Ag₂Se纳米颗粒通过清除牙龈卟啉单胞菌抑制食管癌恶性进展

Ag₂Se nanoparticles suppress growth of murine esophageal cancer allograft in mice by eliminating Porphyromonas gingivalis

摘要

目的 探讨Ag₂Se纳米颗粒清除食管癌胞内牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的有效性，并研究清除P. gingivalis后对食管癌恶性进展的影响。 方法 采用化学合成法制备Ag₂Se纳米颗粒，通过荧光染色分析和菌落形成实验，评估Ag₂Se纳米颗粒对P. gingivalis活性和克隆形成能力的影响；构建P. gingivalis感染的小鼠食管癌皮下荷瘤模型，通过RNAscope原位杂交和定量聚合酶链反应（qPCR）测定治疗后肿瘤组织中P. gingivalis的丰度，并监测荷瘤小鼠肿瘤体积的变化，以评估Ag₂Se纳米颗粒清除肿瘤组织中P. gingivalis后对小鼠食管癌恶性进展的影响。通过评估小鼠肝肾功能及主要脏器的病理变化，以评估Ag₂Se纳米颗粒的生物安全性。 结果 透射电子显微镜（TEM）的结果显示，本研究制备的Ag₂Se为直径50 nm左右的均匀分散球形纳米颗粒。体外实验结果表明Ag₂Se纳米颗粒能降低P. gingivalis的活力和克隆增殖能力，且随浓度的增加而逐渐增强（P<0.05）。体内实验结果证实，经Ag₂Se纳米颗粒治疗后，小鼠肿瘤组织中P. gingivalis的丰度降低、恶性增殖能力得到抑制（P<0.01）。治疗期间小鼠的肝肾功能和主要脏器未出现明显损伤，提示Ag₂Se纳米颗粒具有良好的生物相容性。 结论 Ag₂Se纳米颗粒对P. gingivalis具有显著的杀伤和抑制作用，在体内可有效清除胞内P. gingivalis，抑制食管癌的恶性进展，为食管癌的预防和治疗提供新的理论依据。

Abstract

Objectives To investigate the efficacy of Ag₂Se nanoparticles for eliminating intracellular Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) in esophageal cancer and examine the effect of P. gingivalis clearance on progression of esophageal cancer. Methods Ag₂Se nanoparticles were synthesized via a chemical synthesis method. The effects of Ag₂Se nanoparticles on P. gingivalis viability and colony-forming ability were assessed using fluorescence staining and colony formation assays. In a mouse model bearing subcutaneous murine esophageal cancer cell allograft with P. gingivalis infection, the effect of treatment with Ag₂Se nanoparticles on the abundance of P. gingivalis in the tumor tissues was quantified using RNAscope in situ hybridization and quantitative polymerase chain reaction (qPCR), and the changes in tumor volume were monitored. The biosafety of Ag₂Se nanoparticles was assessed by examining liver and kidney functions and pathological changes in the major organs of the mice. Results Transmission electron microscopy revealed that the synthesized Ag₂Se nanoparticles were uniformly dispersed spherical particles with a diameter around 50 nm. In vitro experiments demonstrated that exposure to Ag₂Se nanoparticles significantly reduced the viability and clonal proliferation capacity of P. gingivalis in a dose-dependent manner. In the tumor-bearing mice, treatment with Ag₂Se nanoparticles significantly reduced the abundance of P. gingivalis in tumor tissues and suppressed tumor cell proliferation. No significant damages to the liver and kidney functions or the major organs were observed in Ag₂Se nanoparticle-treated mice, demonstrating good biocompatibility of Ag₂Se nanoparticles. Conclusion Ag₂Se nanoparticles exhibit significant bactericidal and inhibitory effects against P. gingivalis, and can effectively eliminate intracellular P. gingivalis to suppress the growth of esophageal cancer allograft in mice, suggesting the potential of Ag₂Se nanoparticles in the treatment of esophageal cancer.

