LINC00837/miR-671-5p/SERPINE2功能轴促进类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的恶性病理学过程

LINC00837/miR-671-5p/SERPINE2 functional axis promotes pathological processes of fibroblast-like synovial cells in rheumatoid arthritis

摘要

目的 探讨LINC00837/miR-671-5p/SERPINE2功能轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）病理学过程的影响。 方法 选用正常成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）和RA-FLS，构建LINC00837的过表达质粒和干扰质粒转染至RA-FLS中，实验分为对照组（FLS）、模型组（RA-FLS）、pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-LINC00837组、siRNA-NC组、siRNA-LINC00837组。采用双荧光素酶验证LINC00837靶向miR-671-5p及miR-671-5p靶向SERPINE2关系；使用qRT-PCR实验检测各组细胞LINC00837、miR-671-5p、SERPINE2表达量；Edu法检测细胞增殖情况，划痕愈合实验检测RA-FLS迁移数，Western blotting法检测细胞增殖、迁移相关蛋白表达水平；ELISA法检测炎性细胞因子分泌情况。 结果 双荧光素酶报告基因结果显示，LINC00837与miR-671-5p的3'非翻译区（3'UTR）结合，而miR-671-5p与SERPINE2的3'非翻译区（3'UTR）结合，两两之间具有结合位点（P<0.01）。同一时间段，与对照组相比，模型组LINC00837和SERPINE2表达量升高，而miR-671-5p表达量降低，细胞增殖、迁移能力提高，促炎细胞因子表达升高，抑炎细胞因子表达降低（P<0.01）；与模型组相比，pcDNA-LINC00837组细胞增殖、迁移活跃，促炎细胞因子表达升高，抑炎细胞因子表达降低（P<0.01）；与模型组相比，siRNA-LINC00837组细胞增殖、迁移能力下降，促炎细胞因子表达下降，抑炎细胞因子水平升高（P<0.01）。 结论 RA-FLS中存在LINC00837/miR-671-5p/SERPINE2功能轴，该功能轴促进RA-FLS增殖、迁移及炎症因子分泌等恶性病理学过程，干预LINC00837有望成为调控RA-FLS病理学过程的潜在策略。

Abstract

Objective To investigate the regulatory effect of LINC00837/miR-671-5p/SERPINE2 functional axis on pathological processes of fibroblast-like synovial cells (FLS) in rheumatoid arthritis (RA). Methods RA-FLS were transfected with a LINC00837 overexpression plasmid (pcDNA3.1-LINC00837), a LINC00837 interference plasmid (siRNA-LINC00837), or their respective negative control plasmids (pcDNA3.1-NC and siRNA-NC). Dual luciferase was used to verify the targeting relationship between LINC00837 and miR-671-5p and between miR-671-5p and SERPINE2. RT-qPCR was used to detect the expression levels of LINC00837, miR-671-5p and SERPINE2 in normal FLS or the transfected cells, whose proliferation and migration abilities were assessed using Edu assay and scratch healing assay and by detecting the expression levels of Ki-67, PCNA, E-cadherin and N-cadherin with Western blotting. The changes in cellular secretion of the inflammatory cytokines (TNF‑α, IL-17, IL-4 and IL-10) were examined using ELISA. Results Dual luciferase reporter gene assay showed that LINC00837 was capable of binding to the 3'-UTR of miR-671-5p, and the latter bound to the 3-UTR of SERPINE2 at specific binding sites between them. Compared with normal FLS, RA-FLS showed significantly increased expressions of LINC00837 and SERPINE2, lowered miR-671-5p expression and enhanced proliferation and migration abilities with increased expressions of pro-inflammatory cytokines and reduced expressions of anti-inflammatory cytokines. Transfection of RA-FLS with pcDNA-LINC00837 further enhanced cell proliferation and migration and the changes in the inflammatory cytokines, while transfection with si-LINC00837 produced the opposite changes. Conclusion RA-FLS have a LINC00837/miR-671-5p/SERPINE2 functional axis, which regulates cell proliferation, migration and secretion of inflammatory factors, and interventions targeting LINC00837 may provide a potential strategy to regulate the pathological processes in RA-FLS.

