METTL3介导的m⁶A修饰通过调节自噬促进急性髓性白血病细胞中FOXO3表达及蒽环类药物耐药性

METTL3-mediated m⁶A modification promotes FOXO3 expression and anthracycline resistance in acute myeloid leukemia cells through autophagy regulation

摘要

目的 探讨急性髓系白血病（AML）细胞中叉头盒蛋白3（FOXO3）与甲基转移酶样蛋白3（METTL3）表达关系及FOXO3参与AML化疗耐药的机制。 方法 采用敲低或过表达METTL3和FOXO3及其对照慢病毒载体，转染AML蒽环类耐药细胞系，获取对照组、敲低组、过表达组细胞。对AML细胞采用甲基化RNA共沉淀和高通量测序技术（MeRIP-seq）和转录组测序（RNA-seq）。TCGA和GSE6891数据库对AML患者临床信息及基因表达数据进行统计分析。RT-qPCR及 Western blotting检测FOXO3 mRNA及蛋白的表达水平和FOXO3 mRNA稳定性。流式细胞术和CCK-8分别检测细胞凋亡和增殖能力的变化。MeRIP-qPCR检测m⁶A修饰FOXO3 mRNA的表达情况。 结果 蒽环类敏感及耐药AML细胞系和敲低METTL3前后细胞系差异基因均富集在FoxOs通路中，且耐药细胞中FOXO3 m⁶A修饰明显增加。公共数据库相关性分析显示FOXO3与METTL3表达呈正相关（P<0.01）。Western blotting和RT-qPCR结果提示敲低METTL3后FOXO3表达下降（P<0.05）。MeRIP-qPCR结果提示蒽环类耐药AML细胞中m⁶A修饰的FOXO3 mRNA表达高于蒽环类敏感AML细胞（P<0.05）。稳定性试验结果提示敲低METTL3后FOXO3 mRNA稳定性降低。公共数据库分析、Kaplan-Meier分析和RT-qPCR结果提示FOXO3与AML患者预后不良相关（P<0.05）。Western blotting和RT-qPCR结果显示，蒽环类耐药细胞中FOXO3的表达明显高于敏感细胞（P<0.05）。体外实验显示过表达FOXO3的AML细胞后细胞增殖更快，凋亡减少（P<0.05）。蒽环类敏感及耐药AML细胞系和敲低METTL3前后细胞系差异基因均富集在自噬相关通路中，抑制自噬增强阿霉素对AML细胞和过表达FOXO3细胞的抗肿瘤作用。 结论 METTL3可能通过介导的m⁶A修饰促进FOXO3的表达，进而调节自噬促进蒽环类药物耐药细胞的增殖和抑制凋亡。

Abstract

Objective To investigate the role of METTL3 and FOXO3 in anthracycline resistance in acute myeloid leukemia (AML) cells. Methods Methylated RNA immunoprecipitation sequencing (MeRIP-seq) and transcriptome sequencing (RNA-seq) were performed in anthracycline-resistant and sensitive HL60 and K562 cells with lentivirus-mediated knockdown or overexpression of METTL3 and FOXO3. TCGA and GSE6891 datasets were used for analysis of the clinical and gene expression data of AMI patients. FOXO3 expressions at the mRNA and protein levels in the transfected cells were detected with RT-qPCR and Western blotting, and the changes in cell proliferation and apoptosis were evaluated using CCK8 assay and flow cytometry; the expression of m⁶A-modified mRNA and mRNA stability of FOXO3 was detected analyzed using MeRIP-qPCR and RT-qPCR. Functional enrichment analysis of the differential genes in the transfected cells was performed. Results Differential gene analysis in anthracycline-resistant versus sensitive AML cells and in cells with METTL3 knockdown revealed the enrichment in FoxO and autophagy pathways (P<0.05), and the anthracycline-resistant cells showed significantly increased m⁶A modification of FOXO3. FOXO3 expression was positively correlated with METTL3 expression. METTL3 knockdown significantly reduced FOXO3 mRNA stability and its protein levels in anthracycline-resistant AML cells, which exhibited higher m6A-modified FOXO3 expression levels than their sensitive counterparts. Database analysis, Kaplan-Meier analysis and RT-qPCR results suggested that a high FOXO3 expression was associated with a poor prognosis of AML patients. In anthracycline-resistant AML cells expressing higher FOXO3 levels than the sensitive cells, lentivirus-mediated overexpression of FOXO3 significantly enhanced cell proliferation and suppressed cell apoptosis. Inhibiting autophagy using an autophagy inhibitor (Baf.A1) obviously enhanced the inhibitory effect of adriamycin on resistant AMI cells and cells overexpressing FOXO3. Conclusion METTL3 promotes FOXO3 expression via m6A modification, and FOXO3-driven autophagy contributes to anthracycline resistance in AML cells by enhancing cell proliferation and suppressing cell apoptosis.

