活络效灵丹促进斑马鱼尾鳍再生的核心靶点与免疫调控机制

Core targets and immune regulatory mechanisms of Huoluo Xiaoling Pellet for promoting zebrafish fin regeneration

摘要

目的 基于网络药理学和体内实验验证分析活络效灵丹促进组织修复的潜在核心靶点与免疫调控机制。 方法 基于网络药理学筛选活络效灵丹的活性成分以及疾病作用靶点，利用STRING数据库构建PPI筛选核心蛋白，并进行GO、KEGG富集分析以及分子对接预测活络效灵丹的药理机制。体内实验：通过斑马鱼药毒实验评估活络效灵丹的毒性作用，并将3 dpf幼鱼尾鳍切除95%建立斑马鱼尾鳍截断模型，设置模型组（胚胎水）、活络效灵丹低、中、高浓度干预组（10、20、40 μg/mL），通过再生面积观察和qPCR检测评估活络效灵丹促进组织再生的药效及核心靶点。利用巨噬细胞和中性粒细胞双荧光标记的转基因斑马鱼，观察免疫细胞在不同修复阶段的迁移情况，qPCR检测组织再生不同时间段巨噬细胞的分型。 结果 筛选出活络效灵丹中活性成分与组织修复共有149个交集靶点，其中核心靶点有AKT1、IL-6、TNF-α、EGFR、STAT3，结合GO和KEGG富集分析提示活络效灵丹主要通过JAK-STAT信号通路、黏附连接、对细胞迁移的正向调控等发挥作用。药毒实验显示，药物安全浓度为40 μg/mL，致死浓度为320 μg/mL，超过80 μg/mL活络效灵丹可导致斑马鱼幼鱼出现肾脏、心包水肿及血管发育不良。体内实验中，与模型组相比，活络效灵丹药物干预组斑马鱼尾鳍修复面积增高（P<0.05），同时显著抑制IL-6、TNF-α，激活AKT1、EGFR、STAT3基因的表达（P<0.05）。活络效灵丹可以调节再生部位中性粒细胞和巨噬细胞的聚集，并在组织再生不同时间段调节M1和M2型巨噬细胞的极化（P<0.05）。 结论 在斑马鱼尾鳍再生过程中，活络效灵丹通过多成分、多靶点和多通路机制显著促进组织修复。其功能可能涉及调节伤口局部的免疫细胞迁移及巨噬细胞极化，从而有效减轻炎症反应，促进愈合进程。

Abstract

Objective To investigate the core targets and immunomodulatory mechanisms of Huoluo Xiaoling Pellet (HLXLP) for promoting tissue repair. Methods Network pharmacology and protein-protein interaction network were used to screen active components in HLXLP, the disease-related targets and the core targets, followed by GO and KEGG enrichment analyses and molecular docking to predict the pharmacological mechanisms. The toxicity of HLXLP was evaluated in zebrafish, and in a tissue regeneration model established in 3 dpf zebrafish larvae by amputating 95% of the tail fin, the effects of a formulated zebrafish embryo culture medium and 10, 20, and 40 μg/mL of aqueous extract of HLXLP on tissue regeneration was evaluated; RT-qPCR was performed to detect mRNA expressions of tissue regeneration marker genes and the core target genes. Transgenic zebrafish with fluorescently labeled macrophages and neutrophils were used to observe immune cell migration during tissue regeneration, and macrophage polarization at different stages was assessed with RT-qPCR. Results We identified a total of 149 intersected targets between HLXLP active components and tissue repair and 5 core targets (AKT1, IL-6, TNF-α, EGFR and STAT3). GO and KEGG analyses suggested that the effects of HLXLP were mediated primarily through the JAK-STAT pathway, adhesion junctions and positive regulation of cell migration. HLXLP was minimally toxic below 40 μg/mL and lethal at 320 μg/mL in zebrafish, and caused renal and pericardial edema and vascular defects above 80 μg/mL. In zebrafish with tail fin amputation, HLXLP significantly promoted tissue regeneration, reduced IL-6 and TNF-α and enhanced AKT1, EGFR and STAT3 mRNA expressions, modulated neutrophil and macrophage recruitment to the injury sites, and regulated M1/M2 macrophage polarization during tissue regeneration. Conclusion HLXLP promotes zebrafish tail fin regeneration through multiple active components, targets and pathways for immunomodulation of immune cell migration and macrophage polarization to suppress inflammation and accelerate healing.

