miR-204-5p通过靶向负性调控RAB22A促进膀胱癌细胞的恶性生物学行为

High expression of miR-204-5p promotes malignant behaviors of bladder cancer cells by negatively regulating RAB22A

摘要

目的 探讨MiR-204-5p靶向RAB22A对膀胱癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。 方法 TCGA数据库进行了miR-204-5p的生存分析和临床病理性状的相关性分析；检测膀胱癌组织和癌旁组织以及正常尿路上皮细胞和膀胱癌细胞中miR-204-5p的表达水平；过表达/敲低miR-204-5p后检测细胞增殖、迁移和侵袭、和凋亡等变化；转录组测序，数据库分析和多种实验证实miR-204-5p靶向抑制RAB22A基因调控膀胱癌细胞的生物学行为。 结果 TCGA数据库中MiR-204-5p高表达患者的中位生存期较低，表现出较差的预后（P<0.05）；miR-204-5p在膀胱癌组织和细胞表达明显上调（P<0.05）；过表达miR-204-5p可促进细胞增殖（P<0.05）、迁移和侵袭（P<0.05），减少细胞凋亡（P<0.05），敲低后则相反；转录组测序，数据库分析和双荧光素酶实验提示RAB22A是miR-204-5p下游关键因子，qRT-PCR，Western blotting证实过表达miR-204-5p可抑制RAB22A的表达（P<0.05）；过表达RAB22A可部分逆转miR-204-5p对膀胱癌细胞生长的促进作用（P<0.05）。 结论 miR-204-5p通过靶向负性调控RAB22A促进膀胱癌细胞的恶性生物学行为。

Abstract

Objective To explore the regulatory effect of miR-204-5p on biological behaviors of bladder cancer cells and its molecular mechanism. Methods Survival analysis and correlation analysis were performed using TCGA database to explore the association of miR-204-5p expression with survival outcomes and clinicopathological parameters of bladder cancer patients. The expression level of miR-204-5p was detected in bladder cancer and adjacent tissues and in normal uroepithelial cells and bladder cancer cells. In cultured bladder cancer cells, the effects of miR-204-5p overexpression and knockdown on cell proliferation, migration, invasion, and apoptosis were analyzed. Transcriptome sequencing, bioinformatics analysis and dual-luciferase assay were carried out to confirm targeted inhibition of RAB22A by miR-204-5p to promote malignant biological behaviors of bladder cancer cells. Results Patients with high miR-204-5p expressions had lowered median survival time and poor prognosis (P<0.05). The expression of miR-204-5p was significantly up-regulated in bladder cancer tissues and cells (P<0.05). In bladder cancer cells, miR-204-5p overexpression significantly promoted cell proliferation, migration and invasion and reduced cell apoptosis. Transcriptome sequencing, bioinformatics analysis and dual-luciferase assay all suggested that RAB22A was a key downstream factor of miR-204-5p. Overexpression of miR-204-5p significantly inhibited RAB22A expression in bladder cancer cells, and overexpression of RAB22A partially reversed miR-204-5p overexpression-induced enhancement of bladder cancer cell proliferation. Conclusion High expression of miR-204-5p promotes proliferation, migration and invasion and reduces apoptosis of bladder cancer cells by negatively regulating RAB22A expression.

Graphical abstract

关键词

miR-204-5p / RAB22A / 膀胱癌

Key words

miR-204-5p / RAB22A / bladder cancer

目前，膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症死亡的主要原因之一^［1］。根据2018年GLOBOCA数据，膀胱癌导致了199 922人死亡，占所有癌症死亡人数的2.1%。同年，膀胱癌新发病例549 393例，占所有癌症新发病例的3.0%^［2］。尽管膀胱癌的预后已得到明显改善，但由于早期诊断率低以及缺乏针对晚期患者的有效疗法，其总体生存率仍然很低^［3，4］。吸烟和一些致癌化合物是膀胱癌的主要危险因素^［5］，但这些因素并不足以导致肿瘤的发生，这表明探究遗传因素参与肿瘤的重要性^{［6， 7］}。

