鼠曲草总黄酮通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX-4信号通路抑制肝细胞铁死亡缓解对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤

Total flavonoids of Salvia miltiorrhiza alleviate acetaminophen-induced acute liver injury in mice by suppressing hepatocyte ferroptosis via activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway

摘要

目的 基于网络药理学和实验验证探讨鼠曲草总黄酮对对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤（ALI）的保护作用及其机制。 方法 通过文献检索获取鼠曲草总黄酮的主要化学成分，使用多重数据库分析预测鼠曲草总黄酮的药理机制。动物实验验证：将36只SPF级小鼠分为空白对照组，APAP模型组，鼠曲草总黄酮低剂量组（100 mg/kg）、中剂量（200 mg/kg）、高剂量（400 mg/kg）组，阳性药物联苯双酯组（150 mg/kg），每组6只。通过大体标本与生化检查、HE染色、普鲁士蓝染色及分子生物学检查，评估鼠曲草总黄酮干预APAP诱导急性肝损伤的药效及药理机制。 结果 网络药理学结果显示，鼠曲草总黄酮调控APAP肝损伤的主要活性成分为槲皮素、木樨草素 、卡脲酸、山奈酚，GO功能富集分析得到GO条目632个，其中生物过程472个，细胞组成42个，分子功能条目118个。KEGG富集分析显示，鼠曲草总黄酮调节APAP肝损伤的通路主要涉及铁死亡相关信号通路。动物验证实验显示，鼠曲草总黄酮治疗组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶均降低（P<0.05），肝脏组织病理和炎症浸润均有所改善。鼠曲草总黄酮可减轻肝组织内铁沉积（P<0.05），改善脂质过氧化相关指标（P<0.05）；促进Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX-4蛋白表达，抑制keap1蛋白表达（P<0.05）。 结论 通过网络药理学和动物实验可推断鼠曲草总黄酮激活Nrf2/SLC7A11/GPX-4信号通路调控肝细胞铁死亡对APAP肝损伤起到预防和治疗的作用。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of total flavonoids of Salvia divinorum extract against acetaminophen (APAP)-induced acute liver injury (ALI) and its molecular mechanism. Methods The main chemical constituents of total flavonoids of Salvia divinorum were obtained through literature search, and their pharmacological mechanisms were predicted using bioinformatics analysis. In a mouse model of APAP-induced ALI, the protective effects of 100, 200 and 400 mg/kg total flavonoids of Salvia miltiorrhiza and 150 mg/kg bifidus were evaluated by observing changes in blood biochemistry and liver histopathology and detecting expressions of the key proteins in the Nrf2/HO-1 signaling pathway. Results Network pharmacology analysis suggested that the main active components in total flavonoids of Salvia divinorum for regulating APAP-induced liver injury included quercetin, lignocerol, caruric acid, and kaempferol, for which GO function enrichment analysis yielded 632 GO entries, including 472 involving biological processes, 42 involving cellular composition, and 118 involving molecular function. KEGG enrichment analysis showed that the total flavonoids of Salvia divinorum regulated APAP-induced liver injury mainly through ferroptosis-related signaling pathway. In mice with APAP-induced ALI, treatment with the total flavonoids significantly lowered ALT and AST levels, improved liver histopathology and inflammatory cell infiltration, reduced iron deposition in liver tissues, improved lipid peroxidation-related indexes, promoted the expressions of Nrf2, HO-1, SLC7A11, and GPX-4 proteins, and inhibited the expression of keap1 protein. Conclusion The total flavonoids of Salvia divinorum alleviate APAP-induced ALI in mice possibly by suppressing hepatocyte ferroptosis via activating the Nrf2/SLC7A11/GPX-4 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

鼠曲草总黄酮 / Nrf2/SLC7A11/GPX-4 / 铁死亡 / 网络药理学 / 急性肝损伤

Key words

total flavonoids of Salvia divinorum / Nrf2/HO-1 / ferroptosis / network pharmacology / acute liver injury