Graphical abstract

关键词

活络效灵丹 / 组织修复 / 免疫机制 / 核心靶点 / 斑马鱼

Key words

Huoluo Xiaoling Pellet / tissue repair / immunologic mechanism / core target / zebrafish

组织修复是指生物体在遭受损伤后，通过一系列举措包括止血、炎症反应、组织再生及结构重塑等来恢复其原有结构与功能的关键生理过程^［1］。在全球范围内，由创伤、外科手术、各类疾病等因素引发的组织损伤已构成重要的公共卫生挑战^［2］。当组织受损时，机体会激活多条生物信号通路，并且这些通路之间存在复杂的相互作用^［3］。其中，免疫微环境对损伤信号作出迅速且精准的反应，激活如巨噬细胞、自然杀伤细胞等多种免疫细胞，并通过这些细胞在修复过程中发挥协同作用^［4］。深入理解组织修复的复杂机制对于开发有效的临床治疗方案至关重要。当前对于调控这一系列过程的细胞与分子机制的认知限制了治疗手段的发展。因此，寻找能有效促进伤口愈合及组织修复的药物和靶点成为了亟待解决的研究课题。

尽管许多小分子和生物材料在实验室研究中显示出了促进伤口愈合的潜力，但它们在临床转化过程中仍面临巨大挑战。传统中医在治疗组织损伤方面的丰富经验提供了一些新的临床思路。《证治准绳·疡医》曰：损伤一证，专从血论，但须分其有瘀血停积，而亡血过多之证^［5］。有临床研究观察到血瘀状态下机体的细胞因子网络紊乱，炎症反应加剧^［6］，凸显活血化瘀法在组织修复过程中的重要地位。活络效灵丹源自张锡纯的《医学衷中参西录》^［7］，以其“活血、祛瘀、通络、镇痛”的功效闻名。既往研究报道，活络效灵丹能够有效改善血瘀症状，调节炎症因子的表达^［8］，改善皮损处的血液流变学指标^［9］。临床上，该方剂常在治疗跌打损伤、内外疮疡、术后恢复及冠状动脉性心脏病等疾病中，显示出良好的疗效。然而，尽管活络效灵丹在组织损伤治疗领域的应用已显示出可观的效果，但其确切的作用机制和潜在的分子路径仍有待进一步阐明。

网络药理学通过系统分析药物与蛋白之间的相互作用网络，能够全面揭示药物的多靶点作用机制，是理解复方中药的有力工具^［10］。斑马鱼是研究再生领域常用的模式生物，具有完全再生多种组织和器官的能力^［11］。此外，与人类参考基因组的比较表明，大约70%的人类基因至少有一个明显的斑马鱼直系同源物^［12］。因此，本研究将采用网络药理学方法结合斑马鱼尾鳍再生模型，深入探索活络效灵丹促进组织修复的核心靶点及其免疫调控机制，为其临床应用提供坚实的理论基础。

1 材料和方法

1.1 基于网络药理学的活络效灵丹促进组织修复潜在机制研究

1.1.1 活络效灵丹活性成分筛选及相关靶点预测

以“当归”“丹参”“乳香”“没药”为检索词汇，在TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中，以类药性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥0.3为标准，筛选药物活性成分。利用Swiss target Prediction（http：//swisstargetprediction.ch/）预测活络效灵丹活性成分的对应靶点，并通过UniProt数据库校准获得的靶点名称。

1.1.2 活络效灵丹促进组织修复相关靶点收集与筛选

在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM数据库（https：//www.omim.org/）和DrugBank数据库（https：//go.drugbank.com/）中，检索“tissue repair”，合并并删除不同数据库获得的靶点，即为组织修复的相关疾病靶点。其中GeneCards数据库由于数据量较大，设定了Score值大于中位数的标准进行多轮筛选。将药物靶点与疾病靶点取交集，即为活络效灵丹促进组织修复的潜在靶点。