MicroRNA是长约25-nt的单链ncRNA分子。它们与两种蛋白质（GW182蛋白和AGO2蛋白）结合会产生一种称为miRNA诱导的沉默复合体（miRISC）^［8］。在该复合物中，miRNA与目标mRNA的3'UTR中的互补序列结合，并抑制其转录后翻译成蛋白质^［9］。先前的研究已经发现了多种miRNA调控了膀胱癌的发展和进展^{［10， 11］}。确定膀胱癌中的关键遗传因子可为开发靶向疗法提供新的途径 ^［12］。多项研究表明，miR-204-5p调控多种恶性肿瘤的发展 ^［13-15］。miR-204-5p参与了多种信号级联，包括信号转导和转录激活因子3和Wnt/β-catenin信号转导^［16］。这些研究阐述了miR-204-5p作为恶性肿瘤潜在生物标志物的作用，但miR-204-5p在膀胱癌的发生发展中的作用及其对膀胱癌生物学行为的影响和下游的相关信号因子的机制仍然未知。因此，在膀胱癌中miR-204-5p的内在机制和潜在靶基因的深入研究仍迫在眉睫。

本研究从表达和细胞功能两方面研究了miR-204-5p对膀胱癌的影响。此外，还利用转录组测序和生物信息学方法预测了RAB22A为miR-204-5p的靶基因，并研究了 miR-204-5p/RAB22A的作用机制。总之，本课题为miR-204-5p在膀胱癌中的分子机制提供了新的视角，并为基于该机制的潜在治疗策略提供了参考。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

正常人尿路上皮细胞系SV-HUC-1在含有10%胎牛血清的F-12K培养基中培养，膀胱癌细胞系T24、J82 和5637细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。RPMI 1640培养基、F-12K培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素抗体和胰蛋白酶（Gibco）。

1.2组织样本

膀胱癌组织和癌旁组织取自蚌埠医科大学第一附属医院2017年12月~2020年12月的36例膀胱癌患者，患者均知情同意。他们均未接受术前放疗或术前化疗。所有标本均按照伦理和法律标准进行处理，通过蚌埠医科大学伦理审核（伦理批号：伦科批字［2022］第324号）。

1.3 生物信息学分析

从TCGA数据库（//https：//www.cancer.gov/tcga）下载与BLCA相关的差异表达miRNA数据集，生存分析、临床病理参数的相关性分析、单因素和多因素Cox分析，用到的包主要包括如下：survival，survminer clusterProfiler、org.Hs.eg.db等。

1.4 过表达质粒的构建

含有 miR-204-5p和RAB22A过表达构建体的质粒由吉玛公司（中国上海）生产。细胞按照生产商的方案进行转染，将细胞分为inhibitor-NC组、miR-204-5p inhibitor组、mimics-NC组、miR-204-5p mimics组、miR-204-5p mimics+OE-NC组和miR-204-5p mimics+OE-RAB22A。

1.5 qRT-PCR测定

使用 Trizol 试剂从组织和细胞中分离出总RNA，并逆转录成互补脱氧核糖核酸（cDNA）。在95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，60 ℃ 退火 20 s，共40个循环后，用2^-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。引物设计使用引物5.0设计的引物，由吉玛公司（中国上海）合成生产（表1）。

1.6 CCK-8细胞增殖实验

使用细胞计数试剂盒-8（KeyGEN Biotech）进行CCK-8检测，以评估转染对细胞增殖的影响。用96孔板培养转染后48 h收获的细胞，悬液100 µL/孔。每个转染组设3个重复孔。在上述条件下培养细胞，在细胞培养结束前4 h每孔加入10 µL的CCK-8。24 h/次测量光密度值A_450nm，直至72 h，重复实验3次。

1.7 Transwell小室法

细胞以2.0×10⁶/mL的浓度在无血清培养基中培养。在24孔板中插入Transwell小室，小室装入200 μL悬浮液，基底侧小室装入600 μL含20% FBS的培养基。24 h后，移除腔室，用4%多聚甲醛固定穿透膜的细胞20 min，然后用0.1%结晶紫染色15 min。每张膜随机选取5个区域进行计数（放大倍数×20）。用于侵袭试验的 Transwell 室预先加入Matrigel胶，重复实验3次。