急性肝损伤（ALI）是指在短期内各种原因引起的肝功能异常改变的疾病。病毒、药物、化学制剂、免疫等是ALI的常见病因^［1］。对乙酰氨基酚（APAP）是一种常见的可引起急性肝损伤的药物，APAP有限剂量下是安全有效的，但使用过量或长期使用会引起不良反应，严重的会造成肝毒性甚至肝衰竭^［2］。过去N-乙酰对位苯醌亚胺导致的线粒体损伤被公认为是导致细胞凋亡与坏死的主要原因。但近年研究表明线粒体损伤导致的铁死亡也是APAP造成肝毒性的重要因素^［3］。铁死亡为研究APAP诱导的ALI提供了新的靶点与方向^［4］。目前，靶向铁死亡治疗APAP诱导的ALI鲜有研究，且现有治疗APAP所导致的ALI的药物治疗效果欠佳。

中医药在临床上治疗肝损伤取得了一定的研究进展。鼠曲草系菊科鼠曲草属植物鼠曲草的地上部分^［5］，研究发现鼠曲草属植物的主要化学成分为黄酮类^［6］。有研究表明其主要成分总黄酮有抗菌抗病毒活性、抗自由基活性、抗肿瘤、镇咳祛痰等作用^［7-9］，且发现鼠曲草提取物可以改善四氯化碳（CCL₄）诱导的肝损伤，但仅对其抗氧化、抗自由基功能进行了验证，并未深入挖掘其治疗急性肝损伤的作用机制。APAP肝损伤与CCL₄肝损伤的发生机制不同^［10］，目前鼠曲草总黄酮（TFM）干预APAP诱导的急性肝损伤尚未有研究报道。课题组前期预实验研究发现，鼠曲草水煎液对APAP诱导的ALI有改善作用，且通过网络药理学分析也发现TFM对ALI有较好的保护作用，其中对铁死亡通路位居前列。因此，本研究将通过网络药理学分析结合体内实验阐明TFM是否通过干预铁死亡相关通路来改善APAP诱导的ALI。

1 材料和方法

1.1 网络药理学方法

1.1.1 鼠曲草醇提物活性成分与靶点获取

通过查阅文献汇总TFM的化学成分，将化学成分输入化源网（https：//www.chemsrc.com/）查找各成分的CAS号，利用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库，获取TFM的分子结构，并导入swissADME（http：//www.swissadme.ch/）数据库，以GI absorption为HIGH，Druglikeness中YES数≥2为条件进行化合物筛选，将筛选后的成分通过swissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测后筛选，选择预测结果中可能性>0的靶点作为各化学成分的作用靶点，整合并删除重复值，即得最终药物成分靶点。

1.1.2 对APAP肝损伤的相关基因获取

以“对乙酰氨基酚肝损伤”为关键词，通过OMIM （https：//www.omim.org）和GeneCards（https：//www.genecards.org）两个数据库预测APAP肝损伤基因。选择GeneCards数据库预测结果中可能性大于中位数值（2.076764）的靶点和OMIM数据库全部靶点作为各化学成分的作用靶点，整合并删除重复值，即得APAP肝损伤的成分靶点^［31］。

1.1.3 venn图制作

将TFM相关靶点与肝损伤的相关靶点取交集后，得到TFM与对APAP肝损伤的共同靶点，通过微生信平台（www.bioinformatics.com.cn）构建venn图。

1.1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将鼠曲草与APAP肝损伤的共同靶点基因导入STRING数据库（wwww.string-db.org）进行分析，分析模式设定为“Multiple proteins”，物种限定为“Homo sapiens”。对数据进行预读后，设置置信度≥0.9，并隐藏孤立蛋白。在网络中，节点的大小代表节点度的大小。节点度越高，蛋白质之间的相关性越好。

1.1.5 药物-活性成分-靶点-疾病网络构建

将TFM的化学成分和药物与疾病的交集基因通过 Cytoscape 3.9.0 软件构建可视化网络。

1.1.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析

将TFM与APAP肝损伤的相关靶点采用R语言中的 “colorspace”、“stringi”、“ggplot2”包进行GO功能富集分析，设定阈值P<0.05；再用Metascape平台进行KEGG通路富集分析，绘制GO和KEGG气泡图。

1.2 动物实验

1.2.1 实验动物

SPF级，6~8周龄雄性C57BL/6小鼠36只，体质量为22~24 g，购于三峡大学实验动物中心，许可证号SCXK（鄂）2022-0012。所有小鼠都在恒温、湿度恒定的条件下培养，进行12 h的光/暗循环（26±2 ℃，55%±10%相对湿度），常规标准饲料喂养，可自由获得食物和水。动物实验方案经湖北恩施学院伦理委员会批准（伦理批号：20240501），所有实验程序均按照中国国家卫生研究院的动物护理和使用指南。

