电针预处理通过抑制NF-kB/NLRP3信号通路介导炎症和凋亡改善大鼠脑卒中后痉挛

Electroacupuncture pretreatment alleviates post-stroke spasticity in rats by inhibiting NF‑κB/NLRP3 signaling pathway-mediated inflammation and neuronal apoptosis

摘要

目的 探讨电针预处理诱导NF-κB/NLRP3信号通路及炎症和凋亡在脑卒中后挛治疗中的潜在机制。 方法 SPF级雄性SD大鼠18只随机分为：假手术组（sham），模型组（I/R），电针治疗组（I/R+EP），每组6只。假手术组仅暴露不做阻塞，模型组进行中动脉闭塞模型，电针组使用电针治疗曲鬓穴和百会穴，持续治疗3 d。采用HE、Nissl、TUNEL染色检测大鼠脑组织病理变化情况。ELISA法检测各组IL-4、IL-6、TNF-α、TMAO的水平变化情况。采用qRT-PCR、Western blotting和免疫组化检测NF-κB p65、NLRP3、caspase-3、caspase-9 mRNA和蛋白水平。 结果 与假手术组相比，模型组的神经功能评分增加（P<0.05），肌张力增增加（P<0.05），新事物识别时间减少（P<0.05），海马细胞排列不均、松散和轮廓不清晰（P<0.05），细胞凋亡数量显着增加（P<0.05），促炎因子IL-6和TNF-α，NF-B p65、NLRP3、caspase-3和caspase-9水平上升（P<0.05）。与模型组相比，电针治疗组神经功能评分下降，肌张力评分下降，新事物识别时间增加（P>0.05），海马细胞排列紧密规则，染色均匀，轮廓清晰（P<0.05），活神经元数量增加（P<0.05），细胞凋亡明显减少（P<0.05），促炎因子IL-6和TNF-α水平下降，抑炎因子IL-4水平上升（P<0.05）。此外，电针治疗抑制了脑组织中NLRP3、caspase-3、caspase-9和NF-B p65的表达（P<0.05）。 结论 电针预处理有助于缓解大鼠脑卒中后痉挛，这是因为它阻断了NF-B/NLRP3通路，抑制炎症反应和细胞凋亡。

Abstract

Objective To explore the mechanism of electroacupuncture pretreatment (EP) for relieving post-stroke spasticity in rats. Methods Eighteen rats were randomized equally into sham-operated group, middle cerebral artery occlusion (MCAO) group, and MCAO+EP group. In MCAO+EP group, the rats received electroacupuncture at the acupoints Qubin and Baihui for 3 consecutive days prior to MCAO. Neurological deficits and cognitive function of the rats were evaluated, and pathologies in the hippocampus were examined using HE, Nissl, and TUNEL staining. The expressions of IL-4, IL-6, TNF‑α, and TMAO in the brain tissues were detected with ELISA, and the mRNA and protein expression levels of NF-κB p65, NLRP3, caspase-3, and caspase-9 were determined with qRT-PCR, Western blotting, and immunohistochemistry. Results The rats receiving MCAO had significantly increased neurological deficit scores and showed increased muscle tension, number of apoptotic neurons, and expressions of IL-6, TNF-α, NF-κB p65, NLRP3, caspase-3 and caspase-9 in the hippocampus and significantly reduced length of time for new object recognition. Microscopically, the cells in the hippocampus of the MCAO rats showed uneven and loosened arrangement and unclear cell boundaries. In contrast, the rats in I/R+EP group showed significantly lowered neurological deficit scores and dystonia rating scores, reduced cell apoptosis, lowered hippocampal expressions of IL-6, TNF-α, caspase-3, caspase-9, and NF‑κB p65, increased time for new object recognition, tightly arranged and uniformly stained hippocampal cells with clear boundaries, with also an increased number of active neurons and enhanced expression of IL-4 in the hippocampus. Conclusion EP alleviates post-stroke spasticity in rats by inhibiting inflammatory responses and hippocampal neuronal apoptosis mediated by the NF-κB/NLRP3 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

脑卒中后痉挛 / 电针预处理 / NF-κB/NLRP3信号通路 / 炎症反应 / 细胞凋亡

Key words

spasticity after stroke / electroacupuncture / NF-κB/NLRP3 / inflammatory response / apoptosis

脑卒中的原理是脑供血不足，其特点是发病率、死亡率和致残率高。卒中后痉挛是卒中致残率高的主要原因。大多数中风患者都有不同程度的神经功能障碍，包括失语、偏瘫和痉挛，后者是最常见的后遗症，也是脑卒中后致残的主要原因^［1］。因此，制定有效的策略来避免中风后的痉挛是至关重要的。