Graphical abstract

关键词

类风湿关节炎 / 成纤维细胞样滑膜细胞 / LINC00837 / 增殖迁移 / 炎症因子

Key words

rheumatoid arthritis / fibroblast-like synovial cells / LINC00837 / proliferation / migration / inflammatory factors

类风湿关节炎（RA）是一种以关节持续性滑膜炎症为主要表现的自身免疫性疾病，持续的滑膜炎症是导致RA病情发展的最主要因素，最终造成软骨和骨骼破坏、关节畸形、器官衰竭甚至残疾^［1］。目前，RA具体发病机制尚不明确，但越来越多的研究表明成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）是RA滑膜炎的主要细胞成分，在RA发病机制中起核心作用^［2］。RA患者免疫系统发生紊乱时，滑膜微环境中的正常FLS会从静止状态转变为具有增生性、侵袭性及炎症性的异常细胞，这些异常的FLS通过分泌一系列细胞因子促进滑膜炎的持续和关节软骨降解，此外具有高度增殖迁移能力的FLS能从病变部位迁移侵袭到健康关节组织中，引起炎症扩散，最终导致全身多关节、多脏器受累^［3］。因此，靶向RA-FLS抑制其异常增殖、迁移从而改善关节滑膜炎症是治疗RA的潜在选择。

长链非编码RNA（LncRNA）、微小RNA（miRNA）等占人类基因组98%以上的非编码RNA（ncRNA）在基因表达和调控中发挥重要作用^［4］。其中，LncRNA是非编码RNA的主体部分，可通过发挥“调控因子”的作用调节基因表达，调节方式之一是充当miRNA的“海绵”RNA，通过竞争性结合miRNA有效降低其在细胞中的表达，从而抑制其靶向mRNA的能力，这种LncRNA-miRNA-mRNA（即竞争性ceRNA）的相互作用方式在各种生物学过程中至关重要^［5］。在RA患者的血液和滑膜组织中存在异常表达的LncRNAs、miRNAs和mRNAs，这些异常表达的LncRNAs、miRNAs和mRNAs之间可通过这种相互作用方式调节FLS一系列生物学过程（细胞生长周期、增殖、迁移等）从而影响炎症因子的产生，介导疾病的发展^［6］。LINC00837是一种癌基因，此前研究显示骨肉瘤患者组织及细胞中存在过表达的LINC00837可能参与骨肉瘤细胞的增殖及骨肉瘤免疫微环境的调节^［7］，然而关于LINC00837在RA-FLS免疫微环境中发病机制的报道尚未展开。已有报道显示miR-671-5p在RA滑膜组织中表达降低，且通过靶向TLR2、STAT3、MDM4等多条通路参与RA-FLS细胞增殖、侵袭、迁移和炎症的发展^［8］。丝氨酸蛋白酶抑制剂E2（SERPINE2）又称蛋白酶连结蛋白-1（PN-1），SERPINE2在肿瘤扩散中发挥关键作用，其机制可能与过表达的SERPINE2促进癌细胞迁移有关^［9］，而RA滑膜组织中同样存在显著升高的SERPINE2^［10］，其在RA滑膜微环境中发挥的作用仍有待进一步研究。因此本研究选取LINC00837、miR-671-5p及SERPINE2作为实验对象，通过观察LINC00837、miR-671-5p及SERPINE2在RA-FLS中的表达水平及过表达和干扰LINC00837状态下对RA-FLS病理学过程的影响来探究三者在RA发病过程中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常成纤维样滑膜细胞FLS、RA成纤维样滑膜细胞RA-FLS（上海赛百康生物技术有限公司）；DMEM高糖培养基（索莱宝）；GP-transfect-Mate（吉玛）；双萤光素酶报告基因检测试剂盒（碧云天）；总RNA提取试剂Trizol（Life technogies）；2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX）（Servicebio）；Reverse Transcription Kit（with dsDNase）（biosharp）；E-Click EdU-488细胞增殖检验试剂盒（Elabscience）；GAPDH抗体（ZENBIO）；山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体（Zs-BIO）；Ki67抗体、N-cad抗体、E-cad抗体、PCNA抗体（Affinity）；ECL超敏发光试剂盒、RIPA裂解液（Biosharp）；PVDF膜（Millipore）；PAGE胶促凝剂（Solarbio）；人白介素10（IL-10）试剂盒、人肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒、人白细胞介素4（IL-4）试剂盒、人白细胞介素17A（IL-17A）试剂盒（泉州市睿信生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 FLS细胞培养

