NUF2对泛癌的预后和免疫治疗效果的预测价值

Predictive value of NUF2 for prognosis and immunotherapy responses in pan-cancer

摘要

目的 探讨NUF2表达水平与肿瘤预后的关系及在肿瘤微环境中的作用。 方法 综合利用人类蛋白质图谱（HPA）、癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达计划（GTEx）、癌细胞系百科全书（CCLE）、TIMER的数据集，采用生物信息学方法挖掘NUF2的潜在致癌作用，包括剖析NUF2在各种类型肿瘤组织中的表达水平、预后价值及免疫价值；采用RT-qPCR、Western blotting、免疫组化（IHC）等实验检测NUF2在肝癌细胞系和肝癌患者癌组织及血液中的表达情况。利用基因本体论（GO）、基因组百科全书（KEGG）和基因集富集分析（GSEA）探索NUF2及相关基因的分子机制并在肝癌中构建了NUF2的竞争性内源RNA（ceRNA）网络。 结果 与正常组织相比，NUF2表达在27种肿瘤中上调并与多种类型肿瘤的临床分期相关（P<0.05）。在部分肿瘤中，NUF2的表达上调与肿瘤患者的不良预后（总体生存期、疾病特异性生存期、无病生存期和无进展生存期）相关（P<0.05）。NUF2表达水平与多种肿瘤的肿瘤突变负荷、微卫星不稳定、浸润免疫细胞（B细胞、髓样树突状细胞、中性粒细胞、CD4⁺T细胞）、免疫细胞maker基因（CCR7、CD163、CD19、CD4、CD79A、CD8A、CD8B、IRF5、ITGAX和MS4A4A）以及免疫检查点基因（CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1和PDCD1LG2）呈正相关（P<0.05）。RT-qPCR等实验结果显示NUF2在肝癌细胞系、肝癌患者癌组织和血液中表达上调（P<0.05），其中肝癌患者经手术治疗之后，使得血液中NUF2表达下调（P<0.05）。GO 和 KEGG 富集分析表明，NUF2相关基因与染色体分离、微管运动以及细胞周期相关（P<0.05）。GSEA分析提示，在肝癌中NUF2高表达与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及调控神经活性配体受体相互作用有关（P<0.05）。 结论 NUF2在27种肿瘤中表达上调并与部分肿瘤的临床分期、不良预后有关。此外NUF2的表达与多种肿瘤的免疫细胞浸润密切相关，可能作为这些癌症免疫治疗效果的潜在预测因子。

Abstract

Objective To investigate the association of NUF2 expression with tumor prognosis and its regulatory role in tumor microenvironment. Methods We analyzed NUF2 expression, its prognostic value, and is immune-related functions across different cancer types using datasets from the Human Protein Atlas (HPA), TCGA, GTEx, CCLE, and TIMER. RT-qPCR, Western blotting, and immunohistochemistry were used to detect NUF2 expression in liver cancer cell lines and tissue and blood samples from patients with liver cancer. GO, KEGG, and GSEA analyses were conducted to explore the molecular mechanisms of NUF2 and its related genes, and a competitive endogenous RNA (ceRNA) network for NUF2 in liver cancer was constructed. Results NUF2 expression was upregulated in the tumor tissues of 27 cancers and was associated with clinical stages in several cancers. High NUF2 expressions were correlated with poor overall survival, disease-specific survival, progression-free survival, and disease-free survival of cancer patients. NUF2 expression levels were positively correlated with tumor mutational burden, microsatellite instability, infiltrating immune cells, immune cell marker genes and immune checkpoint genes in different cancers. RT-qPCR, Western blotting, and immunohistochemistry confirmed that NUF2 expression was upregulated in liver cancer cell lines and tumor tissues and blood samples of liver cancer patients, and was decreased significantly after operation. GO, KEGG and GSEA analyses indicated that NUF2 was involved in chromosome segregation and cell cycle and was associated with glycine, serine and threonine metabolism. Conclusion NUF2 expression is upregulated in 27 cancers and is associated with clinical stage and poor prognosis in some malignancies. NUF2 expression is closely correlated with immune cell infiltration in different cancers, suggesting its potential value for predicting immunotherapy response in these cancers.