Graphical abstract

关键词

急性髓系白血病 / 化疗耐药 / FOXO3 / METTL3 / RNA甲基化

Key words

acute myeloid leukemia / chemotherapy resistance / FOXO3 / METTL3 / RNA methylation

急性髓系白血病（AML）是一种高度异质性疾病，也是最常见的成人急性白血病类型，目前临床标准诱导治疗方案是含蒽环类药物的“3+7”方案^{［1， 2］}。随着靶向治疗药物和免疫治疗的出现，AML的治疗取得了巨大进展，但患者5年生存率仅为30%~40%^{［3， 4］}。因此，初治耐药和疾病复发仍然是急性髓细胞性白血病治疗中的巨大难题。

表观遗传学修饰是AML化疗耐药的重要机制^［5］。RNA甲基化修饰是表观遗传学的重要分支，其中m⁶A修饰作为mRNA修饰中最重要的调控方式之一，参与调节RNA的稳定性、翻译效率和其他多种生物学功能。m⁶A修饰关键的甲基转移酶的核心组分是甲基转移酶样蛋白3（METTL3），METTL3通过调控m⁶A“写入”参与肿瘤发生发展和化疗耐药^［6］。尽管有研究证明METTL3的缺失可以降低髓系白血病细胞m⁶A修饰水平，诱导细胞分化和细胞凋亡，延缓小鼠体内白血病的进展^［7］。但是对于METTL3促进AML化疗耐药的具体机制研究较少，而METTL3调控AML蒽环类药物化疗耐药的下游信号通路仍不明确。

叉头盒蛋白家族（FoxOs）在体内控制细胞的生长、存活、代谢和抗氧化状态等多种功能^{［8， 9］}。研究表明 FoxOs 的异常表达与肿瘤耐药有关^［10-12］。既往研究发现，COPS3-FOXO3通路通过调节自噬促进骨肉瘤顺铂耐药^［13］。在肝癌中也有研究证实RNA m⁶A甲基化可以通过FOXO3介导索拉非尼耐药^［14］。但关于FOXO3参与AML及其耐药的机制研究甚少。有研究表明FOXO3高表达提示遗传学正常AML不良预后^［15］，而FOXO3在AML中维持细胞存活^［16］，但是并未对其被调控机制进行探索。

本研究发现FOXO3的表达与METTL3的表达呈正相关，研究选择两个蒽环类耐药AML细胞系，通过干预METTL3表达，检测其对FOXO3的mRNA的稳定性及其表达水平的影响，探讨蒽环类耐药AML细胞中METTL3通过调节m⁶A修饰调控FOXO3表达促进AML蒽环类耐药的机制。研究发现FOXO3与AML患者的不良预后相关，探讨了FOXO3通过调控自噬参与AML蒽环类药物耐药的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

蒽环类耐药细胞株（HL60/ADR和K562/ADR）及其相应的敏感细胞株（HL60和K562）由解放军总医院第一医学中心血液科实验室冻存。急性髓系白血病患者原代细胞收集自解放军总医院第一医学中心血液科。收集标本及临床资料均经患者及家属知情同意，且通过解放军总医院伦理委员会审批（伦理批号：S2022-621-01）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HL60和K562细胞于含有10%胎牛血清（Pricella）、100 μg/mL青霉素（Cytiva）和100 μg/mL链霉素（Cytiva）的RPMI 1640培养基（Gibco）中培养。为了保持药物抗性，HL60/ADR和K562/ADR细胞在0.5 μg/mL的阿霉素（MedChemExpre）环境中维持。所有细胞皆在含5%二氧化碳的环境下、37 ℃条件下培养箱中孵育。之后，将细胞置于无阿霉素的培养基中培养1周，以确保抗生素影响完全消除。