1.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将已得到药物与疾病的交集靶点上传到STRING平台（https：//string-db.org/），限定物种为人类，设置置信度为≥0.4，进行PPI网络构建，再将结果导入到Cytoscape 3.7.1软件进行可视化分析。在Network Analyzer及CytoNCA插件的帮助下筛选度值大于中位数两倍，且连接度（D）、介度（B）、紧密度（C）、网络中心性（NC）以及局部边连通性（LAC）均大于中位数的节点作为核心靶点。

1.1.4 交集靶点GO功能和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF），适用于生物分子机制研究。将交集靶点数据上传到Metascape数据库（https：//www.metascape.org/gp/index.html），选择人类物种，执行GO功能和KEGG通路富集分析指令。借助微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化分析并根据Ｐ值从小到大排列展示。

1.1.5 “活性成分-核心靶点-信号通路”网络构建与分析

为明确活络效灵丹促进组织修复的主要活性成分以及其与相关靶点、通路的关系，将活络效灵丹的活性成分进行编号，与核心靶点、信号通路在表格注释类别后一同导入Cytoscape 3.7.1，计算网络拓扑属性值并调整参数后得到“活性成分-核心靶点-信号通路”网络图。

1.1.6 分子对接

针对核心靶点蛋白，通过RCSB PDB数据库下载其三维结构文件，利用PyMOL 1.7.2.1软件对下载的蛋白结构进行预处理，具体步骤包括移除所有水分子和配体，添加极性氢原子。通过PubChem化合物数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得中药核心活性成分的分子结构文件后，将两份文件都转换为PDBQT格式，导入AutoDockTools 1.5.6软件中进行结合能预测和分子对接。通常较低的结合能意味着配体与受体之间形成了更加稳定的复合物。当结合能低于-4.25 kcal/mol时，表明配体与受体间存在一定的相互作用；若低于-5.0 kcal/mol，则显示出较为显著的结合能力；而低于-7.0 kcal/mol时，提示着两者之间有强烈的相互作用。随后，借助PyMOL 1.7.2.1软件进行可视化操作。

1.2 活络效灵丹促进斑马鱼组织修复实验

1.2.1 动物

野生AB品系、中性粒细胞特异性绿色荧光标记Tg（Mpo：eGFP）、巨噬细胞特异性红色荧光标记Tg（Mpeg：dsred）品系斑马鱼由南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室培育饲养。28.5 ℃循环过滤水系统养殖，光照时间14 h（光）：10 h（暗）。斑马鱼胚胎在28.5 ℃的环境下，于0.5 mg/mL的亚甲基蓝溶液中发育。所有动物实验均在机构动物护理与伦理委员会（伦理批号：L2020044）的监督下进行。

1.2.2 药物制备

活络效灵丹浓缩液：活络效灵丹由当归15 g、丹参15 g、乳香15 g、没药15 g组成，单味药饮片均购自于广东省南方医院中医科。将药材置于煎煮容器内，加入800 mL蒸馏水浸泡药材1 h，常规煎药30 min，纱布过滤。重复上述步骤2次，将收集的滤液均匀混合浓缩，制成浓度为5 g/mL生药浓缩液。冷却转移至灭菌容器中，存储于4 ℃冰箱备用。

1.2.3 试剂

亚甲基蓝（麦克林），三卡因（Sigma），琼脂糖（Aladdin）；AG RNAex Pro RNA提取试剂盒；Evo M-MLV RT Kit（AG艾瑞克），qPCR SYBR Green master mix Kit预混液试剂盒（Yeasen），DEPC处理水（生工）。

1.2.4 仪器

斑马鱼养殖系统（上海海圣生物）；体式荧光显微镜（OLYMPUS MVX10）；10 cm直径培养皿（白鲨）；AK-RO-C2实验室超纯水机（艾肯水精灵）；手术刀（百奥基）；胶头吸管（NEST）；Light Cycler 96仪器（BioRad）；NanoDrop 2000 微量紫外分光光度仪（ThermoFisher Scientific）。