Graphical abstract

关键词

NUF2 / 泛癌分析 / 免疫浸润 / 预后

Key words

NUF2 / pan-cancer analysis / immune infiltration / prognosis

癌症已经成为全球范围内的重大公共卫生问题，尤其在中国，癌症是主要的死亡原因之一^［1］。随着全球癌症新发病例和死亡病例数量的持续上升，预计到2050年，全球癌症新发病例将达到3500万^［2］。尽管癌症的治疗方法取得了一些进展，癌症的早期诊断、精准治疗以及免疫治疗的效果仍面临诸多挑战^［3］。尤其是如何通过早期标志物实现癌症的早期检测，如何针对不同类型癌症制定个性化的治疗策略，仍是当前癌症研究亟待解决的关键问题^［4］。

免疫疗法作为癌症治疗的第5大支柱，近年来取得了显著的进展，尤其在实体瘤和血液系统恶性肿瘤的治疗中展现出重要潜力^{［5， 6］}。然而，免疫治疗的临床效果仍存在个体差异，如何预测治疗反应并克服免疫逃逸现象，依然是制约免疫治疗广泛应用的瓶颈^［7］。因此，寻找新的分子标志物，特别是那些能够同时预测癌症预后和免疫治疗效果的标志物，已成为当前癌症研究的热点。

细胞分裂相关基因NUF2作为细胞分裂过程中关键的着丝粒-微管连接因子，近年来引起了广泛关注。它在维持有丝分裂过程中微管与着丝粒的正确连接中起着至关重要的作用^{［8， 9］}。此外，越来越多的研究表明，NUF2在多种癌症的发生发展中扮演了重要角色。例如，NUF2通过调控KDM2A和HMGA2的表达，促进肾透明细胞癌的增殖、迁移和侵袭^［10］；在卵巢癌中，NUF2通过激活PI3K-AKT和MAPK信号通路，促进肿瘤进展^［11］；在胆管癌中，NUF2则通过干预铁转运蛋白TFR1的自噬降解，促进肿瘤的发生^［12］。尽管已有研究表明NUF2在多个癌症中的促癌作用，但其在泛癌症中的免疫特征、预后价值及其系统性评估仍未被充分研究。因此，深入探讨NUF2在不同类型癌症中的作用及其免疫学特征，对于癌症的早期诊断、预后评估以及免疫治疗策略的优化具有重要意义。

本研究通过系统分析NUF2在多种癌症中的表达模式、免疫特征及预后价值，探索其在癌症发展中的具体作用及其潜在的分子机制。本研究进一步分析了NUF2的下游信号通路变化及其在肝细胞癌中的表达水平，并构建了NUF2在肝癌中的ceRNA调控网络。通过这些分析，希望为NUF2作为潜在的癌症生物标志物提供新的理论依据，并为癌症免疫治疗的个性化治疗策略提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人正常肝细胞（LO2）和人肝癌细胞（HepG2）均来源于中国科学院上海细胞库。细胞复苏后，采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，2d/次更换培养基。

1.1.2 血液标本

本研究中使用的组织标本及血液标本于2023年6月20日~2023年8月31日从广西医科大学第一附属医院病理科和检验科获得。临床标本包括10例配对的肝癌组织与正常肝组织；15例健康体检人员全血标本；29例肝癌患者全血标本；14例肝癌患者手术前以及手术后全血标本。所有患者均知情同意，本研究经广西医科大学伦理委员会批准（伦理批号：20200035）。

1.1.3 试剂

DMEM培养基、胎牛血清（biological industries）；TRIzol（UELandy）；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒（GenStar）；通用型免疫组化检测试剂盒（Proteintech）。