1.2.2 慢病毒表达载体构建及实验分组

shRNAs载体及慢病毒表达载体由GeneChem Technologies（中国）设计并合成：METTL3-RNAi-siRNA序列：GCTGCACT TCAGACGAATTAT。METTL3及FOXO3过表达的慢病毒载体同样由GeneChem Technologies（中国）设计并合成。采用敲低或过表达METTL3和FOXO3及其对照慢病毒载体转染AML蒽环类耐药细胞系，获取对照组、敲低组、过表达组细胞。

1.2.3 RNA提取和RT-qPCR

收集1×10⁶细胞，使用TRIzol（Invitrogen）提取细胞中的总RNA，使用逆转录试剂盒（ES Science）将总RNA逆转录成cDNA， 在PCR仪器上进行实时定量荧光PCR扩增，检测AML细胞中标志物mRNA水平，使用GAPDH作为内参。所有引物均由博迈德生物（北京）公司合成提供，引物序列如表1。

1.2.4 MeRIP-seq和RNA-seq数据分析

收集1×10⁷细胞，用PBS洗涤2次，按照上述方法提取总RNA。样品在LC-Bio Technology Co，Ltd处理。使用R语言软件包对测序所得差异基因进行富集分析。使用IGV软件对RNA甲基化修饰峰进行可视化分析。

1.2.5 Western blotting

收集1×10⁶处于对数生长期细胞，PBS洗涤2遍，加入含有1 mmol/L苯甲磺酰氟（Solarbio）和磷酸酶抑制剂混合物（Applygen）的RIPA裂解液（Solarbio）中裂解，以获得细胞总蛋白。使用12% SDS-PAGE电泳（100V 60 min），转膜（300 mA， 90 min）。用5%脱脂牛奶在37 ℃下封闭2 h，用抗METTL3（1∶1000）、抗FOXO3（1∶1000）、抗LC3B（1∶1000）和抗GAPDH（1∶1000，Cell Signaling）一抗在4 ℃下孵育过夜。将膜与二抗（1∶2000，Cell Signaling）在室温下孵育40 min后使用凝胶成像系统显影。使用ImageJ软件对图像进行灰度值分析，使用目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值进行归一化处理和统计分析。

1.2.6 MeRIP-qPCR

按照上述方法提取总RNA。将总RNA片段化，使用琼脂糖凝胶电泳检测碎片化后RNA的片段大小。实验设立以下2组：未免疫沉淀对照组（input组），免疫沉淀实验组（IP组）。取出10%总RNA作为input组，其余部分作为IP组加入抗m⁶A抗体和Protein A/G磁珠孵育，对RNA进行免疫沉淀和洗脱。Input组和IP组均进行RT-qPCR。以input组作为内参，分别计算每个样本中m⁶A修饰的mRNA水平。

1.2.7 RNA稳定性试验

细胞处理与mRNA表达检测将细胞以每孔5×10⁵细胞的密度接种于六孔板中，并使用放线菌素D（Sigma-Aldrich）以终浓度5 μg/mL处理细胞，在指定时间点（0、2、4、6、8 h）进行取样。在各指定时间点收集细胞，进行RNA的提取，并依照上述方法（RNA分离、cDNA制备及实时反转录PCR）评估mRNA的表达水平。

1.2.8 CCK-8法检测细胞存活率

将细胞以每孔1×10⁵细胞的密度接种于6孔板中培养，72 h后收获细胞。在96孔板中每孔加入100 µL细胞悬液，而后每孔加入10 µL CCK-8试剂（Dojindo Molecular Technologies），37 ℃孵育3 h。随后在酶标仪上测量每孔光密度（A₄₅₀），计算细胞存活率。