1.2.5 药物毒理学

将斑马鱼胚胎浸入由活络效灵丹浓缩液配制的不同浓度（0、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL和1、2、4、8 mg/mL）的药液中（药物使用胚胎水稀释），在特定时间点（24、48、72、96和120 h）观察斑马鱼的孵化率和存活率。此外，在受精后5 d （5 dpf）使用体式显微镜观察斑马鱼幼鱼的发育情况，并测量斑马鱼幼鱼心率。

1.2.6 造模与干预

使用0.2%三卡因将3 dpf的斑马鱼幼鱼麻醉，然后在显微镜下使用无菌手术刀将尾鳍切除95%，随机分配到6孔板中，每孔30条幼鱼，分别暴露于标准培养液E2胚胎水（由去离子水中加入氯化钾（0.25 mmol/L）、氯化钠（7.5 mmol/L）、硫酸镁（0.5 mmol/L）、磷酸二氢钾（0.075 mmol/L）、磷酸氢二钠（0.25 mmol/L）、氯化钙（0.5 mmol/L）、碳酸氢钠（0.35 mmol/L）和美兰（0.5 mg/L）配置而成^［13］，配制E2胚胎水的试剂均购买自麦克林）和活络效灵丹低中高浓度（10、20和40 μg/mL）72 h。断尾后0、24、48和72 h在体式显微镜下观察不同时期尾鳍再生，以及巨噬细胞和中性粒细胞的迁移情况。

1.2.7 qPCR检测基因mRNA的表达

选取斑马鱼幼鱼造模与干预后24、48、72 h 3个时间点，每组收集30条幼鱼，用TRIzol试剂提取总RNA，并通过NanoDrop微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。然后使用Evo M-MLV RT Kit将mRNA逆转录为cDNA。随后，使用qPCR SYBR Green主混合试剂盒在Light Cycler 96仪器上进行扩增反应。每个基因的引物基于NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）信息设计，委托中国上海生工生物科技有限公司合成（表1）。计算每个基因的相对表达水平时，以β-actin作为内参基因使用2^-ΔΔCt法进行计算。

1.2.8 统计学分析

本实验数据使用Image J和GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，计量结果以均数±标准差表示。组间比较采用非配对t检验；多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 活络效灵丹治疗组织修复靶点筛选过程及PPI网络可视化

通过TCMSP筛选出活络效灵丹中活性成分120个，其中2个属于当归、65个属于丹参、8个属于乳香、45个属于没药，通过Swiss target Prediction数据库预测靶点775个。检索GeneCards数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库，分别获得组织修复相关靶点13 254、157、38个。其中GeneCards数据库进行4次筛选后合并去重获得组织修复靶点964个。将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集，得到149个交集靶点（图1）。交集靶点导入String平台得到PPI网络，共148个节点、3124条边，将结果导入Cytoscape 3.7.1软件进行筛选并进行可视化分析，得到17个核心靶点，度值排名前5为：丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、表皮生长因子受体（EGFR）、信号转导和转录激活因子3（STAT3），即为活络效灵丹促进组织修复的核心靶点（图2）。

2.2 交集靶点GO功能和KEGG通路富集分析

GO富集分析结果显示，BP包含245个条目，CC包含97个条目，MF包含123个条目。BP主要涉及对细胞迁移的正向调控、对外部刺激的应答、造血作用、细胞增殖等；CC主要影响受体复合物、细胞外基质、细胞质核周区等；MF包括蛋白激酶活性、激酶结合、相关酶活性、相同蛋白结合，条形图展示了P值排名前10的BP、CC、MF条目（图3A）。KEGG富集分析获得149条通路，主要涉及JAK-STAT信号通路、黏附连接、NF-κB信号通路、补体和凝血级联等，气泡图展示了P值排名前20的KEGG通路（图3B）。

2. 3 “活性成分-靶点-信号通路”网络构建与分析

活络效灵丹促进组织修复的“活性成分-靶点-信号通路”网络中，各成分、靶点及通路均以节点形式展示（图4），节点的颜色深浅与节点连接度的度值大小有关，颜色越深，度值越大，按度值从大到小排序，矮牵牛素、鹅掌楸树脂酚B二甲醚、木犀草素等为活络效灵丹促进组织修复的主要活性成分（表2）。