Graphical abstract

关键词

食管癌 / 牙龈卟啉单胞菌 / 纳米材料 / 酸响应性

Key words

esophageal cancer / Porphyromonas gingivalis / nanomaterials / acid responsive ness

癌症与微生物之间的相互作用已经成为医学研究的热点领域之一。据统计，全球约有16%的癌症的恶性进展与传染性病原体相关^［1］。如胃癌和幽门螺杆菌^{［2， 3］}，宫颈癌与人乳头瘤病毒^［4］，具核梭杆菌与结直肠癌等^{［5， 6］}。在肿瘤微环境中，瘤内菌作为新兴的重要组成部分，对肿瘤的发生、发展、治疗效果以及转移过程均产生影响^［7-9］。我们团队的前期研究已经证实，牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）在食管癌组织中的存在与化疗抵抗性、化疗后复发风险增加以及患者生存期缩短有关^［10-12］。目前在癌症治疗方法中，抗菌治疗已被用于解决或预防已知的微生物致癌因素，但反复使用抗生素治疗可能会带来严重的副作用，如微生物群落的破坏，性激素代谢的改变，从而增加其他癌症的风险^［13-16］。

随着纳米技术的发展，纳米材料在肿瘤治疗和抗菌治疗中的应用逐渐成为研究的新趋势^［17］。纳米材料因其精准治疗、粒径可控、易于穿透生物组织以及较低的耐药性和毒副作用等优势而受到关注^［18］。因此，开发无创、无毒、无耐药性且具有更高疗效和成功率的新型抗菌活性纳米材料显得尤为重要。而Ag₂Se纳米材料作为一种双阳离子纳米级材料，在细胞内直接以Ag⁺的形式存在，且在肿瘤微酸性环境内可加速Ag⁺的释放^［19］，并且其超小、可控粒径、高比表面积、酸响应性等优势^［20］，借助增强渗透和保留（EPR）^［21］效应在肿瘤组织中均匀分布，从而提高治疗的均一性和效率。此外，其Zeta电位为正值，可通过静电吸附作用与带负电荷的细菌细胞壁相结合，展现出更高效的杀菌能力^［22］。

目前已有研究探索了Ag₂Se纳米颗粒在抗菌或抗肿瘤治疗中的潜力。例如，Ren等^［23］通过生物合成具有优异生物相容性的广谱抗菌剂Ag₂Se纳米粒子在抑制和消除由金黄色葡萄球菌形成的生物膜方面表现出优异的功效。Ozdal等^［24］利用铜绿假单胞菌绿色合成Ag₂Se纳米粒子评估对多种病原菌具有显著的抗菌活性。但生物合成的纳米材料具有尺寸与形貌可控性差、产率低、杂质多、反应条件不稳定等缺点^{［25， 26］}，然而化学合成法能够精确地控制纳米颗粒的尺寸、形貌和分散性，可以选择不同的合成方法（如溶剂热法、共沉淀法、微乳液法），灵活设计纳米颗粒的性能，以满足不同应用领域的需求。并且化学合成能够大规模生产，成本远低于生物合成^［27］。Yang等^［28］通过配体交换策略合成了由十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）修饰的Ag₂Se纳米颗粒，发现其在近红外辐射下对MCF-7乳腺癌细胞表现出显著的抗肿瘤能力。但清除肿瘤组织胞内细菌的研究相对有限。

为了深入研究Ag₂Se对食管癌组织中P. gingivalis的抑制和杀伤作用，本研究通过化学合成法制备出尺寸、形态均一且可控的Ag₂Se纳米颗粒，利用肿瘤组织微酸环境促进Ag⁺的释放，继而高效抑制胞内P. gingivalis的克隆增殖能力和存活率，并通过构建皮下荷瘤模型进一步探讨其在清除胞内P. gingivalis后对小鼠食管癌恶性进展的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 细胞、细菌和动物模型

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞株购自中国科学院细胞库，小鼠食管癌细胞系AKR购自ATCC细胞库。P. gingivalis来源于河南省肿瘤表观遗传重点实验室提取的原代菌株。所用动物为6~8周龄SPF级C57BL/6雄鼠，体质量18~20 g（斯贝福（北京）生物技术有限公司）。