1.2.9 细胞凋亡检测

将细胞以每孔1×10⁵细胞的密度接种于6孔板中培养，72 h后收获细胞。使用Annexin V，633凋亡检测试剂盒（Dojindo Molecular Technologies）检测细胞凋亡水平。用5 µL Annexin V和5µL PI溶液处理。随后，样品在室温下避光孵育15 min。最后加入400 mL Annexin V结合缓冲液。数据在流式细胞仪（FACS Canto II，BD Biosciences）上收集，并使用FlowJo V10（FlowJo LLC，Ashland，Oregon，USA）进行分析。

1.2.10 统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 24.0及 GraphPad Prism 10软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，符合正态分布计量资料的组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布定量资料的组间比较采用Mann-Whitney检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 METTL3上调蒽环类耐药AML细胞中FOXO3的表达

KEGG富集结果显示HL60/ADR细胞中m⁶A修饰水平上调的差异基因富集在FoxOs等通路上（图1A）。在蒽环类耐药细胞系（K562/ADR）中敲低METTL3进行RNA-seq，对测序结果进行KEGG富集分析，结果提示耐药细胞中敲低METTL3前后的差异基因同样富集在FoxOs等通路上（图1B）。分析蒽环类敏感及耐药细胞系（HL60 vs HL60/ADR）的m⁶A修饰峰，结果显示FOXO3的m⁶A修饰明显增加（图1C）。

在GSE6891数据库中对435例AML患者的转录组测序数据进行表达量相关性分析，结果显示FOXO3和METTL3表达呈正相关（R=0.28，P<0.001，图2A）。

RT-qPCR及Western blotting结果提示敲低组FOXO3的mRNA（P<0.01，图2B）及蛋白（P<0.05，图2C、D）的表达较对照组降低。而在蒽环类耐药细胞系（HL60/ADR、K562/ADR）中过表达METTL3后，FOXO3 mRNA（P<0.01，图2E）及蛋白（P<0.05，图2F、G）的表达较对照组明显增高。

2.2 METTL3通过m⁶A修饰调控FOXO3表达

MeRIP实验结果表明耐药细胞（HL60/ADR、K562/ADR）中m⁶A修饰的FOXO3 mRNA的表达明显高于敏感细胞（P<0.05，图3A）。过表达METTL3后，m⁶A修饰的FOXO3 mRNA的表达明显高于对照组（P<0.01，图3B）。检测FOXO3 mRNA的稳定性，数据提示敲低METTL3后FOXO3的稳定性较对照组明显降低（P<0.01，图3C）。

2.3 FOXO3的高表达提示AML患者的不良预后

分析GSE6891（n=435）和TCGA（n=163）数据库中FOXO3的表达与预后的关系，TCGA和GSE6891中分别有30.9%（50/163）、21.1%（92/435）患者细胞遗传学提示预后差（表2）。

对比分析3组患者FOXO3表达量，数据提示预后不良组患者FOXO3高表达（P<0.05，图4A）。按FOXO3表达量将患者分为基因高表达组和低表达组并比较两组差异预后，结果表明FOXO3高表达组OS较低表达组明显降低（P<0.05，图4B）。RT-qPCR结果提示复发/难治AML患者FOXO3明显高于初治AML及治疗后完全缓解患者（P<0.05，图4C）。

RT-qPCR结果显示，HL60/ADR、K562/ADR细胞中FOXO3的表达较HL60、K562明显增高（P<0.05，图4D）。Western blotting显示FOXO3在蒽环类药物耐药AML细胞系（HL60/ADR、K562/ADR）中高表达（P<0.05，图4E）。

在蒽环类耐药细胞系（K562/ADR）中过表达FOXO3后进行验证（图4F、G）。显示过表达FOXO3后细胞增殖较对照组明显增加（P<0.05，图4H）；同时，过表达FOXO3后细胞的凋亡明显减少（P<0.05，图4H）。

2.4 FOXO3可能通过自噬调控AML细胞蒽环类药物耐药

对蒽环类敏感及耐药细胞系（HL60 vs HL60/ADR）RNA-seq结果进行聚类分析，得到8种差异基因表达的基因集，其中C2、C4、C5和C6基因集中一致性较好（图5A）。分析4个基因集差异基因富集的信号途径，结果显示C2和C4中差异基因在蒽环类耐药细胞系中上调，上调差异基因主要富集在自噬、囊泡运输等过程相关基因上。C5和C6中差异基因在蒽环类耐药细胞系中下调，下调差异基因主要富集在非编码RNA加工、核糖体核蛋白发生等过程相关基因上。对敲低METTL3的蒽环类耐药细胞系（HL60/ADR）RNA-seq结果进行聚类分析，C2、C7、C11和C12基因集中一致性较好（图5B）。其中C7和C12中差异基因在敲低METTL3后表达下调，下调差异基因同样富集在自噬通路上。