电针治疗是一种将毫针刺激与电生理效应结合的治疗方法，具有强度可调、频率可调、量化方便等优点^［2］。电针预处理是对传统中医疾病预防理论的延伸和发展。针灸有助于促进经气的运动，疏通经络，平衡阴阳，增强正气，抑制邪气，从而预防疾病^［3］。电针预处理对内源性大麻素系统、自噬、细胞凋亡、氧化应激、内质网应激、兴奋毒性和炎症反应等多种因素和途径具有神经保护作用^［4］。我们的前期研究结果表明电针预处理可调节炎症因子TNF-α和IL-10动态平衡、降低Bax/Bcl-2比来减轻细胞凋亡的程度、下调TLR4和NF-κB蛋白表达来降低炎性损伤等，证实了电针预处理对脑出血再灌注损伤具有缓解作用^［5-7］。在脑卒中后，偏瘫通常比痉挛先发生。偏瘫是脑卒中导致的直接神经损伤结果，而痉挛是偏瘫后可能出现的继发性并发症。电针预处理在缺血性脑卒中后痉挛的治疗中已被证明是有效的^［8］。电针预处理具有缩小脑梗死体积、减轻脑水肿及降低神经功能损伤等作用，但这种保护机制有待进一步阐明。

NF-κB p65/NLRP3信号通路在卒中后损伤中起关键作用，抑制NF-κB p65/NLRP3信号通路可以减缓脑缺血再灌注损伤，Xie等^［9］报道了TRIM14对脑缺血再灌注损伤的保护作用机制主要依赖于抑制NF-κB p65/NLRP3信号通路调控抗细胞凋亡和抗炎作用。因此，本研究旨在探究NF-κB p65/NLRP3信号通路是否在卒中后痉挛中起关键作用，电针预处理能否通过调控NF-κB p65/NLRP3信号通路，抑制炎症反应和细胞凋亡来预防卒中后痉挛。这为具有遗传性高血压患者及卒中后康复患者预防卒中后痉挛提供临床基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

购买SPF级6~8周龄雄性SD大鼠36只，体质量230~270 g，动物合格生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。本研究已通过江西中洪博元生物技术有限公司伦理委员会审定研究方案（伦理批号：2021052802）。饲养条件：温度20~26 ℃，湿度：40%~70%，自由进食和饮水。

1.2 主要试剂和器械

Trizon Reagent、Ultrapure RNA 超纯RNA提取试剂盒、DAB显色试剂盒（CWBIO）；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）；大鼠IL-4 ELISA试剂盒、大鼠IL-6 ELISA试剂盒、大鼠TNF-α ELISA试剂盒（酶免生物）；NLRP3、Caspase-9（Affinity）；Caspase-3、NF‑κB p65（Proteintech）；辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠IgG（H+L） （碧云天）；苏木素染液、伊红染色液、Scott蓝化液（Solarbio）；TUNEL染色试剂盒（Beyotime）等。电针仪（上海）；电泳仪、酶标仪（北京六一）；全自动振动刀片切片机（Leica）；光学显微镜（Olympus）等。

1.3 分组造模

将实验鼠分为假手术组、模型组、电针组3个组，6只/组，模型组和电针组进行大鼠脑卒中后痉挛模型构建，大鼠称质量后按320 mg/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉。将完全麻醉的大鼠剃去颈部鼠毛并消毒颈部皮肤。分离颈动脉：于颈部中线用手术刀做一平滑切口，钝性分离大鼠右侧胸锁乳突肌及颈部肌群，暴露出右侧颈总动脉，剥离血管至三叉处，暴露颈内动脉及颈外动脉，注意避免损伤迷走神经。结扎劲动脉：分别结扎右侧颈总动脉和颈外动脉近心端，用血管夹夹闭颈内动脉。插入线栓：于距三叉1 cm处的左侧颈总动脉上剪一小切口。将线栓顺着血管经颈内动脉进入脑中阻塞脑中动脉血流，阻塞2 h后拔栓，术后注射庆大霉素预防感染。假手术组仅暴露不做阻塞，缝合颈部皮肤消毒。将大鼠转移至恒温毯上，待大鼠完全苏醒后转移至干净鼠笼中^［10］。

1.4 干预方法

造模前3 d，给予电针治疗百会穴（DU20）和曲鬓穴（GB7）。采用0.3 mm×25 mm针。将大鼠置于实验用大鼠固定器内，采取直刺进针法，入针点为百会穴、曲鬓穴，进针5 mm。将针柄连接电针仪，百会穴、曲鬓穴连接一对电极（频率20 Hz，电流1~2 mA），每次电针治疗30 min，1次/d，连续治疗3 d^［10］。其他组大鼠同等条件抓取，不给予任何干预。

