枸杞糖肽可减轻放射治疗后人牙龈成纤维细胞来源的外泌体导致的成骨抑制

Lycium barbarum glycopeptide reduces bone loss caused by exosomes derived from human gingival fibroblasts with radiation exposure

摘要

目的 研究枸杞糖肽（LbGP）对放射后人牙龈成纤维细胞（HGFs）来源的外泌体对成骨抑制的保护作用。 方法 将HGFs分为对照组、放射组及枸杞糖肽组，通过RT-qPCR、Western blotting及β-半乳糖苷酶染色检测细胞的凋亡、衰老水平以及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的差异表达。提取各组细胞分泌的外泌体，通过电镜观察、粒径分析以及Western blotting鉴定外泌体，并分别将各组牙龈成纤维细胞产生的外泌体作用于破骨前体细胞及骨髓间充质干细胞（BMSCs）中，通过Trap染色、茜素红染色、ALP染色、RT-qPCR以及Western blotting检测细胞的破骨及成骨情况。 结果 衰老细胞在放射组较对照组增多，而在枸杞糖肽组较放射组减少；与对照组相比，放射组Bcl-2/Bax降低（P<0.0001），α-SMA表达水平增加（P<0.05）；与放射组相比，枸杞糖肽组Bcl-2/Bax增多（P<0.05），α-SMA表达水平降低（P<0.01）；与对照组相比，放射组破骨细胞增多，枸杞糖肽组破骨细胞减少；钙结节、碱性磷酸酶表达水平在放射组低于对照组，在枸杞糖肽组高于放射组；成骨相关基因（BMP2、ALP、RUNX2）及成骨相关蛋白（ALP、RUNX2）的表达水平在枸杞糖肽组高于放射组（P均<0.01）。 结论 枸杞糖肽可通过作用于放射后的牙龈成纤维细胞的外泌体，有效抑制破骨、促进成骨和预防放射性颌骨骨髓炎的发展，这可能为放射性颌骨骨髓炎的治疗提供一种新策略。

Abstract

Objective To explore the protective effect of Lycium barbanun glycopeptide (LbGP) against osteogenic inhibition induced by exosomes derived from human gingival fibroblasts (HGFs) exposed to radiation. Methods Cultured HGFs with or without LbGP pretreatment were exposed to 8 Gy X-ray radiation, and the changes in cell apoptosis, senescence and α-SMA level were detected using RT-qPCR, Western blotting and β-galactosidase staining. The exosomes secreted by the treated cells were extracted, and after identification by electron microscopy, particle size analysis and Western blotting, the exosomes were added into primary cultured bone mesenchymal stem cells (BMSCs), and osteoclast activity and osteogenesis in the cell cultures were detected by Trap staining, Alizarin red staining, ALP staining, RT-qPCR and Western blotting. Results In cultured HGFs, X-ray radiation significantly increased the percentage of senescent cells, which was obviously lowered by LbGP treatment. X-ray radiation significantly reduced Bcl-2/Bax ratio and increased α-SMA expression in HGFs, and these changes were significantly suppressed by LbGP pretreatment. In rat BMSCs, incubation with the exosomes derived from HGFs with radiation exposure caused a significant increase of osteoclasts, reduced calcium nodules and lowered alkaline phosphatase expression in the cells; The opposite changes were observed in the cells treated with exosomes from LbGP-pretreated HGFs, which also significantly increased the cellular expressions of the osteogenic genes (BMP2, ALP, and RUNX2) and proteins (ALP and RUNX2) as compared with the exosomes from irradiated HGFs. Conclusion LbGP can effectively inhibit osteoclast activity and promote osteogenesis by acting on exosomes secreted by irradiated HGFs, suggesting its potential value for treatment of osteoradionecrosis of the jaw.

Graphical abstract

关键词

枸杞糖肽 / 外泌体 / 放射性颌骨骨坏死 / 成骨分化

Key words

Lycium barbarum glycopeptide / exosomes / osteoradionecrosis of the jaw / osteogenic differentiation

放射性颌骨骨髓炎（ORNJ）是头颈部放射治疗的晚期并发症，通常在放射后数月至数年发生^{［1， 2］}。患者临床表现为颌骨暴露、张口受限、病理性骨折，常伴有口干症、疼痛和恶臭^［3］，并且通常伴随全身慢性消耗性疾病，主要表现为消瘦及贫血，甚至可能危及生命^［4］。早期的ORNJ患者主要采取保守治疗，包括应用抗生素和消炎药、超声治疗和高压氧治疗；而晚期患者需要手术切除，如清创术、死骨切除术、下颌节段切除术和无骨皮瓣重建术^{［2， 5， 6］}。但目前的治疗预后均不理想。