1.2.2 实验仪器

功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；EL204型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海森信）；高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific）；TS100型倒置显微镜（Nikon）；免疫蛋白印迹系统通用设备（BIO-RAD）；冷冻干燥机（Marin Christ）；BX51光学显微镜（OLYMPU）；Western 成像分析仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.2.3 实验试剂

APAP（源叶生物），GOT试剂盒、GPT试剂盒、还原性谷胱甘肽测定实际盒、MDA试剂盒、4-HNE试剂盒、ROS试剂盒、TNF-αElisa试剂盒、IL-6 Elisa试剂盒、BCA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；生理盐水、无水乙醇（武汉锐必特生物有限公司公司），PVDF膜、ECL发光液、蛋白酶抑制剂Cocktai、lSDS-PAGE凝胶配制试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Nrf2抗体、HO-1抗体（碧云天），PCNA、Keap1抗体、GPX-4、SLC7A11、β-actin抗体（proteintech）。

1.2.4 制备TFM

实验药物购自湖北恩施中草药材有限公司，TFM为本实验室自制鼠曲草的提取物，经慧宜风湿医院主任药师张国安鉴定为菊科鼠曲草属植物。洗净后烘干，粉碎为粉末，料液比1∶10、超声波辅助提取60 min，提取温度70 ℃，滤渣再同法操作两次，合并滤液，减压浓缩（60 ℃）；将所得滤液以2 BV/h的流速通过大孔树脂AB-8，待吸附饱和后，使用95%的酒精洗脱^{［11， 12］}。将洗脱液旋转蒸发浓缩，通过冷冻干燥所得粉末即为TFM。

1.2.5 模型制备及药物干预方案

将36只小鼠随机分为正常组、模型组（APAP）、TFM低剂量（APAP+100 mg/kg TFM）、TFM中剂量组（APAP+200 mg/kg TFM）、TFM高剂量组（APAP+400 mg/kg TFM）^［30］、阳性药物联苯双酯组（APAP+150 mg/kg），6只/组。正常组腹腔注射相同剂量的生理盐水，其余各组按照剂量300 mg/kg一次性腹腔注射（小鼠注射量为0.02 mL/g），APAP溶解于热生理盐水中备用（剂量15 mg/mL）^［13］。正常组和模型组每天灌胃羧甲基纤维素钠（0.5%）、其他组灌胃相应剂量的药物（TFM和联苯双酯均溶于0.5%的羧甲基纤维素钠），0.3 mL/次，连续14 d。取血、取肝进行相应的指标检测。

1.2.6 HE染色

观察肝脏的外观形态并称量湿肝，计算肝脏指数（肝脏指数=湿肝质量/小鼠体质量）。HE染色：肝组织置于10%甲醛固定液→脱水→包埋→切片、展片、烤片、烘干→苏木精-伊红染色→封片→镜检拍片。

1.2.7 血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）测定

将小鼠血液样本1500 ×g离心10 min得血清，在96孔板中分别加入各组样品、基底液、显色液，室温放置15 min，在酶标仪波长510 mm下测定其吸光度，查标准曲线，求得相应的ALT/AST活力单位。

1.2.8 肝脏活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）及血清4-HNE的测定

肝组织ROS、MDA、及GSH水平检测取冻存肝组织，称重后研磨制备10%组织匀浆，离心后取上清液；采用DCFH-DA荧光探针，在荧光酶标仪中检测各孔吸光度值A_{593 nm}，对照标准曲线计算ROS水平；TBA法检测上清液中脂质过氧化产物MDA含量；微板法检测GSH水平、血清4-HNE均按照各试剂盒说明书操作。

1.2.9 Perls铁染色

Perls铁染色检测肝内铁沉积情况取石蜡切片，常规脱蜡后，加Perls染液（试剂A1与A2等量混合，现配现用）染色20 min，水洗，核固红试剂B染核10 min，水洗、脱水透明、封片，光镜观察肝细胞内蓝色颗粒。每张切片随机选取5个视野，用Image J软件分析普鲁士蓝染色阳性面积占整个面积的百分比。