2.5 分子对接

矮牵牛素、鹅掌楸树脂酚B二甲醚、木犀草素等主要活性成分与核心靶点进行分子对接。结果显示（表3），结合能范围为-10.652~-4.331 kcal/mol，说明这些活性成分和关键靶点均存在一定的相互作用。其中AKT1、TNF与关键活性成分的结合能均低于-7.0 kcal/mol，显示出较强的结合能力。

2.6 活络效灵丹对斑马鱼幼鱼的毒性作用

使用不同浓度活络效灵丹浸泡斑马鱼幼鱼，在其生长发育过程中，超过80 μg/mL的活络效灵丹会诱导斑马鱼心包膨大和肾脏膨大，血管扩张（图5A）。在活络效灵丹干预后的24和48 h，320 μg/mL的浓度导致斑马鱼孵化率的下降和死亡率的显著上升，并且超过320 μg/mL浓度的活络效灵丹会导致斑马鱼幼鱼的全部死亡（P<0.0001，图5B、C）。80、160 μg/mL的活络效灵丹导致斑马鱼的心率降低（P<0.001，图5D）。根据药毒的结果选择活络效灵丹10、20和40 μg/mL 3个浓度进行下一步实验。

2.7 活络效灵丹干预斑马鱼幼鱼尾鳍组织修复情况

活络效灵丹低中高剂量组均促进了斑马鱼的尾鳍组织修复，在中剂量活络效灵丹干预组中观察到尾鳍几乎完全修复（图6A、B）。qPCR结果显示，72 h时，增殖细胞核抗原（PCNA）经活络效灵丹干预后在中剂量组明显升高（图6C）。同源框基因b（msxb）和成纤维细胞生长因子20a（fgf20a）在斑马鱼鱼鳍中顶端外胚层中表达，在再生活跃状态时表达升高。qPCR结果显示，模型组msxb和fgf20a mRNA表达升高，但是经过活络效灵丹干预后，基因表达明显升高（P<0.05，图6D、E）。与模型组对比，活络效灵丹促进了斑马鱼尾鳍修复（P<0.05），且中剂量效果最好。

2.8 活络效灵丹对促进斑马鱼尾鳍再生相关核心靶点的影响

与对照组相比，模型组AKT1，EGFR，STAT3的mRNA表达减少（P<0.01），经过活络效灵丹干预后表达升高（P<0.05，图7A~C）；模型组IL-6 mRNA表达显著增加（P<0.001），经过活络效灵丹干预后表达减少（P<0.001，图7D）。尽管模型组TNF-α较对照组表达增加不明显，但活络效灵丹中浓度干预后表达明显减少（P<0.05，图7E）。

2.9 活络效灵丹对斑马鱼幼鱼尾鳍伤口处不同时期中性粒细胞迁移的影响

在24 h和48 h，相比较模型组，活络效灵丹干预组的中性粒细胞主要集中在伤口区域，红色区域中的中性粒细胞总数量少于模型组。与24 h相比，48 h模型组中性粒细胞数量增加（P<0.05），虽然活络效灵丹干预组的中性粒细胞有所增加，但仍低于模型组（图7A、B、D）。

2.10 活络效灵丹对斑马鱼幼鱼尾鳍伤口处不同时期巨噬细胞迁移的影响

在24 h和48 h，活络效灵丹干预组的巨噬细胞统计红色区域巨噬细胞总数量少于模型组。与24 h相比，48 h模型组巨噬细胞数量增加（P<0.05），活络效灵丹干预组的巨噬细胞有增加，但仍低于模型组（图8A~C）。qPCR结果显示与模型组相比，活络效灵丹药物干预组ifng1 mRNA表达升高（P<0.05），且48 h的结果高于24 h（图8E）。

