白花丹素通过抑制JAK2/STAT3通路减弱焦亡对抗脓毒症心肌损伤

Plumbagin protect against sepsis-induced myocardial injury in mice by inhibiting the JAK2/STAT3 signaling pathway to reduce cardiomyocyte pyroptosis

摘要

目的 基于网络药理学探讨白花丹素是否通过减轻焦亡来抑制脓毒症心肌损伤的机制。 方法 通过网络药理学方法获得白花丹素与疾病的关键靶点，进行GO、KEGG分析，通过分子对接验证结合能。将小鼠随机分为4组，8只/组：Sham组、盲肠结扎组（CLP）、白花丹素（PLB，2 mg/kg）+CLP组和PLB（4 mg/kg）+CLP组。采用CLP诱导脓毒症小鼠心脏损伤。超声心动图和HE染色检测心肌功能和形态的变化；检测小鼠血清CK-MB、LDH、MDA和心肌ROS水平，ELISA检测小鼠血清IL-1β和IL-18水平。Western blotting测定心肌STAT3、GSDMD、Caspase-11、JAK2、P-STAT3、P-JAK2、GSDMD-N和HMGB1的蛋白水平。 结果 从交集的10个基因中筛选出5个核心靶点，分子对接显示，白花丹素与STAT3、p-STAT3和JAK2结合较好。与Sham组相比，CLP组的CO、LVEF、LVFS和SV水平下降（P<0.01）。血清 CK-MB、LDH、MDA、心肌炎症因子和ROS水平升高（P<0.01），HE染色结果显示心脏损伤；相关蛋白水平升高（P<0.05）。与CLP组相比，白花丹素处理组的心超功能指标水平升高（P<0.05）；血清 CK-MB、LDH、MDA、炎症因子和心肌ROS水平降低（P<0.01）；相关蛋白水平降低（P<0.05）。 结论 白花丹素减轻小鼠脓毒症心肌损伤作用，其机制可能与抑制STAT3减轻焦亡有关。

Abstract

Objective To explore the mechanism of plumbagin for protecting against sepsis-induced myocardial injury in mice. Methods Network pharmacology analysis was used to obtain the key targets of plumbagin and diseases, which were subjected to GO and KEGG analysis, and the binding energy was verified using molecular docking. In a mouse model of cecal ligation and puncture (CLP), the protective effect of plumbagin treatment prior to CLP against sepsis-induced myocardial injury was evaluated by examination of myocardial function and pathology using echocardiography and HE staining. Serum levels of CK-MB, LDH, MDA, IL-1β and IL-18 and myocardial ROS level in the mice were detected, and Western blotting was used to determine the protein expression levels of STAT3, GSDMD, caspase-11, JAK2, P-STAT3, P-JAK2, GSDMD-N and HMGB1 in the myocardial tissues. Results Five core targets were screened from the 10 intersecting genes. Molecular docking showed strong binding affinity of plumbagin to STAT3, p-STAT3, and JAK2. Compared with the sham-operated mice, the mouse models of CLP-induced sepsis had significantly decreased CO, LVEF, LVFS and SV and increased serum levels of CK-MB, LDH, MDA and myocardial inflammatory factors and ROS. HE staining and Western blotting showed obvious myocardial injury in the septic mice with increased expressions of JAK2/STAT3 signaling pathway and pyroptosis-related proteins (P<0.05). Pretreatment with plumbagin significantly improved cardiac functions of CLP mice, lowered serum levels of CK-MB, LDH, MDA, inflammatory factors and myocardial ROS, and decreased the expression levels of JAK2/STAT3 signaling pathway and pyroptosis-related proteins. Conclusion Plumbagin pretreatment alleviates myocardial injury in septic mice possibly by inhibiting the STAT3 signaling pathway to reduce cardiomyocyte pyroptosis.