1.5 Zea Longa 神经功能缺损评分检测大鼠神经功能

干预3 d结束后，第4天开始检测，采用Zea Longa神经功能缺损评分。^［11］评价大鼠神经功能：0分：未发生神经功能缺损，活动正常；1分：轻度神经功能缺损，不能完全伸展患侧前爪；2分：中度神经功能缺损，爬行时向患侧转圈；3分：重度局灶性神经功能缺损，行走时身体向患侧倾斜；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.6 改良 Ashworth 肌张力分级检测大鼠肌张力

参照改良 Ashworth 肌张力分级进行肌张力评定^［12］。分级越高提示肌张力越高、痉挛程度越严重，具体评定标准如下。0 级：无肌张力增高，活动正常；1 级：轻度肌张力增高，肢体屈伸过程中出现一过性停顿；2 级：明显肌张力增高，但肢体尚易屈伸，轻度共济失调；3 级：明显肌张力增高，肢体被动活动困难，中度共济失调；4 级：肢体屈伸受限，重度共济失调。

1.7 大鼠新物体识别（NOR）记忆再巩固

在训练期，试验箱中放A、B两个形状、大小、颜色完全一样的物体，将大鼠背朝两物体放入试验箱，让其熟悉5 min，并记录其与两物体接触的情况。1 h后为测试期，换掉一个物体，再将大鼠从原来放入的位置放入试验箱，记录小鼠5 min内对新旧物体的接触情况。在检测阶段，分别记录大鼠对熟悉物体与新物体的探究时间，计算辨别指数以评估记忆能力计算公式为：辨别指数=（新物体探究时间-旧物体探究时间）/（新物体探究时间+旧物体探究时间）×100%。计算大鼠对熟悉物体与新物体两物体总探究时间以评估其探究动机^［13］。

1.8 HE染色

干预结束后的第2天，大鼠腹腔注射过量戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉后，冰上断头后迅速取全脑组织。取海马组织、大脑皮层组织经生理盐水冲洗后，将海马组织浸入4%多聚甲醛中固定24 h后，依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，纯酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（至透明为止）。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15 min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50~60 min。石蜡包埋，切片（4 μm）。将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返蓝液返蓝15 s，流水冲洗，伊红染色3 min，流水冲洗，脱水，透明，封片，镜检。

1.9 Nissl染色

脑组织固定24 h后，不同浓度乙醇梯度脱水，二甲苯染色透明，石蜡包埋固定，切片（厚度5 μm），脱蜡至水，加入 Nissl 染色液，37 ℃染色30 min，水洗后风干，二甲苯透明，显微镜下观察染色结果。

1.10 TUNEL染色

脑组织固定24 h后，不同浓度乙醇梯度脱水，加入5%H₂O₂后静置5 min，加入蛋白酶 K，室温孵育30 min，加入 TUNEL 液孵育1 h，3%BSA孵育20 min，POD转换液反应30 min，DAB 显色后苏木素复染。置于显微镜下观察染色结果，计算凋亡指数。凋亡指数（%）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.11 ELISA法测定大鼠脑组织IL-4、IL-6、TNF-α水平

用冷生理盐水将大鼠脑组织匀浆，4 ℃ 4000 r/min离心15 min，收集上清。根据ELISA试剂盒说明书方法依次操作，酶标仪检测450 nm 处吸光度值，计算大鼠脑组织中 TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.12 免疫组织化学检测

石蜡组织切片通过预处理脱蜡后，置于修复盒中，加入抗原修复液（柠檬酸缓冲液），高压锅加热到自动放气，2 min后离开热源自然冷却，弃去抗原修复液，将切片用PBS淋洗；紧接着将切片移入湿盒中，加入新鲜配制的3%双氧水，以去除内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10 min，用PBS充分淋洗；接着再用PBS浸洗玻片3次，5 min/次，吸水纸吸干组织周围的PBS，在玻片上滴加5%BSA，37 ℃封闭30 min；吸除组织周围的封闭液后，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗（种属均为大鼠）：NLRP3（1∶300）、NF-κB p65（1∶300）、caspase-3（1∶300）、caspase-9（1∶200），置于湿盒中4℃孵育过夜；次日取出4 ℃孵育过夜湿盒，室温静置45 min，PBS浸洗玻片3次，5 min/次，滴加辣根酶标记山羊抗大鼠IgG（H+L）（1∶100），37 ℃孵育30 min，PBS充分淋洗；通过DAB显色、苏木精复染、自来水冲洗后，最后封片、镜检。