1.2 方法

1.2.1 数据集下载及数据处理

TCGA的RNA表达数据直接来自TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）数据库整理（癌旁727例，肿瘤9807例）；基因型-组织表达计划（GTEx）的RNA表达数据来源XENA数据库（https：//xena.ucsc.edu/）中经过Toil流程统一处理的数据（GTEx正常=7568例）。对两个数据库的数据进行联合分析，提取NUF2的表达谱，每个表达值进行log2（value+1）变换，剔除单个癌种中样本个数小于3个的癌症，最终获得33种肿瘤的表达数据。另外从癌细胞系百科全书（CCLE）数据库（https：//sites.broadinstitute.org/ccle/）获取了32类组织癌细胞系的表达矩阵（CCLE细胞系=1401）。所有结果利用R语言包ggpubr绘制箱线图，P<0.05表示差异有统计学意义。

1.2.2 NUF2在泛癌中的预后分析

从TCGA下载的样本中获取生存数据。以每个肿瘤中NUF2表达的中位数作为截断值，将患者分为高表达组和低表达组。通过Kaplan-Meier生存方法和log-rank检验评估每种癌症类型的生存数据。使用R语言包Survminer和Survival绘制生存曲线，P<0.05为差异有统计学意义。此外，采用单变量Cox模型来评估NUF2与泛癌之间的关系。如果风险比（HR）<1，则认为NUF2是癌症的保护因素；HR>1意味着NUF2是癌症的危险因素。结果以森林图呈现（使用R语言包forestplot）。

1.2.3 NUF2相关基因富集分析

通过使用STRING网站（https：//string-db.org/）构建NUF2高度置信（置信度>0.9）的蛋白-蛋白互作网络，并使用Cytoscape软件将其可视化。利用R语言包clusterProfiler对根据NUF2潜在互作网络筛选出的48个基因进行GO及KEGG富集分析。NUF2基因集富集（GSEA）分析选用“c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt”基因集和“TCGA-LIHC”表达数据，使用R包clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot和limma 对数据处理并可视化。

1.2.4 NUF2表达与肿瘤免疫分析

通过R语言包limma、preprocessCore和e1071以CIBERSORT算法评估TCGA所有泛癌标本中免疫细胞相对表达量，并与NUF2表达进行相关性分析。TIMER2.0 （http：//timer.cistrome.org/）网站提供了肿瘤浸润免疫细胞的综合分析和可视化功能^［13］。通过TIMER2.0网站，输入相关免疫细胞及基因，勾选“Purity Adjustment”，获得了NUF2表达与免疫细胞浸润（TIMER算法）、免疫细胞maker基因以及免疫检查点相关基因表达相关性数据。所有结果通过ggpubr包绘制热图。

1.2.5 肿瘤突变负荷（TMB）与微卫星不稳定（MSI）分析

从UCSC XENA数据库下载所有TCGA患者的体细胞突变数据，并计算TMB评分。利用R软件分析NUF2基因表达与肿瘤突变负荷的关系，结果用R语言包fmsb绘制雷达图。

1.2.6 ceRNA调控网络分析

利用ENCORI数据库（https：//rnasysu.com/ ENCORI /）探索可能调控NUF2的miRNA，以及靶向miRNA的lncRNA。通过miRNA-mRNA、miRNA-lncRNA共表达分析（筛选条件分别为“cor<-0.2，P<0.01”和“cor<-0.2，P<0.01，miLogFC*lncLogFC<0，diff P<0.05”）进一步筛选在肝细胞癌中与NUF2表达相关的miRNA和lncRNA。然后用Cytoscape软件构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络，其中肝细胞癌miRNA表达数据来源于TCGA（https：// portal. gdc. cancer. gov/）数据库，数据处理及可视化通过R语言包limma、ggpubr和ggExtra实现。