人牙龈成纤维细胞（HGFs）是牙周微环境中最丰富的成分，它的激活和失调是ORNJ进展的关键，特别是与放射治疗相关的拔牙诱导骨坏死的进展^［7］。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化能力，并且具有直接分化为成骨细胞的能力，有助于促进骨再生，这些特性使得BMSCs成为治疗ORNJ中较为优先的选择^［8］。

外泌体具有促进伤口愈合、血管生成、免疫调节和骨再生等能力^［9］。外泌体在表面含有一些生物标志物，如Tsg101、CD81等，外泌体内载有多种生物活性成分，包括DNA、miRNA、lncRNA、cricRNA、mRNA、蛋白质和生物活性脂质^［10］。这些生物活性成分可通过外泌体进入受体细胞，调节局部微环境，激活信号通路，在细胞间通讯中发挥关键作用^{［11， 12］}。然而，外泌体在ORNJ中的作用仍未可知。

枸杞糖肽（LbGP）是从中药药材枸杞中分离纯化得到的具有较强免疫调节性、抗衰老及神经保护作用的糖缀合物，是枸杞中含量最丰富、也是最重要的活性化合物^［13］。LbGP在抗纤维化、增强免疫系统功能、抗炎、抗氧化等方面发挥着重要的作用^［14-16］，有研究证明LbGP可以影响妊娠期糖尿病小鼠外泌体的miRNA表达^［17］。但LbGP在ORNJ中对外泌体的影响及对ORNJ是否发挥保护作用尚未明确。

因此，本文研究LbGP对放射后HGFs来源的外泌体（IR-HGFs-Exo）对成骨抑制的保护作用，这可能为预防ORNJ提供一种新策略。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

枸杞糖肽（宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司）；CCK-8试剂盒（北京兰杰柯科技有限公司）；DMEM高糖培养基（Solarbio）；0.25胰蛋白酶（Hyclone）；茜素红染液（Sigma）；ALP染色试剂盒（CTCC BIOSCIENCE）；Trap染色试剂盒（杭州炀明生物技术有限公司）；IgG-HRP抗体（Huabio）；GAPDH抗体（Huabio）；胎牛血清（FBS）（Gibco）；PBS缓冲液（Hyclone）；总RNA提取试剂盒（上海飞捷公司）；5×Hiscript Ⅲ qPCR Supermix及2×Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术）；PKH26（Umibio）。

1.1.2 主要仪器

PCR仪（Applied Biosystems）；实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems ）；SDS-PAGE 电泳仪（BioRad）；电泳槽（BioRad）；化学发光凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；多功能酶标仪（杭州奥盛仪器有限公司）；冷冻离心机（杭州奥盛仪器有限公司）；Esco ARIstream®A2型二级生物安全柜（艺思高科技有限公司）；二氧化碳培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）；倒置显微镜（Olympus）；超速离心机（BECKMAN COULTER）。

1.2 方法

1.2.1 细胞的提取、培养和鉴定

新鲜人类牙龈取自四川省人民医院口腔科。收集25周岁以下患者的智齿或者18周岁以下患者的正畸牙，用预冷的15%双抗DMED培养基（5 mL）收集牙龈，用预冷的1%双抗DMED培养基反复冲洗，使用无菌手术器械将牙龈剪碎，配置终浓度为3 mg/mL的I型胶原酶，37 ℃消化1~2 h后离心，用5 mL含有10%胎牛血清的完全培养基重悬组织并接种至培养皿中，置于37 ℃、5%CO₂孵育箱内培养，3 d/次换液，7~14 d后，细胞沿组织块周围爬出，呈放射状生长，当细胞融合率达到约90%时，进行细胞传代培养。本研究中所有实验均在第5代前使用原代细胞培养。使用免疫组化染色鉴定HGFs。

从大鼠骨髓中提取BMSCs并在补充有10%胎牛血清和5%青霉素/链霉素的DMEM低糖培养基中培养。培养方法同HGFs。使用流式细胞术鉴定BMSCs。

1.2.2 细胞分组及放射诱导细胞损伤模型构建

HGFs以1×10⁵/孔接种于6孔板，设置分组：对照组、放射组及枸杞糖肽组。对照组不加LbGP溶液预处理，也不接受放射处理，放于照射室外同等环境下；放射组只接受放射处理；枸杞糖肽组提前用LbGP溶液处理细胞24 h后，再进行放射处理。各组孵育箱外放置时间相同。X射线放射（IR）使用医用电子直线加速器，放射距离为100 cm，场大小为20 cm×20 cm。放射剂量为8 Gy，速率为6 Gy/min。放射后迅速将细胞重新置于孵育箱继续培养。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色