1.8 流式细胞术

通过FITC Annexin V染色检测细胞凋亡。获取细胞并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗，用 FITC Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen）进行染色，使用 FACScan 仪器（Beckman Coulter）分析细胞，并使用 WinMDI 2.9 测量数据。

1.9 转录组测序分析

收集转染mimics-NC和miR-204-5p-mimics后的T24细胞，每组各3个样本，TRIzol试剂分离总RNA，Nanodrop分光光度计检测RNA样品的纯度、浓度和完整性，进行文库构建，加入Fragmentation Buffer将mRNA进行随机打断，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第1条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2条cDNA链，利用AMPure XP磁珠纯化cDNA，纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP磁珠进行片段大小选择，最后通过PCR富集得到cDNA文库，不同文库按照目标下机数据量进行混合，用Illumina平台进行测序。

1.10 Western blotting

收集细胞，用 NP-40缓冲液提取总蛋白，进行 SDS-PAGE 分析。用放射免疫沉淀测定缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100，1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，正钒酸钠，氟化钠，EDTA和亮普汀）研磨约20 mg的组织。在每个孔中加入总量为20 μg的蛋白质。在10%或12% SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白质。使用 Image J 软件对蛋白质水平进行量化。

1.11 双荧光素酶报告实验

构建RAB22A野生型及突变型质粒，将细胞接种于6孔板中，分别或同时转染RAB22A野生型质粒、RAB22A突变型质粒、mimics-NC和 miR-204-5p mimics，用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组荧光素酶活性。

1.12 统计学处理

基因表达数据经过对数转换和归一化处理后进行统计分析，并使用R软件3.6.2和Perl 语言包绘制图表。SPSS 22.0统计软件和GraphPad Prism9 用于分析和处理实验数据。计量数据以均数±标准差表示，采用t检验和单因素方差分析检验统计差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MiR-204-5p 在膀胱癌中表达上调，且与临床预后呈正相关

TCGA数据库的分析结果显示miR-204-5p低表达患者的中位生存期明显高于miR-204-5p高表达患者（P<0.05，图1A），Wilcoxon 符号秩检验分析了临床病理特征与 miR-204-5p 之间的关系（P<0.05，图1B~F），单因素Cox分析分析表明，miR-204-5p表达与不良OS显著相关（P=0.030017），其他与生存不良有关的临床病理变量包括年龄、T期和M期，差异具有统计学意义（P<0.05，图1G）。多因素Cox分析分析表明，miR-204-5p基因表达与不良OS显著相关（P=0.0079）。其他方面与生存不良有关的临床病理变量包括年龄和N期，差异具有统计学意义（P<0.05，图1H）。qRT-PCR表明miR-204-5p在膀胱癌组织中的表达量上调（P<0.05，图2A）。与正常尿路上皮细胞 SV-HUC-1 相比，3种膀胱癌细胞系（T24、J82、5637）中 miR-204-5p 的表达也有所上升（P<0.05，图2B）。

2.2 miR-204-5p对膀胱癌细胞生物学行为的影响

转染 miR-204-5p mimics 后，与对照组相比，T24细胞的增殖能力增强（图3A，P<0.01）。与对照组相比，过表达miR-204-5p导致T24细胞凋亡率下降（P<0.05，图3B）。过表达miR-204-5p增强了T24的迁移和侵袭能力（P<0.05，图3C），敲低miR-204-5p后则相反（P<0.05，图3）。

2.3 miR-204-5p和RAB22A的靶向关系

通过3个在线数据库分析，结果发现有123个基因在3个数据库中均显示受miR-204-5p靶向调控，并且RAB22A的表达受miR-204-5p靶向负性调控，两者之间存在结合位点（P<0.05，图4A~C）。qRT-PCR和Western blotting结果表明，在过表达miR-204-5p后，RAB22A的表达量明显降低（P<0.05，图4D~F）。双荧光素酶报告实验的结果同样证明miR-204-5p与RAB22A之间存在结合位点（P<0.05，图5）。

2.4 MiR-204-5p靶向RAB22A对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

过表达RAB22A后，与单纯过表达miR-204-5p相比，T24细胞的增殖能力减弱（P<0.05，图6A）。流式细胞术分析显示，过表达RAB22A后，T24细胞凋亡率上升（P<0.05，图6B）。同样过表达RAB22A部分逆转了miR-204-5p增强的细胞迁移和侵袭能力（P<0.05，图6C）。