选取含10%胎牛血清的DEME（高糖）培养基，放置于5%CO₂、37 ℃饱和湿度培养条件的细胞培养箱中培养，等细胞生长至90%时，将细胞进行传代，选择第7代细胞进行后续实验。

1.2.2 RA-FLS细胞转染与分组

传代培养的RA-FLS接种于6孔板中，按照Lipofectamine^TM2000转染试剂盒说明书将pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-LINC00837、siRNA-NC、siRNA-LINC00837质粒（Gene Pharma）转染至RA-FLS细胞中，48 h后收集细胞，RT-PCR检测转染效率。将这些质粒构建的稳定转染细胞分成4组：pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-LINC00837组、siRNA-NC组、siRNA-LINC00837组。

1.2.3 LINC00837与miR-671-5p及miR-671-5p与SERPINE2之间靶向关系验证

通过基因合成LINC00837与3'UTR的结合序列以及SERPINE2与3'UTR的结合序列的野生型（WT）模板和突变型（MUT）模板。将这些模板插入荧光素酶报告基因载体，形成双荧光素酶报告基因表达质粒。采用Lipofectamine^TM2000试剂分别将miR-671-5p mimic和mimic NC与LINC00837-WT、LINC00837-MU、SERPINE2-WT及SERPINE2-MUT质粒共同转染至293T细胞，6 h后更换为无青链霉素的10%FBS DMEM继续培养转染48 h后加入细胞裂解液充分裂解细胞。取50 μL细胞裂解上清，加入96孔黑色荧光检测板中，分别加入萤火虫荧光素酶反应液检测萤火虫荧光素酶活性及海肾荧光素酶反应液检测海肾荧光素酶活性，分别测定细胞中萤火虫和海肾荧光素酶活性并计算荧光素酶活性，荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.2.4 实时定量PCR检测各组LINC00837、miR-671-5p、SERPINE2表达

采用TRizol试剂分离和提取来自FLS、RA-FLS的总RNA；采用dsDNase逆转录酶试剂盒进行逆转录以产生cDNA；将cDNA与SYBR Green qPCR Master Mix反应量化Lnc00837、miR-671-5p和SERPINE2 mRNA的相对水平，由Sangon Biotech公司合成引物，具体引物序列见表1。

1.2.5 Edu染色检测各组细胞增殖能力

取传代的RA-FLS以每孔1×10⁵/mL的密度接种于96孔板中培养24 h，依照1.2.2中方法分组并进行细胞转染，24 h后加入终浓度为10 μmol/L的EDU染料中孵育2 h后进行DAPI染色，按照E-Click EdU-488细胞增殖检验试剂盒说明书操作，倒置荧光显微镜下拍照并计算EdU阳性率，EdU阳性率（%）=EdU阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 划痕愈合实验检测RA-FLS迁移能力

取传代的RA-FLS以每孔1×10⁶/mL的密度接种于6孔板内，根据细胞分组进行干预，干预结束后用200 μL枪头沿着6孔板十字线划痕，PBS轻柔润洗3次，去除划下的细胞，后各孔加入无血清的DMEM高糖培养基，放入37 ℃、5%CO₂培养箱培养，分别对培养0、24 h的划痕进行拍照（每组选择4个相同位点），使用Image J软件对划痕面积进行分析，划痕愈合率=（0 h的划痕面积-24 h的划痕面积）/0 h的划痕面积］×100%。