1.2 主要试剂

DMEM基础培养基、RPMI 1640基础培养基和胎牛血清（FBS，Procell）；胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、胰蛋白酶（普诺赛）；青-链霉素、脱纤维绵羊血（无菌）、苛养厌氧菌肉汤、Argar（索莱宝）。细菌活力检测试剂盒（AAT Bioquest）；RNAscope试剂盒（ACD）；亚硒酸（H₂SeO₃）、水合肼（N₂H₄）、聚乙烯基吡罗烷酮（PVP）、硝酸银（AgNO₃）、乙二醇（HOCH₂CH₂OH）（麦克林）。

1.3 主要仪器设备

CO₂培养箱（Thermo Fisher）、厌氧培养箱（Shellab）、激光共聚焦显微镜（Zeiss）、多功能酶标仪（Biotek）、荧光定量PCR仪（Bio Rad）。

1.4 Ag₂Se 纳米颗粒的制备和表征

单分散a-Se胶球的合成：将溶解在乙二醇中的水合肼溶液（20 mL，0.7 mol/L）加入到含80 mL纯乙二醇的250 mL圆底烧瓶中。使用水浴将温度保持在15~20 ℃。磁力搅拌10 min后，加入0.07 mol/L的亚硒酸溶液（溶解在乙二醇中）20 mL，反应1 h。在合成过程中，可以通过改变水合肼和亚硒酸的摩尔比来控制Se胶体的大小。由于乙二醇属粘性溶剂，可以更好地控制元素硒的转换，利用成核事件的生长动力学，从而下形成单分散的样品。

Se@Ag₂Se核壳胶体球的合成：将含2.4 g PVP的80 mL乙二醇溶液加入上述a-Se悬浮液中。真空蒸馏完全去除肼后，在10 min内滴入AgNO₃溶液（0.1 g/1.5 mL乙二醇），使颜色由浅红色变为深棕色。反应2 h后，加入210 mL的水，将核壳颗粒离心，用水洗涤4次，去除乙二醇和多余的PVP。在此过程中，Ag⁺被乙二醇还原为Ag，Ag与Se反应形成由a-Se核和Ag₂Se壳组成的均匀胶体球，最后在常温条件下进行蒸发干燥。

Ag₂Se纳米颗粒形貌表征：利用透射电镜（TEM）设置工作电压为200 kV加速电压，放大200 000倍，对本研究制备的Ag₂Se纳米颗粒形貌进行表征。样本制备过程如下：将样品分散在乙醇中，然后超声处理；再将悬浊液滴到镀有碳膜的铜网上，随后放在样品台上抽真空后观察。使用JEOL/JEM 2100型号TEM测定Ag₂Se纳米颗粒的形貌、大小及分散性。利用ImageJ软件对Ag₂Se纳米颗粒的TEM图像进行尺寸分布分析。利用能量色散谱仪（EDS）测量样品元素组成（Thermo Fisher，利用X射线衍射仪（XRD，D8 ADVANCE）对制备的Ag₂Se进行晶像结构分析。

1.5 细胞及P. gingivalis原代菌株的培养

HUVEC、AKR细胞复苏后用含10%的FBS与DMEM培养液于37 ℃、5% CO₂ 的恒温培养箱中培养，细胞生长至80%~90 %融合度时传代，取对数生长期细胞进行后续实验。P. gingivalis原代菌株在TSB培养基中培养，培养条件为含10% CO₂、5% H₂、85 % N₂的37 ℃厌氧箱中，菌株传至第2或第3代，当其处于对数生长期时，用于后续实验。实验中，根据感染复数（MOI）为20的标准，对AKR细胞进行P. gingivalis感染，构建胞-菌共生体，用于后续治疗研究。

1.6 体外抑菌实验

在进行Ag₂Se纳米颗粒体外抑菌实验之前，首先测定其半数抑制浓度（IC₅₀）值。将药物浓度梯度稀释后，与P. gingivalis孵育24 h，孵育结束后测不同药物浓度菌悬液的紫外吸光度A值，收集数据。结果提示Ag₂Se的IC₅₀值为70.39 µg/mL。我们选择Ag₂Se浓度为80 µg/mL和甲硝唑（MZS）浓度为80 µg/mL进行后续实验。

