因，发生率高达50%，已成为威胁我国公共卫生健康的重大问题^{［1， 2］}。目前研究认为：由于白内障手术后残余的晶状体上皮细胞（LECs）过度增殖、移行于后囊膜，并发生上皮间质转化（EMT） ^［3］，最终导致PCO，而在EMT过程中，促纤维化细胞因子转化生长因子-β（TGF-β）及其典型信号通路（Smad）的信号传递是LECs进行EMT的必要条件^［4］。

目前预防和治疗PCO的方法包括晶状体囊膜抛光、激光撕囊、后囊连续环形撕囊和Nd：YAG后囊膜切开术等，但其可能增加术后炎症因子的水平和其他并发症发生的风险^［5-7］，且临床上尚无有效的药物来预防和治疗PCO。因此，亟待寻找一种无眼内毒副作用且对PCO预防和治疗均有良好疗效的药物。多项研究结果表明，白内障术后血管内皮生长因子（VEGF）水平的降低可以显著减少PCO的发生率^{［8， 9］}。因此，VEGF抑制剂可能作为预防或治疗PCO的新一代靶点。

康柏西普（conbercept）是一种常用的眼内注射抗VEGF药物，主要用于玻璃体腔注射来治疗眼内新生血管性疾病，且其有效性及安全性已被证实。但目前的研究只关注抗VEGF药物在富含血管的组织中的作用^［10-12］，而忽略了它在非血管组织（如晶状体）中的作用，国内外亦无康柏西普对PCO作用的相关研究。本研究使用康柏西普直接作用于HLEC-SRA01/04和TGF-β₂诱导LECs发生EMT的细胞模型，从而分析康柏西普是否可抑制PCO相关纤维化过程（LECs增殖、EMT和ECM产生），为康柏西普预防和治疗PCO提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

人晶状体上皮细胞（HLEC-SRA01/04，广州赛库生物技术有限公司），conbercept（成都康弘生物科技有限公司），高糖型DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（Lonsera），Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；聚偏氟乙烯（PVDF膜）、ECL化学发光试剂盒（Millipore）；E-cadherin、Snail、Smad2/3、α-SMA抗体（Proteintech），重组人TGF-β₂（PeproTech）、P-Smad2/3、β-actin抗体（Affinity）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔、兔抗鼠二抗（Biosharp）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HLEC-SRA01/04培养于含20%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养。

1.2.2 细胞增殖实验

将处于对数生长期的HLEC-SRA01/04以每孔5×10³个细胞接种于96孔板，培养24 h。24 h后换新鲜DMEM培养基并分别加入浓度为0、0.1、0.5、1、2 mg/mL的康柏西普，设置5个复孔，置于培养箱里分别培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h后弃旧培养液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速震荡10 min。酶标仪检测波长490 nm处的吸光度值（A），分别计算细胞增殖抑制率［（A_对照组-A_实验组）/A_对照组×100%］。实验重复3次。

1.2.3 AnnexinⅤ-FITC/PI染色检测细胞凋亡

取处于对数生长期的HLEC-SRA01/04接种至6孔板中，用不同浓度的康柏西普（0、0.1、0.5、1、2 mg/mL）处理48 h，收集各组细胞上清，以及用不含EDTA胰酶消化离心，收集全部细胞，用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次；按照凋亡试剂盒说明书进行操作，室温孵育10~20 min，CytoFLEX流式细胞仪上机检测，实验重复3次。

1.2.4 划痕实验检测细胞迁移能力

收集对数生长期的HLEC-SRA01/04接种至6孔板，待细胞密度达90%且处在对数生长期，用10 μL无菌枪头垂直在6孔板内划两道宽度均匀的直线，注意保持各组划出痕的宽度基本一致，用PBS冲洗2次，再进行加药（0、0.1 mg/mL康柏西普）处理，分别于加药后0、24 h在低倍镜下拍照记录各组细胞的不同痕迹宽度。

1.2.5 TGF-β₂诱导HLEC-SRA01/04发生EMT过程

取对数生长期细胞接种于6孔板中，当细胞融合度达到70%~90%时，用浓度10 ng/mL TGF-β₂处理细胞24 h后，在倒置显微镜下观察各组细胞形态变化并拍照记录。采用Western blotting和 qRT-PCR来检测EMT相关标志物的表达水平。