1.2.7 Western blotting检测增殖、迁移侵袭相关蛋白水平

取传代的RA-FLS以1×10⁶/mL孔密度接种于培养皿内，根据细胞分组进行干预，干预结束后加入RIPA裂解缓冲液充分裂解，分离得到细胞总蛋白。将收集的细胞蛋白样品按1∶4比例加入5×SDS-PAGE蛋白处理后上样到SDS-PAGE胶电泳处理，随后转移到PVDF膜上，转膜完毕用Western洗涤液漂洗5 min去除转膜液，加入Western封闭液室温封闭2 h。随后加入1∶1000稀释的一抗Ki-67、PCNA、E-cadherin和N-cadherin、GAPDH（内参）在4 ℃下一起孵育过夜，清洗洗涤后加入按照1∶10 000稀释的二抗在室温下孵育2 h，清洗洗涤。最后，将PVDF膜的蛋白面朝上放在自动曝光仪曝光板中央位置，加入混合好的ECL溶液充分反应1~2 min，去尽残液，通过化学发光试剂使条带可视化，并使用Image J软件分析灰度值。

1.2.8 ELISA检测相关细胞因子水平

取传代的RA-FLS以5×10⁴/mL孔密度种于24孔板内，根据细胞分组进行干预，干预结束后将细胞上清液分装于-80 ℃冰箱冻存。采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中TNF-α、IL-17、IL-4、IL-10水平，按照试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上测定吸光度A_{450 nm}，绘制标准曲线并计算炎症因子水平。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism10.2.3软件进行统计学分析。两组细胞之间的双荧光素酶报告实验结果分析采用两独立样本t检验；6组细胞中LINC00837、miR-671-5p、SERPINE2表达水平、细胞增殖、迁移能力及相应蛋白表达水平、炎症因子表达量的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00837与miR-671-5p及miR-671-5p与SERPINE2之间存在靶向关系

LINC00837与miR-671-5p及miR-671-5p与SERPINE2存在互补核苷酸序列（图1A、B）。双荧光素酶报告检测结果显示（图1C、D）：与NC mimics组相比，转染miR-671-5p mimic组LINC00837-WT的荧光酶活性降低（P<0.01），但与NC mimics组相比，LINC00837-MUT组细胞中荧光素酶活性差异无统计学意义（P>0.05）；同样与NC mimics组相比，转染miR-671-5p mimic组SERPINE2-WT的荧光酶活性下降（P<0.01），但与NC mimics组相比，SERPINE2-MUT组细胞中荧光素酶活性差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 RA-FLS细胞中LINC00837与SERPINE2表达上升、miR-671-5p表达下降，过表达LINC00837上调SERPINE2表达、下调miR-671-5p表达

实时定量PCR检测结果显示（图2），与对照组比较，模型组LINC00837、SERPINE2表达水平升高，miR-671-5p的表达降低（P<0.01）；与模型组比较，过表达LINC00837组LINC00837、SERPINE2表达量升高，而miR-671-5p表达量降低（P<0.01）；siRNA-LINC00837组则LINC00837、SERPINE2表达量降低，而miR-671-5p表达量升高（P<0.01）。

2.3 LINC00837促进RA-FLS增殖、迁移

Edu实验显示，模型组RA-FLS的增殖能力较对照组FLS升高（P<0.01）；与模型组比较，LINC00837过表达组细胞增殖能力上升，而LINC00837干扰组细胞增殖能力降低（P<0.01，图3A、C）。划痕试验显示，模型组RA-FLS 24 h内划痕愈合率高于对照组FLS细胞（P<0.01）；与模型组比较，LINC00837过表达组24 h内划痕愈合率上升，而LINC00837干扰组24 h内划痕愈合率降低（P<0.01，图3B、D）。Western blotting检测结果显示，与对照组比较，模型组增殖相关蛋白Ki67、PCNA，迁移蛋白N-cadherin表达含量升高，迁移蛋白E-cadherin水平降低（P<0.01）；与模型组比较，过表达LINC00837组增殖、迁移蛋白Ki67、PCNA、N-cadherin表达上升，E-cadherin蛋白水平降低，而LINC00837干扰组E-cadherin蛋白水平升高，Ki67、PCNA、N-cadherin表达下降（P<0.01，图4）。