制备血琼脂平板：将琼脂（15 µg/mL）、苛养厌氧肉汤（29.7 µg/mL）与去离子水混合，进行高温灭菌处理。灭菌后，将混合物冷却至60 ℃ 时，加入维生素K₁（0.5 µg/mL）、Hemin（10 µg/mL），充分混匀，随后添加5 %的羊血，再次混匀。将上述混合物缓慢且均匀地倒入细菌培养皿中，每个培养皿倒入10 mL，注意避免产生气泡。在超净台中关闭风机，让平板冷却固化，然后将平板倒置放置于37 ℃的厌氧环境中（气体组成为10% CO₂，5% H₂，85 % N₂），缓冲12 h。

菌落形成实验：取对数生长期的P. gingivalis，测紫外吸光度A_{600 nm}值。取A_{600 nm}=1.0的菌液，分对照组（Con）、MZS组、Ag₂Se组各1 mL，12 000 r/min离心后分别用Ag₂Se、MZS、无菌生理盐水重悬后孵育4 h。将孵育后的菌液稀释至1×10⁵ CFU/mL，然后取100 μL均匀涂布于琼脂平板中。将平板倒置于37 ℃的厌氧环境中培养7 d，培养结束后取出，拍照记录。

生长曲线：同样方法获取A_{600 nm}=1.0的菌液，与无菌生理盐水、MZS和Ag₂Se纳米颗粒溶液在37 ℃的厌氧条件下孵育。分别在6、12、18、24、36、48、60和72 h的时间点，采集各组菌液，将其用生理盐水稀释至上述浓度，然后取100 μL稀释后的菌液涂布在血琼脂平板上。将平板倒置于37 ℃的厌氧箱中培养1周，当有肉眼可见的菌落形成时，取出拍照。使用ImageJ软件行菌落计数。根据所得的菌落数数据，绘制细菌生长曲线。

细菌活力测定：同样方法获取A_{600 nm}=1.5的菌液，4 ℃离心2 min后，用Ag₂Se纳米颗粒、MZS、无菌生理盐水各1 mL重悬细菌沉淀，于37 ℃温箱孵育4 h。采用AAT Bioquest公司的Mycolight™细菌活力测定试剂盒，按照说明书配制工作液，进行细菌染色。染色后15 min，使用共聚焦显微镜观察并拍照记录。

1.7 动物实验

进行动物实验以评估Ag₂Se纳米颗粒的体内抑菌效果时，实验流程严格遵守科学规范，并通过河南科技大学第一附属医院伦理审核（伦理批号：2022-03-B111）。培养AKR细胞至对数期时，以MOI 20连续感染3次P. gingivalis，然后收集AKR细胞，在C57BL/6小鼠背部右侧皮下注射，每只小鼠100 μL细胞悬液（浓度为1×10⁷/mL），以构建皮下荷瘤小鼠模型。待肿瘤体积生长至100 mm³时，将小鼠随机分为3组（n=5）：无菌生理盐水（Saline）组、MZS组和Ag₂Se组。在实验期间，1次/2 d通过尾静脉注射药物，以维持稳定的血药浓度。1次/2 d测量荷瘤小鼠的体质量和肿瘤体积，以监测其变化。

实验持续12 d后，对小鼠实施安乐死，分离心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行HE染色。将肿瘤组织用4%多聚甲醛溶液固定，后包埋于石蜡中行组织切片，将切片固定在载玻片上，用于RNAscope原位杂交实验。