1.2.6 Transwell实验检测细胞迁移能力

分别取对数生长期的对照组、TGF‑β₂组、conbercept组、TGF-β₂+conbercept组的细胞，每组设3个复孔，消化离心后，用无血清培养基将每组的细胞调整至相同细胞密度。每组各取100 μL加入Transwell小室的上室，向24孔板中加入600 μL含20%胎牛血清培养基，24 h后取出小室弃上清，用棉签轻柔的擦去上室里未穿过的细胞。在下室中加入600 μL 4%的多聚甲醛固定细胞30 min。瑞氏-吉姆萨染液染色后，用高倍镜观察细胞数量。

1.2.7 总RNA提取及实时荧光定量PCR检测EMT相关基因及ECM基因

胰酶消化对照组、TGF-β₂组、conbercept组、TGF-β₂+conbercept组实验组的对数生长期细胞，用Trizol法提取细胞总RNA。根据逆转录试剂说明书进行逆转录反应，按照荧光定量试剂盒说明书用实时定量PCR仪进行实时定量PCR检测。以GAPDH为内参，所用引物（表1）。相对表达量计算公式为2^-ΔΔCT，相关基因表达的ΔΔCT=CT值（实验组目的基因-实验组GAPDH）-CT值（对照组目的基因-对照组GAPDH）。

1.2.8 Western blotting法检测相关蛋白的表达

按照实验分组对照组、TGF‑β₂组、conbercept组、TGF‑β₂+conbercept组处理细胞48 h，消化细胞后用预冷的PBS洗涤，加入蛋白裂解液提取总蛋白，采用蛋白质二甲喹啉甲酸法进行蛋白定量分析；加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，蛋白于95 ℃煮10 min；蛋白样品总量为20 μg；Protein Lead 上样量为5 μL，100 V、10%十二烷基硫酸钠聚丙烯胶电泳（SDS-PAGE）1 h；电泳结束后将蛋白转置PVDF膜；将膜放入封闭液中置于摇床室温封闭2 h；孵育一抗E-Cadherin（1∶2000）、α-SMA （1∶1500）、Snail（1∶2000）、Smad2/3（1∶1000）、p-Smad2/3 （1∶1000）和β-actin（1∶5000），4 ℃孵育过夜；TBS-T缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10 min；HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗（1∶5000）37 ℃孵育2 h后洗膜，进行BIO-RAD成像系统拍照，Image J软件分析灰度结果，每组实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示，4组差异的比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义时，进一步采用LSD-t检验进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 康柏西普对HLEC-SRA01/04细胞增殖的影响

MTT结果显示：相同时间点内随着康柏西普浓度的增加，除0.1 mg/mL组外，各实验组LECs的存活率逐渐降低（P<0.05）；随着培养时间延长，不同浓度的康柏西普（0、0.1、0.5、1、2 mg/mL）对HLEC-SRA01/04细胞存活率也逐渐下降（P<0.05，图1）。

2.2 康柏西普对HLEC-SRA01/04细胞凋亡的影响

与0 mg/mL组相比，随着康柏西普浓度的增加，HLEC-SRA01/04细胞凋亡率增高（P<0.05，图2）。

2.3 康柏西普对HLEC-SRA01/04迁移能力的影响

划痕实验结果表明，与对照组相比，0.1 mg/mL conbercept组细胞的迁移率明显下降（P<0.01，图3）。

2.4 TGF-β₂诱导HLEC-SRA01/04发生EMT过程

采用10 ng/mL TGF-β₂诱导HLEC-SRA01/04细胞24 h，倒置显微镜观察细胞形态发生变化，TGF-β₂组与未经TGF-β₂处理的对照组相比，细胞由原来的椭圆形变成长梭形（图4）。与未经TGF-β₂刺激的对照组相比，实验组的HLEC-SRA01/04上皮细胞标志物E-cadherin mRNA表达水平降低（P<0.05），间质细胞标志物Snail、α-SMA mRNA表达增加（P<0.05，图5）。与对照组相比，实验组的HLEC-SRA01/04上皮细胞标志物E-Cadherin蛋白表达水平降低（P<0.05），间质细胞标志物Snail、α-SMA蛋白表达水平增加（P<0.05，图6）。