Graphical abstract

关键词

白花丹素 / 脓毒症心肌损伤 / 焦亡 / 网络药理学

Key words

plumbagin / sepsis induced myocardial injury / pyroptosis / network pharmacology

脓毒症是指因感染引起宿主反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍^［1］，在这些器官功能障碍中，脓毒症引起的心肌损伤普遍发生，约占50%，其特征是严重且可逆的心脏功能障碍^［2］。细菌感染是宿主反应中炎症小体组装和激活的重要诱因，细胞焦亡会引起显著的炎症反应，这有助于清除感染，然而过度激活的细胞焦亡可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征或继发感染的风险增加^［3］。

白花丹素是从药用植物白花丹的根中提取的主要生物活性化合物，表现出多种药理活性，包括抗癌、抗菌和抗炎特性等^［4］。白花丹素不仅能抑制心血管系统中二磷酸腺苷诱导的血小板聚集，还能抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的表达，显著改善心肌I/R的氧化还原状态失衡^［5］。有研究表明，白花丹素对阿霉素诱导的大鼠心脏毒性具有治疗潜力^［6］，可通过激活Nrf2降低ROS水平，增加谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-转移酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性^［7］；白花丹素预处理通过激活Nrf2显著抑制心肌I/R损伤^［8］。另有报道，白花丹素可显著改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤，抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应^［4］；能显著抑制早期（IL-1β）和晚期（HMGB1）细胞因子的全身释放，降低脓毒症的致死率^［10］。基于白花丹素的上述作用，我们推测白花丹素在治疗脓毒症心肌损伤方面具有很大的潜力，但目前白花丹素对脓毒症心肌损伤的保护作用和相关机制尚不清楚，缺乏白花丹素的有效成分靶点与疾病相关靶点相互作用的研究。

网络药理学是基于系统生物学、基因组学和蛋白质组学等学科，是通过计算分析与体内外实验相结合，整合大量信息，发现新的药物靶点和分子机制的方法^［9］。因此，基于上述问题，本研究首先通过网络药理学首先筛选出白花丹素治疗脓毒症心肌损伤的靶点，并对交集靶点进行GO和KEGG分析，明确白花丹素治疗脓毒症心肌损伤核心靶点以及潜在的分子机制，并在小鼠模型上进行初步验证，为白花丹素未来的临床应用和基础研究提供新的见解及依据。

1 材料和方法

1.1 白花丹素靶点的获取

利用NPACT数据库（https：//ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/440）、Swisstargetpredic tion数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）、SEA数据库（https：//sea.bkslab.org/）和STITCH数据库（https：//ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/208）获取白花丹素药物靶点，靶点种类设定为Mouse Only，其他默认。

1.2 脓毒症心肌损伤相关靶点的获取

通过GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库，以“sepsis-induced myocardial injury”为关键词检索相关的基因，获取疾病靶点。

1.3 焦亡相关靶点的获取

通过GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库，以“pyroptosis”为关键词检索相关的基因，获取疾病靶点。

1.4 白花丹素-脓毒症心肌损伤-焦亡交集靶点蛋白质互作（PPI）网络的构建

将筛选过的靶点上传至在线韦恩图（https：//www.bioinformatics.com. cn/static/others/jvenn/example.html），得到白花丹素-脓毒症心肌损伤-焦亡的交集基因。将交集基因导入String数据库（https：//string- db.org/cgi/input.pl）构建蛋白质之间的PPI，将PPI网络导入Cytoscape3.7.2 软件（http：//www.cytoscape.org/）进行调整以及利用cytoHubba插件得到关键靶点。

1.5 GO和KEGG富集分析

GO分析可以进一步解释交集基因在分子功能、生物过程和细胞组成抗脓毒症心肌损伤的过程。KEGG富集分析则是研究交集基因涉及的主要抗脓毒症心肌损伤信号通路。本研究将关键核心靶点数据，利用Metascape平台（https：//metascape.org/gp /index.html），物种为“Mus musculus”进行 KEGG通路富集分析与GO功能富集分析。

1.6 白花丹素与脓毒症心肌损伤分子对接

将已知的关键靶点与白花丹素进行分子对接，得到对接亲和力反映其稳定性。PDB数据库下载核心蛋白分子结构，PUBCHEM下载白花丹素的结构，将蛋白和白花丹素结构导入PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools软件进行处理后进行分子对接，PyMol 2.4.0进行可视化。

1.7 药品及试剂

白花丹素（PLB，MCE）；丙二醛（MDA）试剂盒（APE×BIO）；肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；RIPA强效裂解液（Biosharp）；PMSF、BCA蛋白试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、DAPI染液（碧云天）；PAGE凝胶试剂盒（雅酶生物）；PVDF膜Immobilon和ECL试剂盒（Millipore）；IL-18和IL-1β ELISA试剂盒（晶美生物科技有限公司）；STAT3（1∶1000）、HMGB1（Abcam，1∶1000）、Caspase-11（1∶1000）、GSDMD （1∶1000）、P-STAT3（1∶1000）、JAK2（1∶1000）、P-JAK2（Abcam，1∶1000），GSDMD-N（Affinity，1∶1000）和GAPDH（Absin，1∶6000）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（Biosharp，1∶20000）、DHE荧光探针；异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；Marker（赛默飞）。