1.2.7 RT-qPCR检测

TRIzol法用于从全血和细胞中提取总RNA，随后使用反转录试剂盒和荧光定量qPCR试剂盒进行反转录和定量分析。ACTIN作为内参基因，在荧光定量PCR仪（Eppendorf）上进行扩增。PCR扩增采用两步法标准程序：第1步为预变性，95 ℃ 2 min，进行1个循环；第2步为PCR反应，包括95 ℃预变性15 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。最后，进行熔解曲线分析，以评估扩增结果的可信度。实验中使用的引物由南宁捷尼斯生物技术公司合成（表1）。

1.2.8 免疫印记检测

使用含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液提取细胞总蛋白，随后利用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，将蛋白质转移到PVDF膜上，并用5%脱脂牛奶封闭。接着，将膜与特异性一抗（NUF2，1∶1000，Proteintech；ACTIN，1∶1000，Proteintech）在4 ℃孵育过夜。孵育二抗（抗兔，1∶10 000，Proteintech）后，使用化学发光检测试剂进行反应，并在ImageJ中进行定量分析。

1.2.9 免疫组化

组织切片在60 ℃下烘烤1 h，然后用二甲苯脱蜡，接着用梯度乙醇进行水合。随后，将切片置于柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，在高压下加热2 min以修复抗原。用3%过氧化氢溶液浸泡10 min，去除内源性过氧化物酶。将切片与抗NUF2抗体（1∶200，Proteintech）在4 ℃下孵育过夜，然后与二抗（抗兔，1∶10 000，Proteintech）在37 ℃下孵育30 min。进行DAB着色4~5 min，苏木精染色1 min，并在分化液中分化20 s。用自来水洗涤后进行脱水处理，最后用中性树脂封片。评估5个随机选择区域中细胞染色的强度，并用ImageJ进行定量分析。

1.2.10 统计学分析

统计学分析选用R软件（4.2.1）和SPSS 22.0完成。两组间比较采用独立样本t检验和Wilcoxon检验；相关性分析选择Spearman相关性分析；Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验比较生存差异。P<0.05为差异有统计学意义。所有实验都是独立重复3次。

2 结果

2.1 NUF2在27种癌症组织高表达且与临床分期相关

在正常组织中，NUF2在睾丸和免疫系统中表达较高（图1A）。与正常组织相比，NUF2在27种癌症组织中表达显著升高，如肾上腺皮质癌（ACC）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺浸润癌（BRCA）、宫颈鳞癌和腺癌（CESC）、胆管癌（CHOL）、结肠癌（COAD）等。相反，在急性髓系白血病（LAML）和睾丸癌（TGCT）组织中NUF2表达下调（图2B）。此外，NUF2在多种癌细胞系中普遍高表达（图1C），与TCGA数据库分析结果一致。而在ACC、BRCA、肾嫌色细胞癌（KICH）、肾透明细胞癌（KIRC）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肝细胞肝癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、皮肤黑色素瘤（SKCM）和甲状腺癌（THCA）等10种癌症中，NUF2表达与临床分期相关（图1D）。

2.2 NUF2表达与部分癌症患者的不良预后相关

总生存期（OS）单因素Cox回归分析表明，NUF2的表达水平与ACC、KICH、KIRC、KIRP、脑低级别胶质瘤（LGG）、LIHC、LUAD、间皮瘤（MESO）、胰腺癌（PAAD）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、肉瘤（SARC）、子宫内膜癌（UCEC）和葡萄膜黑色素瘤（UVM）等13种癌症患者的总生存期相关，并且NUF2是这些肿瘤的高风险因素。相反，在胸腺癌（THYM）患者中，NUF2是THYM患者总生存期的低风险因素（图2A）。这些结果在K-M生存曲线中得到了验证。在THYM患者中，高表达NUF2与较长的总生存期相关；而在ACC、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、MESO、PCPG和UCEC等9种癌症患者中，高表达NUF2则与较短的总生存期相关（图2B~K）。