2.5 康柏西普对TGF-β₂诱导HLEC-SRA01/04的EMT影响

qRT-PCR和Western blotting检测结果表明，与对照组相比，10 ng/mL TGF-β₂组EMT上皮细胞标志物E-Cadherin的mRNA及蛋白表达水平下调（P<0.05），而间质细胞标志物α-SMA与Snail的mRNA及蛋白表达水平上调（P<0.05）；与10 ng/mL TGF-β₂组相比，TGF-β₂+conbercept组中E-Cadherin的mRNA及蛋白表达水平增高（P<0.05），而间质细胞标志物α-SMA与snail的mRNA及蛋白表达水平降低（P<0.05，图7、8）。

qRT-PCR检测康柏西普处理TGF-β₂诱导HLEC-SRA01/04的ECM基因表达的影响，结果发现：与对照组相比，TGF-β₂组的HLEC-SRA01/04细胞外基质FN1、collagenⅠ和collagenⅣ的转录水平表达增加（P<0.05）；与TGF-β₂组相比，conbercept+TGF-β₂组中FN1、collagen Ⅰ和collagen Ⅳ的转录水平表达降低（P<0.05，图9）。Transwell结果显示，相比于对照组，TGF-β₂组的LECs迁移能力增强（P<0.05）；与TGF-β₂组相比，TGF-β₂+conbercept组的细胞迁移能力减弱（P<0.05，图10）。

Fig.8　qRT-PCR for detecting mRNA expression of E-cadherin, α-SMA and Snail in HLEC-SRA01/04 treated with TGF-β₂ and conbercept. A: E-cadherin mRNA levels in cells treated with TGF-β₂ and conbercept for 24 h. B: FN1 mRNA levels in cells treated with TGF-β₂ and conbercept for 24 h. C: α-SMA mRNA level in cells treated with TGF-β₂ and conbercept for 24 h. At least 3 replicates were performed in each experiment. **P<0.01 vs control; ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001 vs TGF-β₂.

2.6 康柏西普通过TGF-β/Smad信号通路逆转 TGF-β₂诱导HLEC-SRA01/04发生EMT

采用10 ng/mL TGF-β₂诱导HLEC-SRA01/04 24 h，再加入康柏西普处理24 h，Western blotting检测总的Smad2/3及磷酸化的Smad2/3。结果发现，与对照组相比，TGF-β₂组LECs细胞中p-smad2/3表达量升高（P<0.01）；与TGF-β₂组相比，TGF-β₂+conbercept组细胞中的p-Smad2/3表达下降（P<0.01，图11）。

3 讨论

PCO是由于白内障术后残余的LECs沿后囊膜迁移、增殖、发生EMT，最终在后囊膜上形成混浊。目前临床上常用YAG激光后囊膜切开术治疗PCO，但并发症较多^［13］，因此人们把治疗PCO的希望寄托于药物。药物防治PCO的研究逐渐成为热点，但未发现某种药物既对PCO预防或治疗有良好疗效，又对眼内结构无毒副作用^［14］。近年来，玻璃体腔注射抗VEGF药物广泛用于临床，主要治疗湿性AMD和新生血管性眼部疾病，疗效及安全性显著^［15-17］。但目前的研究只关注VEGF在富含血管的组织中的作用，而忽略了它在非血管组织（如晶状体）中的作用。仅有部分研究证明了VEGF可能对LECs的增殖及迁移有影响 ^{［18， 19］}。有研究通过囊袋和细胞模型证实稀释上调了的超声乳化白内障手术后的生长因子可以降低PCO的发生率，而这些因子中就包括VEGF^［20］。有研究表明康柏西普在抑制视网膜色素上皮细胞ARPE-9细胞的增殖和迁移方面表现良好^［21］。而另有一种VEGF受体拮抗剂阿昔替尼也成功抑制了LECs FHL124细胞增殖^［20］。因此，抗VEGF药物治疗可能为预防PCO提供新方法。为了探讨康柏西普在PCO预防和治疗中的作用，本研究通过其对HLEC-SRA01/04增殖和EMT的影响，揭示了康柏西普在预防和治疗PCO中的作用潜力。

为探究康柏西普对HLEC-SRA01/04细胞增殖的影响，本研究首先通过MTT法检测HLEC-SRA01/04细胞的存活率。实验发现，在0.5~2 mg/mL浓度范围内，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，康柏西普抑制HLEC-SRA01/04细胞增殖的效果增强。随后，通过流式细胞术发现康柏西普可以诱导HLEC-SRA01/04细胞凋亡，且随着康柏西普浓度增加LECs的细胞凋亡率逐渐增加。目前普遍认为细胞凋亡是在基因的调控下细胞一种主动死亡的过程^［22］。我们的既往研究发现康柏西普可以通过抑制抑凋亡蛋白Bcl-2和促进促凋亡蛋白Bax的表达来促进LECs的凋亡，抑制LECs的增殖^［23］。但是本研究发现0.1 mg/mL康柏西普对LECs细胞存活率没有影响，但可以促进LECs的凋亡，推测是在此浓度下的康柏西普对LECs的增殖和凋亡达到了一种动态平衡，因此康柏西普没有影响LECs的存活率。为了筛选合适的康柏西普的浓度，我们进行了划痕实验，发现0.1 mg/mL的康柏西普可显著抑制LECs的细胞迁移能力。鉴于以上结果，本研究将0.1 mg/mL康柏西普用于后续TGF-β₂诱导HLEC-SRA01/04的实验中。