β-半乳糖苷酶染色用于检测细胞衰老情况。将HGFs以1×10 ⁵/孔接种于6孔板，按照1.2.2处理细胞后24 h吸弃细胞培养液，PBS洗涤1次，加入1 mL β-Gal固定液，室温固定15 min。吸弃固定液，PBS洗涤3次，3 min/次，按照比例配置染色工作液，加入1 mL/孔染色工作液，37 ℃孵育过夜，光学显微镜下观察。

1.2.4 外泌体分离和鉴定

在110 000 g和4 ℃下过夜，离心从FBS中去除外泌体。使用α-DMEM和10%无外泌体的FBS制备不含外泌体的培养基。待细胞放射后，立即将上清液替换为不含外泌体的培养基。培养24 h后，从培养的HGFs中收集上清液。以1000 g/min离心10 min去除细胞碎片，然后以10 000 g/min离心30 min去除细胞碎片、脂质体等，将上清液通过0.22 mm过滤器过滤。在100 000 g/min超速离心70 min后，得到的沉淀物就是外泌体。在PBS中重悬后，将外泌体储存在-80 ℃。通过透射电子显微镜（TEM）分析外泌体直径。通过粒径分析仪确定外泌体的大小分布。通过蛋白印迹分析检测外泌体表面标志物。

1.2.5 外泌体内吞实验

首先用PKH26标记外泌体，在避光条件下，用Diluent C将PKH26 linker储存液稀释10倍，配制浓度为100 μmol/L的染料工作液，在1000 μg外泌体中加入200 μL工作液，通过涡旋振荡器混匀1 min，静置10 min后加入10 mL PBS，利用差速离心法再次提取外泌体以去除多余的染料，200 μL PBS重悬染色后的外泌体。将PKH26标记后的外泌体加入BMSCs中，24 h后固定细胞，PBS清洗3次，10 min/次，加入1 mL/孔 0.5%Triton X-100室温透化5 min。PBS清洗3次，10 min/次，加入400 μL/孔 Phalloidin室温避光孵育30 min。PBS清洗3次，5 min/次，DAPI室温染色5 min，PBS清洗3次，5 min/次，取出爬片，倒扣在载玻片上。共聚焦显微镜用于成像。

1.2.6 破骨细胞的培养

配置混合培养基，将FBS和P/S加入α-MEM培养基，搅拌均匀。取大鼠长骨，去掉两端关节，将骨干部位放入无菌细胞培养皿，利用注射器内的细胞培养液将骨髓冲出，1200~1400 r/min离心5~7 min，弃上清，用新鲜培养液将细胞打散，并将细胞接种于培养皿，37 ℃，5%CO₂孵育过夜后收集细胞，1400 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μL ACK buffer重悬细胞90 s，加入10 mL PBS，1400 r/min离心5 min，弃上清，10 mL培养基重悬细胞，并将细胞以1×10⁵/孔接种于24孔板，加入20 μL/孔 M-CSF，并分别加入对照组、放射组、枸杞糖肽组HGFs分泌的外泌体。第2天，加入1 μL/孔浓度为40 ng/μL的RANKL，并在37 ℃，5%CO₂下孵育3 d，然后更换培养基，加入20 μL/孔 M-CSF和1 μL RANKL。

1.2.7 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（Trap染色）

使用Trap染色试剂盒，并根据说明书配置染色液，将2.5 μL溶液2、2.5 μL溶液3在室温下混合2 min，将18 μL溶液4加入230 μL ddH₂O，并将上述两种混合液混合在一起即染色液。吸弃培养基，PBS荡洗1次，加入100 μL/孔溶液1固定细胞30 s。吸弃溶液1，PBS荡洗1次。加入染色液250 μL/孔，37 ℃孵育1 h，吸弃染色液，加入500 μL/孔 PBS，光学显微镜下观察并拍照。

1.2.8 茜素红染色

将BMSCs以1×10⁵/孔接种于6孔板，分别将对照组、放射组、枸杞糖肽组HGFs分泌的外泌体加入BMSCs，添加成骨诱导培养基，每48 h更换1次，在骨向诱导21 d后，对细胞进行茜素红染色。吸弃培养基，PBS荡洗2次，4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.1%茜素红染液于37 ℃染色15 min。PBS荡洗2次清除多余的染液。光学显微镜下观察并拍照。