Western blotting结果显示自噬相关蛋白LC3BⅡ/GAPDH在蒽环类耐药细胞系中增加（图5C），过表达FOXO3细胞系中LC3BⅡ/GAPDH进一步增加（图5D）。在K562/ADR中加入自噬抑制剂巴弗洛霉素（Baf. A1）后细胞增殖能力下降（P<0.01，图5E）。在过表达FOXO3的K562/ADR细胞系中加入自噬抑制剂与蒽环类药物阿霉素共同培养72 h，抑制自噬明显增强阿霉素对细胞的抗肿瘤作用（P<0.001，图5F）。

3 讨论

化疗耐药和复发是AML预后不良的重要原因，其中蒽环类药物为基础的诱导治疗方案有效率为60%~80%^{［2， 17］}。RNA甲基化修饰与肿瘤的发生发展及化疗耐药相关^［18］。本研究通过在蒽环类敏感及耐药AML细胞间进行RNA甲基化测序分析，结合在蒽环类耐药中敲低METTL3进行转录组测序结果，发现FOXO3可能作为METTL3调节AML细胞化疗耐药的下游靶点。结合大样本公共数据库分析和体外试验，验证了FOXO3在AML耐药细胞中通过m⁶A修饰的方式受到METTL3调控及其生物学功能，并且可能作为关键转录因子调节细胞自噬，进而介导AML细胞化疗耐药。

在RNA的表观遗传修饰中，m⁶A是真核细胞内最普遍的mRNA修饰^［19］，其在正常造血、白血病细胞增殖、凋亡、分化、耐药性和白血病干细胞/白血病始发细胞自我更新中的生物学功能和分子机制方面发挥重要作用^［20-22］。METTL3是m⁶A甲基转移酶复合体的重要组成部分，对细胞分化、增殖和存活等多个生物过程至关重要。体内及体外实验表明METTL3可能通过增强细胞归巢和植入促进AML化疗耐药^［23］。本中心的前期工作中同样证实蒽环类耐药细胞系中m⁶A修饰增多，METTL3表达增高^［24］。基于前期的研究成果，本研究探讨了蒽环类耐药AML细胞中METTL3可能存在的调控机制。利用MeRIP-seq和RNA-seq数据进行富集分析及m⁶A修饰峰分析发现FOXO3可能作为METTL3调控AML细胞蒽环类耐药的重要靶基因。随后我们利用公共数据库证实FOXO3表达与METTL3表达呈正相关。我们分别对两个蒽环类耐药细胞系中（HL60/ADR、K562/ADR）的METTL3进行了敲低及过表达，从正反两个方面验证METLL3可以促进FOXO3的转录及翻译。研究证实m⁶A修饰参与 RNA 稳定性、蛋白质翻译和分子结构转换等多种细胞活动并受m⁶A调节因子的调控，m⁶A甲基化酶促进RNA甲基化修饰，影响RNA的稳定性，调控基因的表达^{［25， 26］}。为了研究METTL3对FOXO3表达的调控机制，我们进行了MeRIP实验及RNA稳定性研究，发现METLL3可以调控FOXO3 m⁶A修饰水平。表明METTL3可能通过影响FOXO3 mRNA的稳定性进而影响FOXO3的表达水平，调控AML蒽环类药物耐药的发生。