TGF-β在正常和病理条件下都是一种有效的EMT诱导剂，也是癌细胞EMT的促进剂^{［24， 25］}。既往研究中，TGF-β也被证明可以通过诱导LECs发生EMT，从而导致PCO的发生^［4］。而EMT是指由上皮细胞形态转化为成纤维细胞的过程。上皮细胞失去上皮细胞标志物（包括E-Cadherin）和表达间质细胞标志物（如α-SMA、FN、snail等）是EMT的主要特征^［26］。EMT的分子机制多样，其关键分子机制之一是上皮细胞之间的钙黏蛋白连接复合体主要组成部分E-Cadherin的缺失^［27］。目前已知多种E-Cadherin的转录抑制因子，其中包括Slug和Snail^［28］。Snail是参与EMT早期过程中最关键的转录因子，被认为在眼部纤维化疾病中发挥重要作用^［29］。在胚胎发育和肿瘤的进展中，锌指转录因子超家族成员的Snail参与调控TGF-β₂诱导的EMT。有研究证实抗VEGF药物可以减少乳腺癌中snail的表达，从而延缓肿瘤的转移^［30］。虽然本研究已经表明康柏西普具有抑制晶LECs增殖、迁移的作用，但康柏西普对TGF-β₂诱导LECs发生EMT的影响是不可知的。该研究首先使用10 ng/mL的TGF-β₂处理LECs，发现TGF-β₂通过上调FN、α-SMA、snail、I型胶原（collagen Ⅰ）和IV型胶原（collagen Ⅳ）等间质细胞标记物的表达水平和下调上皮细胞标志物E-Cadherin的表达水平，成功地诱导了LECs的EMT。随后，本研究运用0.1 mg/mL 康柏西普处理TGF-β₂诱导成功的LECs，发现FN、collagen Ⅰ和collagen Ⅳ的转录水平均下调。相应地，Snail蛋白和α-SMA的蛋白水平降低。本研究还发现康柏西普上调了E-Cadherin。这些结果足以证明康柏西普可能逆转了TGF-β₂诱导的LECs间充质功能，恢复了LECs的上皮功能。本研究推测康柏西普逆转LECs的EMT过程可能通过减少snail的表达。

LECs发生EMT的过程中涉及到很多种通路，其中TGF-β/Smad信号通路在PCO发生中起关键作用^［31］。其中，磷酸化的Smad2和Smad3结合形成Smad复合物后，转运至细胞核内与Smad4结合并形成共同通路型^［32］。在哺乳动物中，Snail为成纤维细胞中TGF-β早期Smad3依赖性靶点。有研究表明，黄芩苷可通过阻断TGF-β/Smad信号通路发挥抗纤维化作用^［33］。因此，TGF-β/Smad信号通路是减轻病理纤维化过程的潜在靶点，这也在本研究中得到了进一步证明。本研究表明康柏西普可以抑制TGF-β₂诱导LECs发生EMT过程；为观察康柏西普是否通过TGF-β/Smad通路来抑制LECs细胞的EMT，本研究又通过Western blotting实验发现康柏西普下调了p-Smad2/3的水平。而TGF-β信号通路被Smad2/3磷酸化激活，导致多种过程，如PCO上皮间质转化和器官纤维化^［1］。其主要机制可能是当其与受体结合时，TGF-β激活TGF-β/Smad信号通路并调节靶基因的表达^［34］。因此，本研究有理由认为康柏西普通过使TGF-β₂处理的LECs中的p-Smad2/3失去活性而逆转EMT。基于以上结果可以得出，康柏西普通过涉及TGF-β/Smad信号通路减弱LECs内转导过程。本研究已经证明康柏西普对HLEC-SRA01/04细胞株有抑制作用，但康柏西普在体内是如何调控LECs从而影响PCO生物学过程仍有待进一步研究。

综上所述，本研究首次揭示了康柏西普在PCO治疗中的潜在价值。这不仅为康柏西普通过促进LECs凋亡抑制LECs增殖提供了证据，也表明康柏西普可能通过阻断TGF-β/Smad途径来抑制TGF-β₂诱导的EMT。但EMT的调控中存在着复杂的相互作用，很难全面得出康柏西普在LECs增殖及分化过程中的全部机制，这有待于后续的进一步研究。

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基金资助

安徽省高校自然科学重点项目(KJ2021A0341)

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