1.2.9 碱性磷酸酶染色（ALP染色）

将BMSCs以1×10⁵/孔接种于6孔板，分别将对照组、放射组、枸杞糖肽组HGFs分泌的外泌体加入BMSCs，添加成骨诱导培养基，每48 h更换1次，骨向诱导7 d后，对细胞进行ALP染色，根据说明书，取40 μL染色试剂A加入到1 mL反应缓冲液中，混匀，再加入40 μL染色试剂B混匀，配成反应工作液。吸弃细胞培养基，PBS静置2次，加入2 mL/孔固定液，荡洗2次。加入反应工作液体2 mL，于37 ℃染色30 min，加入洗涤液2 mL/孔，洗涤2次。光学显微镜下观察并拍照。

1.2.10 RT-qPCR检测

使用RNA提取试剂盒提取总RNA，使用逆转录试剂盒进行逆转录反应，按照HiScript® Ⅲ RT SuperMix for qPCR试剂盒（三步法）说明书来配制逆转录体系，逆转录获取cDNA后，按一定比例混合染料、引物（表1）、ddH₂O后进行上机检测。将BMSCs以1×10⁵/孔接种于6孔板中，分别将对照组、放射组、枸杞糖肽组HGFs分泌的外泌体加入BMSCs，在细胞成骨诱导7 d后，RT-qPCR 检测成骨相关因子BMP2、ALP、RUNX2的表达，选取GAPDH作为内参。通过比较Ct值法（2^－△△Ct法）计算各RNA表达值，利用内参将数据进行标准化校正。

1.2.11 Western blotting检测

用RIPA冰上裂解细胞，使用BCA试剂盒进行蛋白定量、100 ℃水浴10 min煮沸蛋白至变性，取25 μg蛋白质进行12.5%SDS-PAGE 80 V恒压电泳30 min，120 V恒压电泳60 min，300 mA转膜80 min，5%脱脂奶粉溶液封闭液常温孵育1 h；按比例分别稀释一抗（Bax、Bcl-2、α-SMA、CD81、Tsg101、ALP、RUNX2），放置于摇床上，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次轻柔荡洗10 min；按照1∶50 000稀释二抗，常温下孵育1 h，TBST荡洗3次10 min后发光显影，采用Imege J软件进行样品条带灰度值的定量分析。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Pris进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组间差异比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义，统计图采用GraphPad Prism软件绘制。

2 结果

2.1 HGFs的鉴定

光学显微镜观察细胞生长形态（图1Aa），胞体呈长梭形或星形；免疫组化染色显示（图1Ab、Ac），细胞胞浆内抗波形蛋白抗体染色呈黄色或棕黄色，为阳性表达；抗细胞角蛋白8抗体染色为阴性表达。表明提取的细胞为HGFs。

2.2 BMSCs的鉴定

光学显微镜观察生长形态（图1Ba），细胞大多呈长梭型，细胞融合后呈“漩涡状”排列；流式细胞术结果显示（图1Bb），阳性表面标记物CD29表达量为97.5%、CD90表达量为98.3%，均为阳性表达，阴性表面标记物CD45表达量为0.34%，为阴性表达，进一步验证培养出的细胞为BMSCs。

2.3 枸杞糖肽可抑制放射导致的牙龈成纤维细胞衰老、凋亡以及肌成纤维化

β-半乳糖苷酶染色显示（图2A），放射组衰老细胞多于对照组，枸杞糖肽组衰老细胞较放射组明显减少。Western blotting结果显示，Bcl-2/Bax在放射组较对照组减少（P<0.0001），而枸杞糖肽组较放射组增加（P<0.05，图2B），放射组α-SMA的蛋白表达量高于对照组（P<0.05），枸杞糖肽组低于放射组（P<0.01，图2C）。

2.4 外泌体的表征

电镜结果显示，HGFs-Exo大多呈椭圆囊泡状（图3A）。粒径分析显示，外泌体粒径集中在60~100 nm，检测到的总颗粒数为5322个，30~150 nm的颗粒占总颗粒数的99.62%，平均粒径在76.63 nm（图3B），浓度为1.59E+10 Particles/m（图3C）。Western blotting检测发现，HGFs-Exo特异性表达Tsg101，CD81（图3D）。免疫荧光染色检测结果显示，在BMSCs中发现PKH26标记的HGFs-Exo，并且HGFs-Exo集中在胞浆，核周区域（图3E）。

2.5 IR-HGFs-Exo促进破骨分化，抑制成骨分化，LbGP-HGFs-Exo可减轻这种作用

破骨诱导分化后进行Trap染色（图4A），结果显示放射组破骨细胞明显较对照组增多，而枸杞糖肽组破骨细胞明显较放射组减少。茜素红染色结果显示（图4B），钙结节在放射组低于对照组，而在枸杞糖肽组高于放射组；ALP染色检测其对早期成骨的影响显示（图4C），放射组碱性磷酸酶明显较对照组减少，而枸杞糖肽组碱性磷酸酶水平明显较放射组增加。

