菊淀粉型巴戟天寡糖降低肺炎链球菌脑膜炎小鼠的症状评分和死亡率

Therapeutic effects of inulin-type oligosaccharides of Morinda officinalis on Streptococcus pneumoniae meningitis in mice

摘要

目的 探究菊淀粉型巴戟天寡糖（IOMO）对小鼠肺炎链球菌脑膜炎（SPM）的治疗作用及可能的作用机制。 方法 将120只雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、SPM+生理盐水（Saline）组、SPM+IOMO 25 mg/kg剂量组、SPM+IOMO 50 mg/kg剂量组，n=30。从造模当天起（0 d），SPM+Saline组和SPM+IOMO组小鼠分别灌胃生理盐水或IOMO 25 mg/kg、50 mg/kg进行干预，持续7 d，记录症状评分和死亡情况；采用脑组织HE染色和尼氏染色评价病理状态和神经元损伤情况，qRT-PCR检测皮质中炎症相关分子mRNA水平，干湿重法测脑含水量和伊文思蓝染色评价脑水肿程度和血脑屏障通透性，Western blotting检测皮质中BBB相关蛋白水平，流式细胞分析检测浸润淋巴细胞IFN-γ水平；SPM造模后21 d采用旷场实验和新物体识别实验评价小鼠学习记忆功能。 结果 灌胃给予IOMO 50 mg/kg（1次/d，连续7 d）可降低SPM小鼠的症状评分和死亡率（P<0.05），缓解脑组织病理损伤，降低皮质炎症相关分子（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18、IFN-γ、iNOS、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD）mRNA水平（P<0.05）； IOMO可以降低SPM小鼠脑含水量和伊文思蓝渗透量（P<0.05）；IOMO可以上调脑皮质血管内皮钙黏蛋白VE-Cadherin和闭合蛋白Occludin水平、下调水通道蛋白AQP4和BBB损伤的关键调控因子iNOS、IFN-γ水平（P<0.05）；建模21d后，与SPM + Saline组小鼠相比，IOMO可以改善SPM小鼠学习记忆能力（P<0.05）。 结论 首次发现IOMO可降低SPM小鼠的症状评分和死亡率，并改善其学习记忆能力，其作用机制可能与IOMO抑制过度炎症反应并保护血脑屏障有关。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic effects of inulin-type oligosaccharides of Morinda officinalis (IOMO) in a murine model of Streptococcus pneumoniae meningitis (SPM) and explore its possible mechanisms. Methods A total of 120 male C57BL/6J mice were randomly assigned into Sham, SPM+Saline, SPM+IOMO (25 mg/kg), and SPM+IOMO (50 mg/kg) groups. After modeling, the mice received daily gavage of saline or IOMO at the indicated doses for 7 consecutive days, and the changes in symptom scores and mortality of the mice were monitored. Brain pathology and neuronal injury of the mice were assessed using HE and Nissl staining, and qRT-PCR was performed to detect mRNA levels of the inflammatory mediators. Brain edema and blood-brain barrier (BBB) permeability of the mice were evaluated by measuring brain water content and Evans blue (EB) staining; Western blotting was used to analyze the expressions of BBB-associated proteins, and flow cytometry was employed to detect IFN‑γ expression level in the infiltrating lymphocytes. Open-field test (OFT) and novel object recognition test (NORT) were conducted to assess learning and memory ability of the mice on day 21 after modeling. Results IOMO treatment at 50 mg/kg significantly reduced the symptom scores and mortality rate of SPM mice, alleviated brain damage, and downregulated mRNA levels of IL-6, TNF‑α, IL-1β, IL-18, IFN‑γ, iNOS, NLRP3, ASC, caspase-1 and GSDMD in the brain tissue. IOMO treatment also decreased brain water content and EB leakage, upregulated VE-cadherin and occludin expressions, and suppressed AQP4, iNOS, and IFN‑γ levels of the mice. IOMO-treated mice exhibited improved learning and memory compared with the saline-treated mice on day 21 after SPM modeling. Conclusion IOMO alleviates SPM symptoms, reduces mortality, and mitigates cognitive deficits in mice possibly by suppressing cerebral inflammation and protecting BBB functions.