1.8 RNAscope原位杂交

RNAscope原位杂交技术是根据试剂说明书，使用合适的探针进行的。用P. gingivalis 16S rRNA特异性寡核苷酸（Takara）探针检测组织切片。在进行RNAscope检测前，将组织切片在65 ℃下烘烤，以固定切片。使用二甲苯进行脱蜡处理，接着通过透化步骤使细胞膜变得通透，以便探针能够进入细胞。在无水乙醇中行脱水处理后，进行抗原修复，以增强探针与RNA的结合。使用蛋白酶对切片进行处理，进一步增强探针的进入与结合率。根据RNAscope 原位杂交技术试剂盒的说明书，依次加入试剂，并在40 ℃的温箱中进行孵育。接下来进行RNAscope显色检测。两种显色方式：使用TSA Vivid荧光染料520增强P. gingivalis 16S RNA分子信号强度，行荧光显色；使用碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的探针进行染色，利用DAB进行显色，在普通光学显微镜下进行观察。并统计在细胞水平上P. gingivalis的表达量。

1.9 生物相容性

取对数生长期的HUVEC细胞，细胞以5000 /孔的密度接种于96孔板中。待细胞贴壁后，设置包含10个不同浓度梯度的Ag₂Se纳米颗粒悬液（分别为0、40、60、80、100、120、140、160、180、200 µg/mL），并在37 ℃、5% CO₂的条件下孵育24 h。孵育结束后，弃上清液，向每个孔中加入CCK-8试剂，并继续孵育1~4 h以允许充分反应。使用酶标仪检测各孔的吸光度值A_{450 nm}。细胞存活率（%）=（A_sample /A_control）×100%。对所得数据进行统计分析。

溶血试验：使用EDTA抗凝血管收集小鼠的新鲜血液，在4 ℃下离心（2000 r/min，5min），收集下层红细胞，用PBS洗涤两次。用生理盐水将离心得到的红细胞沉淀稀释成2%的红细胞悬液，分成7组：阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（蒸馏水）、5个试验组分别加入不同浓度（25、50、100、150、200 μg/mL）Ag₂Se纳米颗粒溶液各0.5 mL，将试管放入37 ℃水浴箱中孵育30 min，随后每支试管中再分别加入0.5 mL红细胞稀释悬液。混匀后于37 ℃水浴60 min，取出后以3000 r/min离心5 min后，将上清液转移至96孔板中，测定各标本吸光度A_{540 nm}。溶血百分比（HP）=［AS -Ac_（-）］/［Ac_（+）-Ac_（-）］×100%。其中，AS、Ac_（-）和 Ac_（+）表示试验组、阴性对照组和阳性对照组的吸光度。

1.10 肿瘤DNA提取和qPCR实验

采用离心柱法，使用DNA试剂盒（Omega Biotek）提取小鼠肿瘤组织的DNA。采用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定提取DNA的浓度和纯度。鼠源肿瘤组织样本的DNA分别稀释10倍或100倍，以方便下游分析。用ΔCt值计算相对丰度。采用罗氏公司的Applied LightCycler 96定量PCR系统进行实时荧光定量PCR。每个样本进行3次重复实验以确保结果的准确性。实验中所用的引物和探针序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成提供。

1.11 统计学方法

计量资料以均数±标准差表示。数据分析工作采用SPSS 26.0和GraphPad Prism软件进行。3组或以上数据的比较采用单因素方差分析。当P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ag₂Se纳米颗粒表征结果

基于化学方法合成Ag₂Se纳米颗粒，用TEM表征纳米材料的形态（图1A），结果显示Ag₂Se纳米颗粒形态为球形，表面光滑，粒径大小在50 nm左右，均匀分散，无聚团（图1B）。利用紫外分光光度计测量不同浓度Ag₂Se纳米颗粒的紫外-可见光吸收光谱，可见吸光度值与Ag₂Se纳米颗粒的浓度之间呈正相关（图1E、F），Ag₂Se纳米颗粒的光学特性能够通过调整其浓度来精确控制，呈线性关系，为后续的定量分析提供了基础。EDS谱图中检测到Ag和Se元素，且没有其他杂质元素的显著峰（如氧、碳、硫等），Ag的原子百分比为70.7%，Se为29.3%，原子比接近理论值（Ag₂Se中Ag：Se理论原子比为2：1，即66.67%：33.33%），说明在合成过程中没有明显的杂质引入（图1C）。X射线衍射（XRD）对晶体结构进行测定，对比实验得到的XRD图谱与标准的PDF卡片（如PDF#24-1041），图谱中出现的衍射峰的位置（2θ值）与已知的Ag₂Se晶体结构相对应（图1D），没有额外的峰出现，可以认为Ag₂Se纳米颗粒具有较高的纯度。