1.2.10 ELISA检测血清TNF-α、IL-6

取待测血清，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪测定450 nm的吸光度A，以A为横坐标，标准品浓度为纵坐标，根据标准曲线计算出血清中TNF-α、IL-6的含量。

1.2.11 Western blotting法检测蛋白表达

取冻存肝组织，组织匀浆法冰上裂解，离心取上清；BCA法测定蛋白浓度，BCA定量，加入5X上样缓冲液。将制备好的样品进行电泳上层胶80 V/30 min，下层胶120 V/60 min，把蛋白质转移到PVDF膜上，5%的脱脂牛奶封闭1 h，一抗β-actin（1∶5000）、PCNA（1∶5000）、Nfr2（1∶1000）、HO-1（1∶1000）、Keap1（1∶1000）、GPX-4（1∶1000）、SLC7A11（1∶1000）4 ℃过夜，洗膜3次，二抗（1∶5000）室温孵育1 h，用ELC发光底物显影，应用Image J分析。

1.3 统计学处理

通过Graph prism 9.5 进行数据分析，计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学结果

2.1.1 TFM调控APAP肝损伤的作用靶点

将筛选收集的198个TFM作用靶点和681个APAP肝损伤靶点通过Venny图取交集，共得到71个交集靶点，即TFM调控APAP肝损伤的作用靶点（图1A）。

2.1.2 TFM调控APAP肝损伤核心靶点的筛选

通过STRING数据库分析得网络中包含了节点有71个、1074条边、平均节点度为29.4。包括PTGS1、PIK3R1、AKT1等靶点处于网络中核心，平均路径最短且度值较高（图1B）。

2.1.3 药物-活性成分-靶点-疾病网络

根据网络拓扑分析结果，该网络的核心节点中槲皮素、木樨草素、卡脲酸、山奈酚位于核心地位，且上述成分均属于TFM核心成分（图1C）。

2.1.4 GO功能富集和KEGG通路分析

GO 富集显示靶基因涉及生物过程包括细胞对ROS的反应、细胞对氧化应激的反应等；KEGG共富集到67条通路，关键靶点涉及脂质与动脉粥样硬化、肝炎、铁死亡等相关信号通路（图2）。

2.2 动物实验结果

2.2.1 TFM对肝损伤小鼠ALT、AST水平的影响

与对照组相比，APAP模型组ALT、AST均升高（P<0.01），表明造模成功；与模型组比，TFM各剂量组均降低ALT、AST水平（P<0.05），且成剂量依赖性（图3）。

2.2.2 TFM减轻APAP诱导的肝损伤

HE染色结果显示，正常组肝细胞排列整齐呈放射状分布，无炎性浸润情况，无坏死变性出现；模型组肝细胞索排列紊乱，细胞间隙增大，胞质疏松，肝小叶边界模糊，出现细胞坏死、炎性浸润灶；联苯双酯组能改善肝细胞排列，明显减少炎性细胞数量；TFM各剂量组均可改善肝索排列紊乱，减少炎性细胞的浸润和肝细胞坏死数量（图4）。

2.2.3 TFM对小鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6的影响

与对照组相比，模型组TNF-α、IL-6水平升高（P<0.01）；与模型组比较，TFM各剂量组均降低TNF-α、IL-6的水平（P<0.05），联苯双酯组效果低于TFM 400 mg/kg组（图5）。

2.2.4 TFM对肝脏组织脂质过氧化标志物ROS、GSH、MDA、4-HNE的影响

与对照组比较，模型组肝脏GSH含量降低，MDA、ROS、4-HNE含量上升（P<0.01）；与模型组比，TFM治疗组肝脏GSH的含量升高，MDA、ROS、4-HNE的含量降低（P<0.05），且呈剂量依赖性；其中TFM 200 mg/kg组、400 mg/kg组效果优于阳药组（图6）。

2.2.5 TFM减轻肝组织内铁沉积

与正常组相比，APAP损伤后的小鼠肝内蓝染阳性面积百分比增大（P<0.01）。与APAP组比较，TFM各剂量组肝细胞内蓝染颗粒百分比均减小（P<0.01），且呈剂量依赖性；联苯双酯组肝细胞内蓝染百分比也减小（P<0.01，图7）。