无病生存期（DFS）单因素Cox回归分析表明，NUF2是KIRP、LIHC、PAAD、前列腺癌（PRAD）、SARC、THCA和UCEC等7种癌症患者无病生存期的高风险因素（图3A），K-M生存曲线表明：在ACC、KIRP、LIHC、LUAD、THCA、UCEC和子宫肉瘤（UCS）等7种癌症患者中低表达NUF2无病生存期较长，高表达NUF2无病生存期较短（图3B~H）。

疾病特异性生存期（DSS）单因素Cox回归分析表明，NUF2是ACC、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、MESO、PAAD、PCPG、PRAD、THCA、UCEC和UVM等14种癌症患者疾病特异性生存期的高风险因素（图4A），K-M生存曲线表明：在ACC、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LIAD、MESO、PCPG和UCEC等10种癌症患者中低表达NUF2疾病特异性生存期较长，高表达NUF2疾病特异性生存期较短（图4B~K）。

无进展生存期（PFS）单因素Cox回归分析表明，NUF2是ACC、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、MESO、PAAD、PCPG、PRAD、SARC、THCA、UCEC和UVM等15种癌症患者无进展生存期的高风险因素（图5A），K-M生存曲线表明：在ACC、多形性成胶质细胞瘤（GBM）、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、SARC、MESO、PRAD、THCA、UVM和UCEC等13种癌症患者中低表达NUF2无进展生存期较长，高表达NUF2无进展生存期较短（图5B~N）。

2.3 NUF2表达与22种癌症组织的肿瘤突变负荷和11种癌症组织的微卫星不稳定正相关

在ACC、BLCA、BRCA、CESC、COAD、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、KICH、KIRC、LGG、LUAD、LUSC、MESO、卵巢癌（OV）、PAAD、PRAD、直肠腺癌（READ）、SARC、SKCM、胃腺癌（STAD）、TGCT、THCA和UCEC等22种癌症组织中，NUF2的表达与肿瘤突变负荷存在正相关，而在THYM组织中，NUF2的表达与肿瘤突变负荷存在负相关（图6A）。此外，NUF2的表达与BLCA、COAD、HNSC、LIHC、LUSC、PRAD、READ、SARC、STAD、THCA和UCEC等11种癌症组织的微卫星不稳定存在正相关（图6B）。

2.4 泛癌中NUF2表达与多种肿瘤免疫细胞浸润及免疫相关基因呈正相关

TIMER数据库结果表明，NUF2表达水平与多种肿瘤浸润免疫细胞相关，尤其在LIHC和THYM组织中，NUF2与B细胞、髓样树突状细胞、中性粒细胞、CD4⁺T细胞等免疫细胞呈正相关，而在STAD和TGCT组织中，NUF2与髓样树突状细胞、中性粒细胞、CD4⁺T细胞等免疫细胞呈负相关（图7A）。不同分类免疫细胞在泛癌中有较大差异，例如在多数肿瘤组织中活化的CD4记忆T细胞、滤泡性辅助T细胞、M0型巨噬细胞、M1型巨噬细与NUF2的表达呈正相关，而单核细胞、M2型巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞与NUF2的表达呈负相关（图7B）。

NUF2与免疫细胞maker基因相关性分析显示：在LIHC、THCA、LGG、KIRC、HNSC和BRCA癌症组织中，NUF2表达与CCR7、CD163、CD19、CD4、CD79A、CD8A、CD8B、IRF5、ITGAX和MS4A4A等10种免疫细胞maker基因呈正相关。而在STAD、TGCT和UCEC癌症组织中，NUF2表达与CD19、CD1C、CD4、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQB1和HLA-DRA等7种免疫细胞maker基因呈负相关（图7C）。NUF2表达与8种常见免疫检查点基因之间的联系也得到了相似的结果：NUF2的表达在LIHC、THCA、LGG、KIRC等癌症组织中与CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2等5种免疫检查点基因的表达呈正相关（图7D）。