2.2 Ag₂Se纳米颗粒体外抑菌评估

通过拟合不同浓度Ag₂Se纳米颗粒的细菌存活率数据，求其IC₅₀为70.39 µg/mL（图2E、F）。在菌落形成实验中（图2A、B）发现与对照组和阳性对照组MZS相比，Ag₂Se纳米颗粒治疗后菌落形成数量减少，差异有统计学意义（P<0.05）。通过荧光染色评估细菌活力， Ag₂Se纳米颗粒处理组的细菌死亡率高于MZS处理组和对照组，差异具有统计学意义（图2C、D，P<0.01）。通过抑菌曲线发现（图2G），与对照组相比，MZS溶液在60 h内对细菌生长展现出一定的抑制作用。但是随着时间的延长，MZS的抑菌效果并未增强，反而有所下降。Ag₂Se纳米颗粒在治疗期间持续表现出抑菌效果，并且与MZS处理组相比，其抑菌效果提升（P<0.05）。

2.3 Ag₂Se纳米颗粒体内抑菌评估

与对照组（Saline）相比，Ag₂Se纳米颗粒治疗组中P. gingivalis表达量降低，也低于MZS治疗组，差异具有统计学意义（P<0.01，图3B）。DAB显色结果显示（图3A），在对照组中，细胞核周围存在大量红色信号（代表P. gingivalis），提示较高P. gingivalis丰度值。MZS处理组相对红色信号减少，而在Ag₂Se处理组中，几乎观察不到红色信号；TSA Vivid 520显色结果显示，对照组中观察到绿色荧光（代表P. gingivalis）分布均匀且较多，MZS处理组中的绿色荧光较对照组减少，提示P. gingivalis丰度值降低（P<0.01）。Ag₂Se处理组与阳性对照组（MZS）相比，绿色荧光几乎消失，差异有统计学意义（P<0.01，图3C）。

2.4 Ag₂Se纳米颗粒通过抗胞内P. gingivalis，对食管癌恶性程度的影响

与对照组和MZS组相比，Ag₂Se组的肿瘤减小（图4A）。与对照组和MZS组相比，Ag₂Se组增长速度明显降低（P<0.01，图4B）。与对照组和MZS组相比，Ag₂Se组的肿瘤质量降低（P<0.05，图4C）。各组小鼠体质量在治疗过程中未见明显的变化（图4E）。小鼠荷瘤免疫组化染色，结果显示，Ag₂Se组的肿瘤细胞Ki67信号减弱，代表肿瘤增殖能力降低（P<0.05，图4D、F）。

2.5 Ag₂Se纳米颗粒生物相容性评价

细胞毒性实验结果显示在药物浓度为200 µg/mL时，HUVEC细胞的存活率仍达90%以上（图5A）。体外溶血实验结果显示，不同浓度Ag₂Se纳米颗粒的溶血率均<5%，表明其具有良好的生物安全性（图5B）。Ag₂Se纳米颗粒治疗11 d后，对小鼠的肝、肾功能进行检测，结果发现Ag₂Se治疗组小鼠的肝肾功未见明显异常（图5C~F）。各组小鼠的主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）HE染色结果显示，荷瘤小鼠各主要脏器组织的组织结构均未见明显异常（图5G）。