1.8 实验动物

雄性C57BL/6J小鼠，6~8周龄，体质量18~20 g，购自江苏青龙山生物科技有限公司［许可证号：SCXK（苏）2024-0001］。动物实验操作严格按照蚌埠医科大学伦理要求进行（伦理批号：［2024］第581号）。

1.9 实验方法

1.9.1 动物模型建立及分组

实验小鼠在25~ 27 ℃、相对湿度60%~70%的条件下饲养，待小鼠适应1周后。将小鼠随机分为4组，8只/组：Sham组、盲肠结扎组（CLP）、白花丹素（PLB，2 mg/kg）+CLP组和PLB（4 mg/kg）+CLP组 ^［10］。给药组小鼠CLP前24 h腹腔注射不同浓度白花丹素。CLP手术前12 h禁食不禁水，首先使用2.5%异氟烷诱导麻醉；待小鼠深度麻醉后仰卧固定于恒温板上，术中使用1%异氟烷维持麻醉，并实时监测小鼠生命体征。消毒小鼠腹部后，于下腹部中线剪开腹膜约2 cm，将盲肠轻柔地拉出后，在盲肠远端1/2处使用无菌3-0手术线结扎，并使用18G无菌针头穿刺结扎点与盲肠末端的中间区域，挤出米粒大小的肠内容物后，将盲肠放回腹腔，缝合小鼠腹膜和皮肤，皮下注射生理盐水后放置恒温箱，可进食水，注意观察术后表现^［11］。

1.9.2 超声心动图评估小鼠左心室结构和功能

术后24 h吸入1%的异氟烷麻醉小鼠，剃除小鼠胸前区毛发，然后使用配备30 MHz的MS-400超声探头的Vevo2100超高分辨率小动物超声系统（VisualSonics）进行评估。在M型超声模块下检测心输出量（CO）、左心室射血分数（LVEF）、缩短分数（LVFS）和每搏输出量（SV）等，每只小鼠至少取3个心动周期，反映小鼠心脏的舒张和收缩功能。

1.9.3 心肌组织HE染色

术后24 h，收集新鲜心肌组织样本，在PBS中泵出血液，4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，将固定的心肌组织切片（0.5 mm），苏木精-伊红染色，光镜下（Nikon Eclipse E100）分析心肌组织结构变化。

1.9.4 ELISA法检测各组小鼠血清中炎症因子IL-18和IL-1β的表达

术后24 h，收集小鼠全血放置2 h后，4 ℃低温离心机中1000×g离心15 min，取上清液，每个样本吸取50 μL血清再加入50 μL的样品稀释液。按照试剂盒说 明，按步骤测量各孔的吸光度，计算出各组血清IL-18和IL-1β的浓度。

1.9.5 试剂盒检测小鼠血清MDA、CK-MB和LDH含量

MDA含量的测定：术后24 h，收集小鼠全血放置2 h后，4 ℃低温离心机中1000×g离心15 min，取小鼠眼球血上清液，按照试剂盒操作说明进行操作，检测各孔的吸光度值A_{532 nm}，计算各组血清MDA含量。

CK-MB含量的测定：取小鼠眼球血上清液并用蒸馏水稀释5倍后检测，按照各试剂盒的操作说明进行操作，在酶标仪内340 nm读取吸光度值A1，继续孵育3 min，读吸光度值A2，△A=A2-A1，根据1-3 min A值变化斜率代入公式CK-MB活力（U/L）=△A/min×F（反应系数=8360）得到各组小鼠CK-MB值。

LDH含量的测定：取小鼠眼球血上清液，按照各试剂盒的操作说明进行操作，室温放置5 min，测定吸光度值A_{440 nm}，根据LDH（U/L）＝（A_测定-A_对照）/（A_标准-A_空白）×C_标准（0.2 μmol/mL）×N（稀释倍数）×1000，计算出各组小鼠血清LDH含量。