2.4 LINC00837提高促炎细胞因子TNF-α、IL-17表达，降低抗炎因子IL-4、IL-10表达

ELISA检测显示，与对照组相比，模型组RA-FLS细胞分泌的促炎因子TNF-α、IL-17增多，抗炎因子IL-4、IL-10表达减少（P<0.01）；与模型组比较，LINC00837过表达组细胞促炎因子TNF-α、IL-17升高，抗炎因子IL-4、IL-10降低（P<0.01），而LINC00837干扰组细胞抗炎因子IL-4、IL-10升高，促炎因子TNF-α、IL-17水平降低（P<0.01，图5）。

3 讨论

RA是一种以多关节慢性滑膜炎症和进行性骨质破坏为主要临床表现的自身免疫性疾病，发病机制尚不明确^［11］。随着生物信息学的发展，研究认为LncRNA参与RA一系列病理学过程，包括炎症因子释放、滑膜细胞增殖、迁移、侵袭及血管新生等^［12］。LncRNA可作为内源性RNA与miRNA竞争性结合，上调mRNA水平从而影响基因表达^［13］。有研究发现RA-FLS中LncRNA HOTAIR显著下调并通过影响miR-106b-5p/Smad7轴调控RA-FLS异常的增殖、迁移及凋亡等病理学行为^［14］。Wnt/β-catenin信号通路激活与RA发病过程中骨破坏和炎症反应密切相关^［15］，Wnt7b不仅是该信号通路的激活蛋白，也是miR-410-3p的靶基因，LncRNA OIP5-AS1可与miR-410-3p竞争性结合，上调Wnt7b表达从而激活该信号通路参与RA发病^［16］。本团队前期通过生物信息学探索RA滑膜组织中的潜在致病分子机制，发现LINC00837在RA滑膜组织中高度表达。为进一步探究该LncRNA的分子功能，通过Targetscan在线生物信息网站预测LINC00837下游的miRNA及mRNA，发现LINC00837与miR-671-5p及miR-671-5p与SERPINE2存在互补的核苷酸序列，结合双荧光素酶实验和实时定量PCR实验结果，我们首次发现RA-FLS中存在LINC00837/miR-671-5p/SERPINE2功能轴参与RA的发生发展，其中LINC00837与SERPINE2表达异常升高、miR-671-5p表达异常降低，当分别过表达和干扰LINC00837时，SERPINE2表达水平一致升高或降低，而miR-671-5p表达水平则相反。

RA发病初始仅累及较少关节，但随着病程的进展，滑膜炎症扩散，全身多关节均可受累，骨骼和软骨损伤加重导致肢体畸形和残疾的发生，严重影响患者生活质量^［17］。异常激活的FLS是RA关节破坏的关键效应细胞^［18］，RA-FLS异常激活时表现出具有侵袭性的致病表型，具体表现为RA-FLS发生活跃的增殖、迁移，进而侵犯至细胞外基质，造成软骨和骨骼的破坏^［19］。有报道显示过表达LINC00837能促进骨肉瘤细胞增殖^［7］，但其对RA-FLS的作用机制仍不明确。已有文献表明RA-FLS中miR-671-5p表达下降，且与RA-FLS增殖、迁移密切相关^［20］，而芍药苷可以上调miR-671-5p表达，抑制RA-FLS细胞增殖、迁移及炎症^［21］。SERPINE2是促进肿瘤细胞迁移和侵袭的关键基因^［22］，如在肝母细胞瘤中，通过表达SERPINE2显著增强肝母细胞瘤细胞的迁移和侵袭^［23］，在食管鳞癌中，上调的SERPINE2可以激活Wnt/β-catenin信号通路介导食管癌细胞发生迁移和侵袭从而加速疾病的进展^［24］。已有报道显示SERPINE2 在RA-FLS中表达升高^［10］，然而目前尚未报道它对RA-FLS增殖、迁移的影响。本研究分别采用Edu实验、划痕实验、Western blotting实验检测RA-FLS增殖、迁移水平。Edu结果表明：与对照组相比，模型组细胞增殖能力升高，与模型组相比，LINC00837过表达组细胞增殖能力升高，而LINC00837干扰组细胞增殖能力降低。划痕试验和Western blotting检测结果同样表明LINC00837/miR-671-5p/SERPINE2功能轴可以影响RA-FLS增殖、迁移，调控LINC00837可以干预这一病理学变化。