RT-qPCR检测成骨相关因子BMP2、ALP、RUNX2的表达水平（图5A），结果表明，放射组中的成骨相关因子表达水平低于对照组（P<0.05），而枸杞糖肽组中成骨相关因子表达水平高于放射组（P<0.01）。Western blotting检测成骨相关蛋白ALP、RUNX2的表达水平，结果显示枸杞糖肽组中成骨相关蛋白表达水平明显高于放射组，差异具有统计学意义（P<0.001，图5B）。

3 讨论

ORNJ是放射治疗头颈部恶性肿瘤的常见严重并发症^［18］。放射诱导纤维萎缩学说是解释其发病机制的主要理论之一^［19］，该学说认为辐射可导致成骨细胞死亡，抑制成骨细胞增殖、促进肌成纤维细胞增殖，导致纤维组织取代骨组织，最终导致骨坏死^［20］。在ORNJ过程中，随着骨基质逐渐转化为纤维组织，成纤维细胞起着决定性作用^［21］，HGFs是牙周组织成分中最丰富的细胞，参与各种类型的间充质细胞和上皮细胞的通讯^［22］。BMSCs是骨再生进程中非常重要的种子细胞，在骨再生中发挥着重要作用^［23］。有研究发现，ORNJ中BMSCs是受损的主要细胞之一，放射可抑制增殖、导致DNA损伤以及抑制其成骨分化能力^［24］。而对于BMSCs骨向分化能力的保护有利于ORNJ的恢复^［1］。因此，HGFs和BMSCs与ORNJ密切相关，然而，放射后HGFs与BMSCs的调节关系尚不清楚。LbGP已被证明具有抗凋亡、骨保护和软骨保护的作用^［25］。有研究证明，枸杞多糖通过抑制细胞凋亡和下调bax的表达来保护ARPE-19细胞免受高血糖的影响^［26］，枸杞多糖可通过靶向BMPRIA/BMPRII/Noggin调节骨形成^［27］，LbGP可通过靶向ERK1/2信号通路促进hPDLSC成骨^［28］。因此，本实验旨在探究LbGP是否可以作为辐射保护药物保护正常放射细胞，并探索其保护机制。

本研究探索了LbGP对辐射后HGFs的影响，证明辐射可以激活HGFs，使其肌成纤维化，并且可以导致HGFs衰老和凋亡。LbGP可以显著减少放射处理后HGFs的衰老和凋亡，体现为衰老细胞数量减少、Bcl-2/Bax比例增加。此外，LbGP还能够抑制放射后HGFs的肌成纤维化，表现为α-SMA蛋白表达水平的下降。这些结果表明，LbGP具有抗衰老和抗凋亡的作用，并有助于降低颌骨纤维化的风险。由于外泌体内包含大量RNA，蛋白质和miRNA，其相对稳定的脂质双层结构可以有效维持其负载内容物的活性，在调节细胞行为方面具有重要生物学效应^［29］。有研究证明，外泌体与骨组织之间关系密切，人类脂肪干细胞的外泌体已显示出修复骨缺损的有效作用潜力^［30］。有研究发现，放射激活成纤维细胞释放的外泌体抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化^［7］，这可能与ORNJ有关。为进一步研究HGFs对破骨前体细胞和BMSCs骨向分化的影响，我们分别提取了对照组、放射组以及枸杞糖肽组HGFs分泌的外泌体，并分别作用于破骨前体细胞和BMSCs中，本实验发现，与放射组相比，LbGP-HGFs-Exo作用于破骨前体细胞时，Trap染色显示破骨细胞数量显著减少，表明LbGP-HGFs-Exo能够抑制破骨分化。同时，LbGP-HGFs-Exo作用于BMSCs时，通过茜素红染色和ALP染色观察到钙结节形成增多，碱性磷酸酶活性增强，表明成骨分化能力得到提升。进一步通过RT-qPCR和Western blotting检测发现，LbGP-HGFs-Exo能够促进成骨相关基因（BMP2、ALP、RUNX2）和蛋白（ALP、RUNX2）的表达，从而促进成骨分化。

综上所述，LbGP不仅能够减轻放射导致的HGFs损伤，减少其肌成纤维化，还能通过调节IR-HGFs-Exo，有效抑制破骨细胞分化，促进成骨细胞分化，这为防治ORNJ提供了新的策略。LbGP影响外泌体的具体机制仍需进一步深入研究，以明确其在信号传导通路上的作用。

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