1.9.6 Western blotting检测相关蛋白表达水平

取每只小鼠约10 mg心肌组织，加入磁珠，按照RIPA∶PMSF=100∶1的比例提取组织总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液后，定量20 μg上样，电泳后将蛋白转至PVDF膜，用快速封闭液封闭PVDF膜30 min，随后将PVDF膜分别与STAT3、HMGB1、Caspase-11、GSDMD、P-STAT3、JAK2、P-JAK2、GSDMD-N和GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后室温孵育HRP标记的山羊抗兔IgG抗体2 h。洗膜后，ECL发光检测并用ImageJ软件对灰度值进行分析计算。

1.9.7 免疫荧光检测心脏ROS表达水平

制备心肌组织冰冻切片，切片6 μm，DHE染色，荧光显微镜拍照采集图像，应用Image J软件分析荧光面积百分比。

1.10 统计学方法

数据采用GraphPad Prism 9.0统计学处理，所有数据以均数±标准差表示。不同实验组数据比较采用单因素方差分析。P<0.05时被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白花丹素相关靶点获取

利用NPACT数据库（https：//ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/4 40）、Swisstargetpredic tion数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）、SEA数据库（https：//sea.bkslab.org/）和STITCH数据库（https：//ngdc.cncb.ac. cn/data base commons/database/id/208）获取白花丹素药物靶点，限定物种为“Mouse”，最终得到143个靶点。

2.2 脓毒症心肌损伤相关靶点获取

在GeneCards数据库共筛选出406个基因，保留所有基因作为疾病靶点。

2.3 焦亡相关靶点获取

在GeneCards数据库共筛选出886个基因，保留所有基因作为疾病靶点。

2.4 白花丹素-脓毒症心肌损伤-焦亡的共同靶点

将白花丹素潜在靶点信息、脓毒症心肌损伤靶点和焦亡取交集得到10个作用靶点基因（图1）。

2.5 PPI网络及白花丹素治疗脓毒症心肌损伤的关键靶点

将白花丹素-脓毒症心肌损伤-焦亡交集靶点导入String数据库，物种限定为Mus，得到蛋白互作网络，网络中共有10个节点，33条边（图2）。利用cytoHubba插件得到Degree排名前5的关键靶点STAT3、Bcl-2、AKT1、NFKB1和mTOR。

2.6 GO分析结果

白花丹素-脓毒症心肌损伤-焦亡的GO功能结果提示（图3），生物过程主要集中在：自噬的负调控、对细胞凋亡过程的负调控、细胞对胰岛素刺激的反应；细胞组成主要集中在：大分子复合物、细胞质和线粒体；分子功能主要集中在：蛋白激酶结合、相同的蛋白质结合和大分子复合物结合等。

2.7 KEGG分析结果

KEGG通路富集筛选结果共有68个富集项，其中前30是最具有显著性的通路（图4），其中前列腺癌、JAK-STAT信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症通路等可能为重要的通路。

2.8 分子对接分析

将白花丹素与STAT3、JAK2和P-STAT3进行分子对接，白花丹素与STAT3的结合能是-5.9 kcal/mol，白花丹素与JAK2的结合能是-7.1 kcal/mol，白花丹素与P-STAT3的结合能是-6.1 kcal/mol（图5）。

2.9 各组小鼠一般情况

Sham组小鼠毛发光滑，小鼠精神状态良好、摄食、饮水、攀爬打斗等行为较活跃；对声音、触碰等刺激的行为反应迅速；呼吸频率正常。CLP组小鼠毛发凌乱，四肢颤抖，眼角分泌物增多；摄食饮水等日常活动次数减少，对刺激的反应减弱，行动迟缓或静止，呼吸频率增加。PLB2mg+CLP和PLB4mg+CLP组较CLP组整体精神状态明显改善，背部竖毛及眼角分泌物减少，摄食饮水等日常活动次数增加，对刺激反应增强，可见缓慢步行移动，呼吸频率趋于正常。

2.10 脓毒症心肌损伤小鼠模型心脏超声的变化

与Sham 组相比，CLP组小鼠CO、LVEF、LVFS及SV均降低（P<0.01）；与CLP组相比，PLB2mg+CLP组和PLB4mg+CLP组CO、LVEF、LVFS及SV均升高（P<0.05，图6）。