3 讨论

微生物与癌症之间的关系是复杂而重要的。据Sepich等^［29］的研究发现，调节微生物可能成为未来癌症治疗的新方向。本研究聚焦于新型合成的Ag₂Se纳米颗粒清除P. gingivalis后，对食管癌进展的影响。P. gingivalis能够通过其产生的酶和毒素，例如蛋白酶和内毒素，破坏宿主细胞的正常功能，促进细胞炎症反应和DNA损伤，从而增加食管癌变的风险^［30］，还能通过调节宿主免疫反应实现免疫逃逸，以及改变口腔和食道的微生物群落，影响细胞的微环境，进而促进食管癌的发展^［31-33］。因此，针对P. gingivalis的治疗策略对于食管癌的诊断、治疗和预后具有重要的临床意义。

P. gingivalis由于自身其独特的生物学特点，如外膜结构复杂、耐药机制的多样性、耐药基因传播能力强等，容易形成耐药性，临床治疗备受困扰^［34］。而纳米材料相比传统抗生素的优势主要体现在广谱抗菌性、减少耐药性产生、多重作用机制、有效穿透细菌膜屏障、较低的宿主细胞毒性以及可定制性和功能化等方面^［35］。据多项研究报道Ag纳米颗粒的抗菌性能受到其尺寸大小和形状的影响^{［36， 37］}。本研究通过化学合成方法制备了粒径约为50 nm的均一、分散的Ag₂Se纳米颗粒，这些颗粒具有较高的比表面积，从而增强颗粒穿透生物膜和细胞壁的能力。另外肿瘤微酸环境促进了Ag₂Se纳米颗粒的电化学反应，加速了Ag⁺的释放，从而提高了其抗菌效率。

实验结果显示，Ag₂Se纳米颗粒在体内外实验中均可有效抑制P. gingivalis的生长，与传统MZS溶液相比，Ag₂Se纳米颗粒表现出更强的抑菌效果，并且不会随着时间的延长出现明显的耐药现象。这一发现与部分研究结果一致，研究指出Ag₂Se纳米颗粒具有光谱抗菌特性，可以有效杀灭耐药菌^{［23， 24］}。但其Ag₂Se纳米颗粒均为生物合成，生物合成的纳米颗粒尽管具有优异的生物相容性，但其由于生物体的复杂性，合成过程不稳定，可重复性与一致性存在挑战，产率较低。而化学合成的Ag₂Se纳米颗粒通过高重复性和尺寸与形貌的精确控制，提供了一种解决方案。

值得注意的是，Ag₂Se纳米颗粒除了抗菌活性外，对食管癌的增殖具有一定的抑制作用，提示其可能通过直接杀菌和诱导细胞凋亡的双重机制发挥作用，与传统抗生素相比，这种双重功能为抗菌和抗癌提供了优势。这种作用可能与纳米颗粒更易穿透肿瘤组织并在微酸环境下选择性释放Ag⁺有关，未来需要进一步的研究阐明其机制。

在安全性方面，Tang等^［38］系统性地评估了PEG包裹的Ag₂Se量子点（QDs）在小鼠体内的清除、分布、转化、排泄及毒性。高剂量静脉注射后，Ag₂Se QDs主要积累在肝脏和脾脏，并在1周内转化为Ag和Se。Ag通过尿液和粪便迅速排出，而Se排泄较慢，但可能进入正常代谢途径。毒性评估表明，短期内未见急性毒性，主要器官无显著损伤，除肝脏在第28天有轻微水肿和坏死迹象。这进一步表明Ag₂Se QDs具备良好的生物相容性和潜在的生物医学应用安全性。本研究实验结果表明，Ag₂Se纳米颗粒在较高剂量下维持HUVECs的较高存活率，与梯度Ag₂Se纳米颗粒孵育，小鼠的溶血率低于5%。治疗周期结束后，小鼠肝功能及主要器官组织形态均未产生显著影响。这些结果均表明，Ag₂Se纳米颗粒具有良好的生物安全性，这一发现也与Tang等^［38］的研究一致。

除此之外，Ag₂Se纳米颗粒在不同癌种中的治疗效果及与其他治疗策略相结合，例如化疗、放射治疗等是否可以进一步增强抗肿瘤整体治疗效果，仍有待进一步探索。综上所述，Ag₂Se纳米颗粒有望发展成一种治疗与感染相关癌症的新策略，为肿瘤学和抗菌治疗提供新思路。

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