FoxOs蛋白家族是一组转录因子，主要包括FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6四个成员^{［27， 28］}。这些蛋白在进化中高度保守，通过与DNA共有序列结合发挥核内转录因子的作用，从而调控细胞维持稳态，并且参与肿瘤细胞耐药机制的调节^{［29， 30］}。研究发现在对 FLT3抑制剂耐药的FLT3-ITD+AML细胞中，通过 FOXO1和FOXO3介导的转录激活上调组蛋白去乙酰酶8（HDAC8）的表达，导致p53通路失活^［31］。这提示FoxOs家族参与了AML耐药机制的调控。Santamaría等^［15］发现在遗传学表现正常的AML患者中，FOXO3高表达提示不良预后。Kornblau等^［32］研究发现，p-FOXO3是AML的不良预后相关因素。研究中根据患者细胞遗传学特征进行预后分层后，发现相较预后良好组FOXO3的表达明显低于预后不良组，且生存分析提示FOXO3高表达患者长期生存较差，这与目前研究的结论一致，但并没有对FOXO3调控AML的机制进行探索。Chen等 ^［16］发现AML细胞中FOXO3缺失可能通过激活GNG7-mTOR轴促进细胞增殖和分化，进而克服AML适应性耐药，在AML细胞系中敲低FOXO3进行机制探索，但并未在AML耐药细胞系中进一步验证。我们的研究比较了AML敏感及耐药细胞系中FOXO3的差异，基础实验证实FOXO3 mRNA及蛋白在蒽环类药物耐药（HL60/ADR、K562/ADR）AML细胞系中高表达。而后我们在AML耐药细胞系中过表达FOXO3进行验证，与Chen等^［16］的研究互为补充。本研究结果证实FOXO3可以促进蒽环类耐药AML细胞增殖，减少凋亡。上述结果均提示FOXO3的高表达与AML蒽环类耐药及不良预后相关。

巨自噬，以下简称“自噬”，通过囊泡结构包裹衰老的细胞器等形成自噬体，与溶酶体融合后称为“自噬溶酶体”并降解内容物^［33］。自噬是调节细胞代谢和稳态的重要调节过程，研究证明自噬参与调节多种肿瘤化疗耐药。在胃癌耐药的研究中发现，长链非编码RNA EIF3J-DT通过靶向ATG14参与胃癌细胞自噬和化疗耐药的调节^［34］。骨肉瘤中FOXO3核丰度增加可以抑制SKP2的转录，进而抑制COPS3表达并介导骨肉瘤顺铂耐药^［13］，这提示FOXO3是自噬通路中的重要转录因子。既往研究表明FOXO3可以通过促进保护性自噬维持造血干细胞的生存^［35］。在我们的研究中，对蒽环类敏感及耐药的AML细胞的RNA-seq结果进行聚类分析，发现在蒽环类耐药AML细胞中，自噬相关的基因被激活。Western blotting检测自噬相关蛋白，发现蒽环类耐药细胞中LC3BⅡ/GAPDH增加。研究中还发现，抑制自噬后蒽环类耐药细胞增殖能力明显减弱。这提示AML对蒽环类耐药可能与自噬调节相关。而后对敲低METTL3前后的蒽环类耐药细胞RNA-seq结果进行聚类分析，发现敲低METTL3后自噬相关的基因被抑制。在过表达FOXO3的蒽环类耐药细胞中同样发现LC3BⅡ/GAPDH增加，且自噬抑制剂与蒽环类药物联合使用可以明显增强蒽环类药物对过表达FOXO3的蒽环类耐药细胞的抗肿瘤作用。这些结果都提示我们FOXO3可能通过影响细胞自噬介导AML细胞对蒽环类药物耐药， FOXO3可能作为AML治疗后出现蒽环类药物耐药的潜在靶点。

综上所述，本研究通过基础研究探索了蒽环类耐药细胞中METTL3与FOXO3的表达的相关性及其调控机制，证实METTL3可能通过调控FOXO3 mRNA的稳定性，影响FOXO3的表达水平，介导AML蒽环类药物耐药的发生。但若要验证二者之间的直接调控关系，尚缺乏荧光素酶报告基因实验和免疫共沉淀实验提供的直接证据，本研究组将在下一步研究中进一步完善。此外研究还证明FOXO3的高表达与AML的不良预后相关，探索了FOXO3参与调控AML蒽环类耐药的潜在机制。尽管存在不足，但本研究为在蒽环类耐药AML 中探寻METTL3与FOXO3的直接调控关系提供了证据，并且为验证在蒽环类耐药AML中，METTL3通过影响FOXO3稳定性，调节细胞自噬水平改变，进而介导AML耐药的假设奠定了基础。

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