2.5 NUF2可作为肝癌诊断及预后的潜在预测因子

在肝癌细胞系HepG2中，NUF2的mRNA和蛋白表达水平相较于正常肝细胞L02明显升高（P<0.0001，图8A、B），这与CCLE数据库结果一致。此外，免疫组化和qPCR结果显示肝癌患者的癌组织和血液中NUF2的表达水平也升高（P<0.05，图8C、D），在经过手术治疗后，肝癌患者的血液中NUF2的表达水平下降（P<0.01，图8E）。

2.6 NUF2的分子功能分析

从STRING数据库中获取了48个与NUF2相关性最强的基因，进一步分析NUF2的功能特征，构建潜在的相互作用网络（图9A）。GO富集分析表明，NUF2是着丝粒的组成成分，可以与微管蛋白结合，通过参与微管运动从而影响染色体分离。KEGG富集分析显示，NUF2主要参与细胞周期相关通路（图9B）。GSVA富集分析则显示，NUF2在肝癌中主要参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及调控神经活性配体受体相互作用（图9C）。

利用ENCORI软件预测了靶向NUF2的12种miRNA，其中10种miRNA在肝癌中表达（图9D）。然后通过miRNA-mRNA共表达分析，得到与NUF2表达负相关的miRNA：“hsa-miR-22-3p”（图9E）。继续利用ENCORI软件预测靶向hsa-miR-22-3p的lncRNA，得到54种lncRNA，再通过miRNA-lncRNA共表达分析，得到符合条件的9个lncRNA：COLCA1、LINC00339、FGD5-AS1、GUSBP11、SNHG29、SNHG14、SLC25A25-AS1、SNHG16、LINC00630。最后构建了NUF2在肝癌中可能的ceRNA调控网络（图9F）。

3 讨论

迄今为止，癌症相关研究一直是当前医学领域的研究重点。利用TCGA和CCLE平台的33个癌症相关数据，通过基因表达差异分析，探索适合广谱癌症诊断的生物标志物是现在的热点。本研究利用TCGA、GETx和TIMER2.0数据库，首次对NUF2在多种肿瘤中的表达、肿瘤预后以及肿瘤免疫功能进行了整体分析。结果显示，NUF2在大多数肿瘤中表达较高，并与某些肿瘤的临床分期和不良预后相关。此外，我们还发现NUF2与部分肿瘤的肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、免疫细胞浸润以及免疫检查点基因存在相关性。我们还探讨了NUF2在泛癌中的分子功能并预测了NUF2在肝癌中的ceRNA调控网络。这些结果表明了NUF2在不同癌症中的表达、预后价值和分子特征，对于发现新的肿瘤治疗靶点具有重要意义。

泛癌的差异分析显示，THYM、SKCM和SARC这3种癌症组织由于数据库正常样本数量不足，无法做统计学分析，然而，NUF2在剩下的30种癌症组织中有27种癌症显著过表达，包括：ACC、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、MESO、PCPG和UCEC等。其中，部分肿瘤近期已被文献报道：NUF2参与乳腺癌^{［14， 15］}、卵巢癌^［16］、胆管癌^［12］、胃癌^［17］、肺腺癌^［18］、肾透明细胞癌^［10］、骨肉瘤^［19］、脑胶质细胞瘤^［20］、肝癌^［21］、直肠癌^［22］等多种肿瘤的发生和发展，还与这些肿瘤患者的生存和预后有关。这也基本与我们的预后分析结果相一致：在ACC、LIHC等部分肿瘤中，NUF2的表达上调与肿瘤患者的不良预后相关。在THYM患者中，NUF2高表达组反而预后更好。由于NUF2与THYM患者的COX回归分析中，HR值都是小于1，所以我们推测NUF2表达的上调可能在THYM组织的发育中起防御作用。不仅如此，我们在后续免疫浸润分析中也发现，在THYM组织中NUF2表达与CD8⁺ T细胞浸润水平高度正相关，而高水平的免疫细胞浸润，特别是活跃的CD8⁺ T细胞，通常与患者的生存期延长和较好的临床结局相关联^［23-25］。因此，我们考虑在THYM患者中，高表达NUF2通过诱导肿瘤浸润淋巴细胞（特别是CD8⁺ T细胞）的迁移和活化，增强了肿瘤免疫浸润和抗肿瘤免疫反应，从而改善患者的预后。并且，类似机制也在别的研究中得以证实：CXCL11通过促进抗肿瘤免疫以促进结肠癌患者的生存^［26］。