2.11 各组小鼠心肌形态学变化

小鼠心脏HE染色显示，Sham组心肌纤维细胞完整，排列整齐，无坏死和炎症细胞浸润，心肌横纹清晰可见，排列较整齐，细胞核为深蓝色（图7）。CLP组心肌纤维断裂、心肌横纹模糊，部分消失，间质水肿，有红细胞渗出，炎症浸润，细胞核为淡蓝色。PLB2mg+CLP和PLB4mg+CLP组小鼠炎症细胞浸润减轻，心肌排列较规则。

2.12 各组小鼠心肌组织ROS的变化

DHE荧光染色结果显示，与Sham组相比，CLP组红色荧光强度升高，ROS水平升高（P<0.001）；与CLP组相比，PLB2mg+CLP组和PLB+CLP组红色荧光强度降低，ROS水平降低（P<0.05，图8）。

2.13 各组小鼠血清中炎症因子IL-18和IL-1β的表达变化

与Sham组相比，CLP组血清中IL-18和IL-1β含量升高（P<0.001）；与CLP组相比，PLB2mg+CLP组、PLB4mg+CLP组IL-18和IL-1β含量降低（P<0.05，图9）。

2.14 小鼠血清MDA、CK-MB和LDH含量变化

与Sham组相比，CLP组血清中MDA、CK-MB和LDH含量升高（P<0.001），与CLP组相比，PLB2mg+CLP组和PLB4mg+CLP组LDH和CK-MB含量降低（P<0.001），PLB2mg+CLP组MDA含量和PLB4mg+CLP组MDA含量降低（P<0.05，图10）。

2.15 Western blotting检测相关蛋白表达水平

与Sham组相比，CLP组小鼠心肌GSDMD、Caspase-11、HMGB1、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3和GSDMD-N蛋白表达升高（P<0.05）；与CLP组相比，PLB2mg+CLP组和PLB4mg+CLP组小鼠心肌GSDMD、Caspase-11、HMGB1、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3和GSDMD-N蛋白表达降低（P<0.05，图11）。

3 讨论

脓毒症可导致全身多器官功能障碍，心脏是其最常累及的重要器官之一^［12］。本研究中，心脏超声结果显示，CLP小鼠LVEF、LVFS、CO和SV水平明显下降；HE染色显示CLP小鼠出现心肌纤维断裂、心肌横纹模糊等变化，提示脓毒症小鼠模型建立成功。越来越多的证据表明，白花丹素可通过阻断自由基生成发挥抗氧化作用，通过降低炎症介质水平发挥抗炎潜力^［13］。有研究表明，白花丹素通过下调COX2、iNOS和炎症因子的表达水平，调节NF-κB水平，抑制炎症反应^［14］。尽管现代医学技术的应用明显提高了脓毒症的生存率，但如何有效预防和减轻脓毒症诱导的多器官功能损伤，仍然是一个挑战^［15］。过度的细胞焦亡导致大量炎症细胞因子释放，引发促进全身炎症反应的级联反应，是器官功能障碍的主要原因^［16］。鉴于白花丹素良好的抗炎特性，本研究旨在阐明白花丹素是否通过抑制与炎症密切相关的焦亡来减轻脓毒症心肌损伤。

细胞焦亡在脓毒症相关器官损伤的发病机制中至关重要，包括脓毒症急性肺损伤、脓毒症心肌病和脓毒症急性肾损伤等^［17-19］。课题组前期研究中已经观察到，CLP诱导的小鼠脓毒症肺损伤模型中发生了GSDMD/Caspase-1介导的焦亡，抑制GSDMD/Caspase-1保护小鼠免受脓毒症诱导的肺脏焦亡发生^［20］。因此，本研究在前期工作基础上重点观察了另一类非经典细胞焦亡途径。与依赖Caspase-1经典激活途径不同，非经典激活途径是依赖Caspase-4/5/11完成的。革兰氏阴性菌进入吞噬细胞，通过降解细菌壁，释放LPS。LPS结合并刺激小鼠Caspase-11或人Caspase-4/5，导致Caspases寡聚化和自切割，从而导致NLRP3非典型激活。活化的Caspase-11不能直接切割pro-IL-1β和pro-IL-18，但可以水解GSDMD生成 GSDMD-Ｎ，GSDMD-Ｎ与质膜中的心磷脂、磷酸基肌醇和磷脂酰丝氨酸结合，从而在细胞膜上穿孔，诱导Ｋ^＋外流，导致细胞焦亡^［21］。HMGB1是一种非组蛋白核蛋白，在脓毒症相关的炎症反应中发挥关键作用^［22］；当LPS入胞后，caspase-11与 GSDMD作为非经典焦亡的关键蛋白及执行蛋白在其发生的过程中发挥决定性作用^［23］。为了观察白花丹素是否通过抑制焦亡来减轻脓毒症小鼠心肌损伤，本研究观察了心肌形态学改变及相关酶学指标变化。HE染色结果显示，不同浓度白花丹素干预后，小鼠心肌损伤减轻，CK-MB、LDH、MDA、IL-18和IL-1β释放减少，焦亡相关蛋白caspase-11、GSDMD、GSDMD-N及HMGB1表达减少。以上结果提示，一定浓度的白花丹素可显著降低脓毒症引起的氧化应激和炎症水平，并通过抑制细胞焦亡减轻心肌组织损伤。