2.2.6 TFM对铁死亡相关蛋白的影响

与正常组相比，模型组Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX-4蛋白表达均下降，keap1的蛋白水平上升（P<0.05）；与模型组相比，药物干预后Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX-4蛋白表达均上升，而keap1的蛋白水平下降（P<0.05），高剂量组效果优于联苯双酯组。通过核质分离法分别检测核内外的Nrf2表达量，发现药物干预组核内Nrf2的表达明显增加，而胞质内Nrf2的表达无明显差异（图8）。

3 讨论

天然药用产物防治肝病得到了医学界的认可，土家药物鼠曲草自古便有药食同源的特性^［14］，符合中医以食代养的理念。TFM有抗氧化、抗自由基的功能，且其对CCl₄肝损伤有改善作用。为阐明TFM对APAP肝损伤的保护作用及分子机制，本研究通过网络药理学分析发现TFM治疗ALI的主要靶点为PTGS1、PIK3R1、AKT1；筛选出TFM治疗ALI的主要成分是槲皮素、木樨草素、卡脲酸、山奈酚等。有研究表明，槲皮素能降低APAP诱导的急性肝损伤小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平，增加肝组织谷胱甘肽的含量，提高抗氧化能力，对急性肝损伤具有保护作用^［15］；山柰酚可以抑制炎症反应，对D-GaIN/LPS诱导的急性肝衰竭发挥保护作用^［16］；木犀草素增加心肌组织中Nrf2及其下游抗氧化基因HO-1等表达^［17］；本研究KEGG分析显示铁死亡信号通路居于前列，提示TFM可能是通过调节铁死亡信号通路来发挥改善ALI的作用。有多项研究表明，肝细胞铁死亡在APAP肝损伤起着重要作用^［18-21］，抗铁死亡是相关药物发挥对APAP肝损伤治疗作用的关键途径和靶点^［22］。当肝脏受损伤时，游离的铁离子增多，会使氧自由基增多，进而引起氧化应激，导致肝细胞大量死亡^［23］。核转录因子E2（Nrf2）是体内重要的抗氧化应激元件^［24］，而keap1是Nrf2的内源性抑制剂，只有Nrf2与keap1解离后才能入核发挥其下游抗氧化作用^［25］，产生HO-1来抑制铁死亡产生的活性氧^［26］；另一方面Nrf2可促进溶质转运蛋白SLC7A11至胞膜上，促进谷氨酸盐入胞生成GPX-4来抑制脂质过氧化产生过多的活性氧，抵抗肝细胞铁死亡来改善肝损伤^［27］。

本研究验证了TFM对APAP诱导的小鼠急性肝损伤的治疗作用，结果表明TFM可降低模型组小鼠的肝功能酶，减轻肝组织炎症灶、铁沉积面积，降低炎症因子TNF-α、IL-6水平；增多肝脏GSH水平，降低脂质过氧化标志物MDA、ROS、4-HNE；下调蛋白keap1的表达，上调蛋白Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX-4的表达，这提示TFM在治疗过程可以通过促进Nrf2的入核，增加HO-1、SLC7A11和GPX-4的合成及存储能力，使肝脏遭受ROS的所致的脂质过氧化时有更好的抵抗能力。由此说明TFM可能通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX-4信号通路来抑制铁死亡来改善ALI。另外，本实验还构建了阳性药物对照组，联苯双酯是五味子菌素C的合成中间体，临床上用于治疗肝炎，在规定剂量下可观察到的副作用最小，通常用作阳性对照，以探索其他保肝药物的作用^{［28， 29］}。本研究结果显示，TFM高剂量组对肝脏损伤的改善程度优于阳性药物联苯双酯，且可以较好地改善铁死亡相关蛋白的表达。这表明TFM可能通过调控Nrf2/SLC7A11/GPX-4信号通路改善ALI，且疗效优于联苯双酯。

TFM对ALI的保护作用具有多成分、多靶点及多通路的特点，本文为后期进一步探索鼠曲草的作用机制以及发现TFM新的药理作用提供了研究基础，亦将为靶向Nrf2/SLC7A11/GPX-4的抗铁死亡护肝机制提供实验依据。本研究为临床应用民族药鼠曲草辅助治疗肝损伤提供了更多的理论依据。

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