1.13 qRT-PCR实验

用TRIzol试剂提取总RNA，用Hi-Fi cDNA Synthesis Kit逆转录为cDNA。qRT-PCR体系为20 μL，包括10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix、1 μL cDNA、上下游引物各0.4 μL和8.2 μL的ddH₂O。反应程序为95 ℃下进行10 min预变性，然后在进行40个循环：95 ℃变性10 s。58 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s；以β-肌动蛋白为内参，各引物的序列见表1［引物由通用生物系统（安徽）有限公司合成］。采用2^-△△Ct法进行相对定量分析，算出各组的相对表达量。

1.14 Western blotting检测

取-80 ℃保存的脑组织约0.2 g，剪碎，加入冰浴裂解液1 mL。离心后取上清，BCA法测定蛋白质浓度。将40 μg总蛋白上样、电泳2 h后转膜、封闭。分别加入一抗NLRP3（1∶500）、NF-κB p65（1∶500）、caspase-3（1∶500）、caspase-9（1∶500）在4 ℃过夜孵育及对应二抗（1∶3000），室温孵育1 h，加入ECL发光试剂，反应1 min后在暗盒内加X光片曝光1 min，显影5 min，定影5 min。应用自动电泳凝胶成像分析仪分析蛋白条带的强弱，蛋白表达水平以积分光密度值表示。

1.15 统计学方法

应用SPSS 20.0软件进行统计分析，定量结果采用均数±标准差表示。两组之间比较采用独立样本T检验，多组之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。检验水准α=0.05，统计图使用GraphPad Prism 8绘制。

2 结果

2.1 电针预处理可减轻脑卒中后痉挛大鼠神经学评分，肌张力评分和增强新物体识别评分

与假手术组比较，模型组的神经功能评分增高（P<0.05），肌张力增增高（P<0.05），新事物识别时间下降（P<0.05）；与模型组比较，电针预处理组的神经功能评分下降（P<0.05），肌张力增评分下降（P<0.05），增高新事物识别时间增加（P<0.05，图1）。

2.2 电针预处理可减轻脑卒中后痉挛大鼠脑内病理损害

假手术组大鼠海马细胞基本正常，无病理改变，染色均匀，排列整齐；模型组海马细胞排列杂乱、不紧密，不均匀，轮廓不清晰，多见核仁不清晰、胞浆消失；电针组海马细胞排列紧密规则，细胞染色较均匀，轮廓清晰（图2）。

假手术组未见明显病理改变，模型组，可观察到神经元固缩溶解，胞浆消失，胞体收缩，梗死区周围组织神经元和胶质细胞肿胀，神经细胞和血管周围间隙增大，电针组则较轻（图3）。

2.3 电针预处理对脑卒中后痉挛大鼠神经元的保护作用

与假手术组（24.34±1.78）相比，I/R模型组（13.18±2.20）Nissl阳性神经元明显减少，而电针治疗增加了Nissl阳性神经元的比例（19.77±1.46）（P<0.05，图4）。

2.4 电针预处理抑制脑卒中后痉挛大鼠脑内神经元凋亡

与假手术组比较，模型组和电针组的组织学分析表明脑缺血损伤导致脑组织中细胞凋亡数量增多（P<0.05）；与模型组比较，电针治疗抑制了细胞凋亡（P<0.05，图5）。

2.5 电针预处理减轻脑卒中后痉挛大鼠脑内炎症反应

与假手术组比较，模型组中促炎因子IL-6、TNF-α水平上升（P<0.05）。抑炎因子IL-4降低（P< 0.05）；与模型组比较，经过电针治疗后，大鼠脑组织中抑炎因子IL-4水平上升（P<0.05），促炎因子IL-6、TNF-α水平下降，TNF-α下降（P<0.05，图6）。

2.6 电针预处理可下调脑卒中后痉挛大鼠脑内NF-kB p65、NLRP3、caspase-3、caspase-9的表达

与假手术组比较，模型组的NF-κB p65、NLRP3、caspase-3和caspase-9蛋白表达均有所上升。与模型组比较，电针治疗后NF‑κB p65、NLRP3、caspase-3和caspase-9 蛋白表达均有所下降，但差异无统计学意义（P>0.05，图7）。

与假手术组比较，模型组NF‑κB p65、NLRP3、caspase-3和caspase-9mRNA表达均上升（P<0.05）。与模型组比较，电针治疗后NF-κB p65、NLRP3、caspase-3和caspase-9 mRNA表达和蛋白水平均下降（P<0.05，图8）。