网络药理学是一门在生物网络背景下研究疾病机制和药物作用机制的新学科^［24］，通过利用药物、化合物、基因和疾病数据库信息构建药物-靶点、靶点-疾病和药物-疾病相互作用网络，以揭示具有多靶点和多组分特征的中药制剂的复杂机制^［25］。本研究通过网络药理学分析出白花丹素-脓毒症心肌损伤-焦亡有5个核心靶点，核心靶点包括STAT3、AKT1、Bcl-2、mTOR和NFKB1。其中，STAT3蛋白是炎症反应的主要介质之一，STAT3信号通路的活化与多种炎症疾病的发生密切相关，如溃疡性结肠炎^［26］、类风湿关节炎^［27］及脓毒症^［28］等，STAT3信号通路在脓毒症心功能障碍中亦发挥重要作用^［29］。LPS处理小鼠骨髓源巨噬细胞后，STAT3与TRAF6和TBK-1直接相互作用，导致STAT3第727位磷酸化。随后，磷酸化的STAT3转位到线粒体中，在LPS诱导的代谢重编程和体内外炎症细胞因子产生中发挥关联关键作用^［30］。下调CXCR5可以抑制p38MAPK/NF-κB/STAT3信号传导，减轻脓毒症诱导的脑损伤^［31］。本研究观察到，CLP组小鼠心肌STAT3蛋白表达水平升高，不同浓度白花丹素干预后，STAT3蛋白表达水平降低，同时分子对接结果显示，白花丹素与STAT3结合能是-5.9Kcal/mol，结合能越低，表明结合效能越好。以上结果提示白花丹素可能通过抑制核心成分STAT3，减轻脓毒症炎症反应和心肌损伤。

进一步对白花丹素-脓毒症心肌损伤-焦亡的潜在作用靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析结果显示，JAK-STAT信号通路参与其中。炎症反应的发生发展与JAK2/STAT3信号通路密切相关。Xie等^［32］揭示了白皮杉醇课通过直接抑制JAK2/STAT3信号通路来改善脓毒症后的心肌功能和炎症；Zhen等^［33］发现褪黑素可通过抑制JAK2/STAT3信号通路抑制氧化应激反应，改善细胞凋亡，减轻脓毒症心肌受损。JAK/STAT信号通路可调节CLP诱导的脓毒症大鼠模型的急性肺损伤，抑制JAK或STAT可减轻严重脓毒症所致的急性肺损伤和致死性^［34］。NLRP12的过表达触发早期HSV-1感染和焦亡，通过JAK-STAT信号通路诱导IL-18的产生和激活下游抗病毒反应^［35］。本实验结果也观察到，CLP组小鼠心肌组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3增加，表明脓毒症心肌受损与激活JAK2/STAT3信号通路有关。经不同剂量的白花丹素干预后，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达均降低，表明白花丹素可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路，减少炎症反应和焦亡的发生，改善小鼠心肌损伤。

综上所述，通过网络药理学系统的分析明确白花丹素-脓毒症心肌损伤-焦亡的关键靶点，GO和KEGG分析以及筛选得到了核心信号通路及分子机制。利用分子对接技术进行白花丹素与关键靶点的结合验证，并通过在小鼠模型上验证，观察到白花丹素可能通过调控JAK2-STAT3通路减轻焦亡发生，改善脓毒症心肌损伤。本研究可为白花丹素临床应用于脓毒症心肌损伤治疗提供研究依据，为相关药物研发提供新的思路和方法。

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基金资助

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