2.11 活络效灵丹对再生不同阶段巨噬细胞分型的影响

qPCR结果显示，在干预后的24 h内，与模型组相比，活络效灵丹显著上调了M1型促炎细胞因子Toll样受体4（TLR4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），以及M1型巨噬细胞标记物白细胞介素-1β（IL-1β）和诱导型一氧化氮合酶2（iNOS）（P<0.05，图9A~D）。与此同时，尽管在这一阶段对M2型抗炎细胞因子白细胞介素-4（IL-4）和M2型巨噬细胞标记物转化生长因子β（TGFβ）的影响不明显（P>0.05，图9E、F），但活络效灵丹促进了M2型抗炎细胞因子白细胞介素-13（IL-13）、白细胞介素-10（IL-10）以及M2型巨噬细胞标记物精氨酸酶1（ARG1）的表达（P<0.05，图9G~I）。而在48 h时点上，活络效灵丹的作用则发生了转变：它抑制了M1型促炎细胞因子和标记物的表达，同时进一步增强了M2型抗炎细胞因子和标记物的表达（P<0.05，图9）。

3 讨论

在中医理论下，组织损伤无论是来自金石走兽、六淫、毒邪等外力因素，还是来自体质、遗传等内在因素，都与气血密切相关^［14］。气血，外可充养皮肉筋骨，内可灌溉五脏六腑。清代《医宗金鉴》曰：“凡疮疡之初，必先调血气，令其通畅，无使凝滞^［15］。”其中“通畅”“无使凝滞”强调了血液行于脉道而无所阻，血液运行通畅，则瘀血不生，凸显了活血化瘀法在组织修复过程中的重要地位。现代研究表明，血瘀证候与多种炎症因子水平之间存在着显著的相关性^［8］。作为活血化瘀代表方，活络效灵丹共取药四味，以其君药丹参活血化瘀、通经止痛；臣药当归补血活血，增强化瘀效果；佐药乳香和没药共同强化活血止痛及消肿功能，可以达到活血祛瘀、通络镇痛的作用。

本研究基于网络药理学分析结合分子对接发现活络效灵丹中促进组织修复主要活性成分为矮牵牛素和木犀草素。通过PPI网络进一步分析和度值排名确定AKT1、IL-6、TNF-α、EGFR、STAT3为核心靶点。进一步的GO、KEGG功能富集分析显示，活络效灵丹对组织修复的调控作用与JAK-STAT信号通路、黏附连接、细胞迁移的正向调控等有关。在动物实验中，通过建立斑马鱼尾鳍截断模型评估活络效灵丹对组织再生的影响。根据药毒实验结果确定的药物安全浓度显示，高浓度的活络效灵丹会对斑马鱼幼鱼造成明显的肾毒性和心血管毒性，包括心动过缓现象。尽管在临床使用中未见活络效灵丹引起的全身毒性反应，吴虓飞等^［16］指出，活络效灵丹可使肝脏、肾脏和肾上腺系数增高，组织病理学检查未见明显病变。这些结果提示了活络效灵丹潜在的毒性风险，为临床药物的安全性评估提供了重要数据。此外，PCNA作为细胞增殖的指标，在研究中观察到活络效灵丹促进斑马鱼尾鳍组织修复和PCNA，msxb和fgf20a表达的上调。其中，fgf20α的上调启动了再生过程，促进上皮化和胚层形成^［17］；而msxb与fgf20α的上调共同推动了组织生长^［18］。

接下来对网络药理学筛选出的核心靶点进行实验验证。EGFR的激活可以启动PI3K-AKT信号通路，进而促进细胞增殖与分化，显著抑制细胞凋亡，进而调节组织的发育和稳态^［19］。AKT1作为该通路中的关键分子，通过磷酸化多种下游底物，不仅调控细胞存活和增殖，还增强细胞迁移和组织重建。此外，AKT1激活血管内皮生长因子受体（VEGFR），促进创面血管和肉芽组织的生长^{［20， 21］}。在伤口重塑阶段，AKT1还可通过抑制转录因子NF-κB的激活，减少炎症介质IL-6和TNF-α的产生，降低慢性炎症的发生风险^［22］。本研究也观察到，在72 h时间节点，模型组IL-6和TNF-α表达升高，经活络效灵丹干预后表达降低。另一方面，STAT3是JAK-STAT通路中的一个关键成员，可直接被JAK激酶磷酸化激活，成为恢复组织完整性的关键决定因素^［23］。活络效灵丹通过对EGFR和STAT3表达的促进作用，进而激活AKT1表达，这一过程有助于减轻炎症反应，支持组织修复和再生。