3 讨论

膀胱癌是一种常见的人类恶性疾病，起源于膀胱内表面的上皮细胞，以发病率高、死亡率高、发病率高和预后差而闻名^{［1， 3］}。据估计，全球每年新发膀胱癌病例超过42万例，因膀胱癌死亡的人数超过16万，尤其是在男性和生活在不发达国家的人群中^［17］。尽管近年来出现了多种新的诊断和治疗方法，包括经尿道膀胱肿瘤切除术、根治性膀胱切除术、化疗、放疗和免疫疗法，但膀胱癌，尤其是肌层浸润性膀胱癌的5年生存率（<60%）仍然很低，因此深入了解驱动恶性肿瘤的潜在分子机制将有利于当前和未来的治疗。

miRNA具有组织特异性表达模式，在大多数癌症中其表达往往失调。许多miRNA在大多数癌症中发挥致癌基因或抑癌基因的作用，具体取决于癌症组织类型^［18］。miR-204-5p通过靶向HER2 抑制胃癌的进展和转移^［19］，miR-204-5p 在乳腺癌中被表观遗传沉默^［20］，这些表明miR-204-5p-5p 具有抑制肿瘤的功能。miR-204-5p对不同肿瘤的不同甚至相反作用可能是由其多个靶基因造成的，在膀胱癌进展和转移中的功能仍有待进一步确定。因此本研究以miR-204-5p为研究对象证明了miR-204-5p在膀胱癌组织和细胞中上调，高级别的膀胱癌患者miR-204-5p表达明显优于低级别的膀胱癌患者，并且与膀胱癌患者的不良预后相关。通过细胞实验验证了miR-204-5p在膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡中的作用。结果显示，miR-204-5p在体外促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，抑制凋亡。以上结果表明miR-204-5p在膀胱癌中高表达并促进肿瘤的发生和发展。

而miR-204-5p作为一种促癌因子，其对膀胱癌的调控机制仍然未知，其游的靶向分子和作用机制需要进一步的挖掘。RAB22A属于Ras超家族，其编码基因位于染色体20q13.32。RAB22A是脑中Ras相关蛋白（Rabs）GTPase亚家族的一部分，属于小GTP结合蛋白^［21］。Zhou等^［22］报道，RAB22A参与了内细胞途径的多个水平，质膜受体的组成受内细胞循环和内细胞摄取的调控。抑制RAB22A功能的小干扰RNA会阻断内吞载体对转铁蛋白受体和主要组织相容性复合体-I（MHC）-I的再循环^［23］。内吞失调是多种癌症的特征^{［24， 25］}，因此，RAB22A异常表达可能与肿瘤发生发展有关。我们对过表达miR-204-5p的膀胱癌细胞的进行了转录组测序，测序结果表明，在过表达miR-204-5p后RAB22A的表达显著下调，并且在具有miR-204-5p碱基结合位点的3个在线生物信息学分析中，miR-204-5p存在于RAB22A的3'UTR区域。同时，分子生物学和双荧光素酶实验证实了miR-204-5p和RAB22A之间的靶向关系。在此基础上，再次进行了拯救实验，证明RAB22A过表达逆转了miR-204-5p对膀胱癌的肿瘤促进作用，即miR-204-5p通过负调节RAB22A来促进膀胱癌细胞的生物学行为。

本研究也存在一些不足之处：miR-204-5p以及RAB22A的下游是否存在其他的调控机制，通过何种信号通路来促进膀胱癌的进展；本研究的实验对象仅针对膀胱癌细胞，仍需通过在体实验证实miR-204-5p对膀胱癌的调控作用。

综上，本研究建立了膀胱癌细胞中miR-204-5p与RAB22A之间的功能联系，并表明miR-204-5p可通过靶向RAB22A来促进肿瘤的发生和发展。本研究为了解miRNAs在促进膀胱癌中的机制提供了新的视角。因此，靶向miR-204-5p可能是未来诊断和治疗膀胱癌的一种有前景的策略。

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基金资助

安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2021A0706)

安徽省卫健委科研项目重点课题(AHWI2021a007)

蚌埠医学院科技项目(2020bypd008)

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