进一步研究NUF2是否在肿瘤免疫治疗中发挥作用，我们对其表达与TMB和MSI进行了相关性分析，结果显示：NUF2在ACC、BLCA、BRCA、CESC、COAD、HNSC、KICH等22种肿瘤中与TMB显著正相关，在ACC、BLCA、BRCA、CESC、COAD等11种肿瘤中与MSI显著正相关。既往研究发现，肿瘤突变负荷与多种癌症类型免疫治疗后的预后相关，携带高突变负荷的肿瘤患者通常表现出更高的治疗反应率和更长的生存期^{［27， 28］}。由此，我们推断NUF2表达可能影响部分肿瘤患者的预后并可以作为这些肿瘤抗癌免疫治疗的新药靶点。此外，高突变负荷的肿瘤样本通常具有更高水平的免疫细胞浸润，并且与免疫相关基因表达模式密切相关^{［29， 30］}。我们也观察到在LIHC、THCA等多种肿瘤组织中NUF2表达水平与浸润免疫细胞（B细胞、髓样树突状细胞、中性粒细胞、CD4⁺T细胞）、免疫细胞maker基因（CCR7、CD163、CD19、CD4、CD79A、CD8A、CD8B、IRF5、ITGAX和MS4A4A）以及免疫检查点基因（CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1和PDCD1LG2）呈显著正相关。另一方面，肿瘤组织中免疫相关基因的高表达又与抗PD-L1治疗的更好反应性相关^［31］，这种相关性已在卵巢癌、非小细胞肺癌等癌症中所证实^［32-34］。这进一步说明部分肿瘤中，NUF2通过改变患者免疫微环境从而影响肿瘤患者的预后，也为免疫抑制剂的开发提供了新的靶点，推测NUF2可能可以作为这些类型癌症免疫治疗效果的潜在预测因子。

鉴于NUF2在肝癌表达、预后及免疫分析中的良好表现，我们采用RT-qPCR、WB和免疫组化检测NUF2在肝癌细胞系和患者血液与组织中的表达。结果显示NUF2在肝癌细胞系比正常肝细胞表达升高，并且在肝癌患者组织和血液中表达上调，其中肝癌患者经手术治疗之后，会使得血液中NUF2表达下调。这也与部分报导相吻合^［21］，进一步证实NUF2在肝癌的发生发展中发挥重要作用，可作为肝癌诊断及预后的潜在预测因子。此外，我们还进一步分析了NUF2在肝癌可能涉及的通路以及ceRNA调控网络，这些通路及网络可能在调节肿瘤相关基因表达、影响肿瘤细胞生物学特性等方面发挥重要作用，可以为癌症治疗提供了新的研究方向和可能性^［35］，但还需要后续实验验证。

综上所述，NUF2在27种肿瘤中表达上调，并且与部分肿瘤的临床分期和不良预后密切相关，可能作为这些肿瘤诊断与预后的重要预测因子。此外，NUF2的表达与多种肿瘤的肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、免疫浸润以及免疫调节相关因子显著相关，表明其可能成为这类肿瘤免疫治疗的潜在靶点。本研究存在的局限性：我们的研究结果主要基于生物信息学分析，且NUF2在肝癌中的表达仅通过RT-qPCR等少量实验验证；没有阐明NUF2在癌症中的分子机制，未来仍需要进一步研究。

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