炎症因子是诱导和维持RA滑膜炎症的关键因素，异常活跃的RA-FLS是滑膜中炎症因子的主要来源^［25］。炎症因子可分为促炎型和抗炎型^［26］，过表达促炎型细胞因子会加重RA炎症的恶性循环和关节破坏，而抗炎型细胞因子分泌不足则无法抑制RA炎症进展^［27］，研究表明RA患者体内存在促炎型细胞因子表达升高，抗炎型细胞因子表达降低的炎症细胞因子失衡状态^［28］，因此恢复这两类炎症因子之间的平衡是治疗RA关键所在。TNF-α和IL-17是导致RA滑膜炎的关键性促炎细胞因子^［29］，过表达TNF-α不仅可以通过激活NF-κB 和 MAPK 等通路发挥促炎作用^［30］，还会加剧RA-FLS异常增殖和分泌其他促炎型细胞因子，导致局部炎症的扩散^［31］。IL-17是由Th17细胞分泌的促炎型细胞因子，NF-κB信号通路是其下游信号通路，IL-17/NF-κB信号通路激活在介导RA炎症反应和骨质破坏中发挥着关键作用^［32］。此外，有研究表明TNF-α和IL-17二者具有协同效应，能够促进前列腺素E合成，诱导RA-FLS异常增殖，导致关节炎症和软骨损伤的发生^［33］。IL-4、IL-10属于抗炎型细胞因子，升高IL-4、 IL-10水平不仅可以抑制TNF-α等促炎细胞因子表达，还可以调节RA发病过程失衡的先天免疫细胞和适应性免疫细胞，实现疾病的长期控制^{［34， 35］}。本研究通过ELISA检测RA-FLS分泌炎症因子变化，结果发现较正常FLS，RA-FLS分泌促炎因子TNF-α、IL-17增多，抗炎因子IL-4、IL-10表达减少，与模型组比较，LINC00837过表达升高RA-FLS促炎因子TNF-α、IL-17水平，降低抗炎因子IL-4、IL-10水平，而干扰LINC00837则可逆转这一改变。这表明LINC00837/miR-671-5p/SERPINE2功能轴可以影响RA-FLS炎症因子分泌，调控LINC00837可以恢复RA细胞炎症因子之间平衡。

综上所述，本研究发现RA-FLS中存在LINC00837/ miR-671-5p/SERPINE2功能轴，该功能轴与RA-FLS异常活跃的增殖、迁移及炎症因子释放等病理学过程密切相关，过表达及干扰LINC00837能调控该功能轴，这意味着LINC00837可以成为诊治RA的可用生物标志物。本研究尚有不足之处：本研究仅进行了体外实验，未在RA患者和动物模型中进一步验证；此外，LINC00837是否能通过其他途径影响RA进展需进一步研究。

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基金资助

安徽省中医药传承创新科研项目(2024CCCX105)

安徽省临床医学研究转化专项项目(202304295107020110)

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安徽省高等学校科学研究重点项目(2023AH050810)

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