3 讨论

痉挛性偏瘫是脑卒中后最常见的并发症之一，常表现为肌张力异常升高，若治疗不及时会引起痉挛性抽搐、肌肉萎缩等，严重影响患者的运动功能。脑卒中后肢体痉挛属于中医“筋痹”“经筋病”等范畴，其病因为阴阳经筋缓急失衡进而致使阳气受损，治疗原则应为调督通阳、温阳益气、解肌止痉^［14］。大量的临床资料证实了针灸治疗中风后痉挛的疗效，尽管确切的机制尚不清楚。目前电针治疗痉挛疗效的原因被认为是神经递质及其受体异常兴奋^［15］。针刺可通过阻断神经元凋亡和激活海马干细胞变性来减轻大鼠脑卒中后脑缺血损伤，促进突触重塑，上调突触相关因子α7nAChR，保护损伤的神经^［16］。此外，研究发现，督脉电针可调节大脑皮层谷胱甘肽抗氧化系统改善缺血性脑卒中后大鼠的肢体痉挛严重程度^［17］。其研究的机制与本研究的不同，但结果与本研究一致：电针预处理组的神经功能评分下降，肌张力评分下降，提示电针预处理可改善缺血性脑卒中后大鼠痉挛。

在脑缺血过程中，炎症细胞因子刺激内皮细胞导致白细胞浸润、毛细血管阻塞、细胞坏死和脑组织破坏。IL-6和TNF-α在缺血脑组织中显著上调，与脑组织损伤的严重程度呈正相关^［18］。IL-6和TNF-α属于促炎因子之一，TNF-α含量增高不仅可促进炎症部位血管扩张、血管壁通透性增加、趋化白细胞、发热、致痛及引起炎症部位组织损伤，导致炎症加重。因此，抑制IL-6和TNF-α可以减轻缺血脑区的炎症反应。针刺大椎、百会、仁中穴可成功降低血清TNF-α、IL-6、CRP、NOS水平，促进微循环，减少肌肉紧张，缓解痉挛^{［19，20］}。IL-4属于抗炎因子，炎症过程中抗炎因子与促炎因子在不同环节上相互作用、相互拮抗，发挥抑制炎症的作用^［21］。IL-4可调节T、B淋巴细胞分化、活化，促进以Th2细胞为特征的免疫应答，同时还通过抑制单核巨噬细胞产生TNF-α发挥抗炎作用^［22］。本研究用电针预处理I/R大鼠IL-4水平显著升高，TNF-α、IL-6水平显著下降。

NLRP3炎性小体是由NLRP3、接头蛋白-凋亡相关斑点样蛋白和效应分子半胱氨酸蛋白酶-1组成的多蛋白复合体，该复合物的活化能够促进炎性反应发生^［23］。NLRP3炎性小体在缺血性中风期间被激活，电针刺激曲池和足三里可抑制其有利于预防缺血性卒中引起的神经元细胞焦亡和行为障碍^［24］。Jiang等^［25］揭示了电针对脑卒中的神经元中保护依赖α7nAChR的抗炎和NLRP3炎症小体可能是潜在的治疗靶点。在脑缺血早期，氧自由基、促炎细胞因子等变量可特异性激活NF-κB通过上调IL-6、TNF-α等炎性细胞因子转运至细胞核，加速脑组织损伤^［26］。氯氰菊酯通过NF-κB信号通路诱导鲤鱼肝细胞的凋亡、自噬和炎症反应，NF-κB信号通路是调控细胞凋亡和存活的重要途径^［27］。脑缺血模型脑组织中凋亡细胞增多，炎症因子水平增加是加重卒中后痉挛行为的主要病理因素^［28］。Caspase-9、caspase-3是细胞凋亡过程中重要的调节蛋白，凋亡蛋白复合物诱导caspase-9前体自激活，进而激活caspase-3和细胞凋亡^［29］。Caspase-9前体也可以通过直接损伤细胞而被激活。被激活的caspase-3进一步激活了其他作为级联执行体的半胱氨酸蛋白酶，这些酶比那些作为引发体的酶更丰富，具有更强的催化能力。它们水解多种细胞内蛋白，在细胞凋亡中起执行作用^［30］。结果表明，痉挛大鼠脑组织中NLRP3、NF‑κB、caspase-3和caspase-9明显降低。电针预处理可以降低这种上调。因此，电针预处理可抑制NLRP3及NF-κB信号通路下游凋亡蛋白的激活，抑制炎症反应和细胞凋亡，缓解脑卒中后痉挛。

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