为了进一步探究炎症反应及细胞迁移的信号途径如何协调促进组织修复，研究利用中性粒细胞绿色荧光Tg（mpo：gfp）和巨噬细胞红色荧光Tg（mpeg1：dsred）双标记的转基因斑马鱼品系，来评估活络效灵丹对尾鳍切除后免疫细胞募集的影响。先前的研究报道表明，在伤口初期，中性粒细胞会迅速在损伤部位聚集，形成初始浸润潮，对抗感染并防止微生物入侵。随着愈合过程的发展，中性粒细胞数量逐渐减少，中性粒细胞数量减少，“吃我”信号上调，标志着清除阶段的完成^{［24， 25］}。随后，巨噬细胞迁移到损伤区域，通过吞噬作用清除病原体和受损组织，并分泌抗炎因子来调节炎症反应，防止过度炎症造成组织二次伤害。然而，当过多的巨噬细胞在伤口处聚集时，可能会释放大量炎症因子，从而延缓愈合进程^［26］。本研究结果显示，在斑马鱼尾鳍再生过程中，中性粒细胞和巨噬细胞在特定区域存在共同定位表达的现象，这反映了这两种免疫细胞在组织修复过程中的协同工作^{［27， 28］}。活络效灵丹促进了斑马鱼尾鳍伤口处中性粒细胞和巨噬细胞的适度聚集，但总体数量低于模型组，表明该药物可能有助于维持适当的炎症水平，避免过度炎症。此外，活络效灵丹能够增加ifng1的表达，调节免疫状态，增强受体介导的吞噬功能，提高巨噬细胞和中性粒细胞的杀伤活性^［29］。综上表明，活络效灵丹能优化免疫细胞的数量和功能，有效地促进组织修复过程中的炎症调控和细胞迁移。

值得注意的是，巨噬细胞在组织修复的不同阶段表现出不同的功能特性，即巨噬细胞的极化状态。这种极化现象对于确保有效的组织修复至关重要。在伤口愈合的不同阶段中，巨噬细胞动态激活为促炎性的M1型和抗炎性的M2型^［30］。M1型极化巨噬细胞介导组织损伤并促进Th1型免疫反应，以清除细胞内的病原体；而M2型巨噬细胞则在抗炎因子（如IL-4和IL-13）的影响下形成，在伤口愈合和炎症缓解中发挥关键作用^［31］。在本研究中，我们检测了不同时间段与M1和M2型相关的标记物表达，包括TLR4、TNF-α、IL-1β、NOS2（M1型），以及IL-4、TGF-β、IL-13、IL-10和ARG1（M2型）。结果表明，在伤口早期，活络效灵丹干预促进M1型促炎细胞因子和标记物的表达显著增加；而在48 h，M1型促炎标记物的表达受到抑制，并伴随M2型抗炎细胞因子和标记物表达的增强。这些发现提示，活络效灵丹能够根据再生进程的不同阶段动态调节巨噬细胞的极化状态，从早期的促炎性M1型转向后期的抗炎性M2型，从而协同促进组织修复过程。

综上所述，本研究结合组织修复进程与传统血瘀理论，利用斑马鱼模型探讨了活络效灵丹在促进尾鳍再生中的作用及其背后的免疫调控机制。研究发现，活络效灵丹通过调节中性粒细胞和巨噬细胞的募集及极化状态（特别是M1向M2型转换），显著促进了尾鳍再生。这一过程涉及多个关键靶点，包括AKT1、IL-6、TNF-α、EGFR和STAT3等因子。值得注意的是，本研究使用的是全组织样本而非纯化的巨噬细胞群体，这提示未来的研究可以通过更精细的技术进一步解析不同细胞类型的具体贡献。尽管我们已经取得了一定进展，但仍需对活络效灵丹的关键成分及其具体作用机制进行深入验证，以完善其临床应用方案。

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