Graphical abstract

关键词

菊淀粉型巴戟天寡糖 / 脑膜炎 / 肺炎链球菌 / 血脑屏障 / 干扰素-γ

Key words

inulin-type oligosaccharides of Morinda officinalis / meningitis / Streptococcus pneumoniae / blood-brain barrier / interferon-γ

细菌性脑膜炎（BM）是一种危及生命的中枢神经系统感染性疾病，是全球感染相关死亡的十大原因之一，具有发病快、爆发急、流行潜力大、死亡率高（16%~37%）等特点^［1］。BM及其它感染（如新冠病毒）诱发的非可控免疫反应，又称炎症因子风暴，被认为是其高致死率的关键病理机制，对于此类“炎性风暴”损伤目前尚缺乏有效的干预手段。肺炎链球菌（S.P）是引起BM的主要细菌之一；流行病学研究表明，肺炎链球菌脑膜炎（SPM）在所有脑膜炎中致死率最高，且高达50%的幸存者会发生长期中枢神经系统后遗症^［2］。S.P通过本身的毒力因子（如荚膜、表面蛋白和溶血素等）和继发的炎症因子风暴破坏血脑屏障，诱发脑水肿，这是其导致神经元损伤和严重后遗症的重要原因^［3］。尽管抗生素和糖皮质激素可有效治疗SPM，但致死率和病残率仍然较高，并导致精神运动障碍、记忆功能低下、听力损伤等后遗症，且存在潜在的细菌耐药风险^［4］。探究感染后过度免疫反应的调控药物被认为是高效干预此类疾病的理想选择之一^［5］。

近年来，基于新冠肺炎的治疗经验，中医药在感染性疾病防治中的应用日趋受到重视^［6］。中药巴戟天是“四大南药”之一，为茜草科植物巴戟天的干燥根，已有2000多年的药用历史；具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，见于100多种中成药和200多种传统方剂^［7］。菊淀粉型巴戟天寡糖（IOMO）是从巴戟天中提取的、以水溶性菊淀粉型3-9聚寡糖为主的中药有效部位。巴戟天寡糖胶囊（国药证字 Z20120007）于2012年获批上市，主要用于临床轻中度抑郁症治疗，临床疗效与一线化学药氟西汀相当^［8］。研究表明，巴戟天提取物还具有抗氧化^［9］、抗炎^［10］等多种生物活性；口服IOMO可抑制慢性应激诱导的中枢神经系统炎症^［11］，并对溃疡性结肠炎也有明确的治疗作用^［12］。目前还没有该药用于防治细菌性脑膜炎的报道。本研究拟建立小鼠SPM模型，探究IOMO对SPM的治疗作用及潜在机制，以期为SPM的临床治疗提供新思路，进一步为传统中药应用于感染性疾病的治疗提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性8周龄C57BL/6J小鼠120只，体质量21±1 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010，实验小鼠饲养于屏障环境，温度22±2 ℃， 相对湿度（60±5）%，光照明暗交替（光照时间为8∶00~20∶00），实验期间小鼠均自由活动及摄食饮水。所有动物实验程序均经军事医学研究院实验动物福利伦理委员会批准（伦理批号：IACUC-DWZX-2023-P550）；实验动物的饲养及干预处理严格遵循《实验动物管理原则》。

1.2 试剂与仪器

IOMO原料药（浅黄色粉末，北京同仁堂），其中3-9 聚寡糖含量53%~70%，5聚糖含量≥6%。肺炎链球菌（ATCC）；CD11b-percp、CD45-APC、IFN-γ-PE流式抗体（Biolegend）；Percoll 细胞分离液（GE Healthcare）；反转录试剂盒（TransGen Biotech）；TRIzol试剂（Invitrogen）；β-actin一抗、iNOS一抗、AQP4一抗、VE-Cadherin一抗、Occludin一抗、IFN-γ一抗（ABclonal）；PVDF膜（Amersham Biosciences）；伊文思蓝（Macklin）。

流式细胞分析仪（BD）；PCR仪（Bio-Rad）；实时荧光定量PCR仪（罗氏）；高速离心机（Eppendorf）；，低速离心机（Thermo）；微量注射器（上海安亭微量进样器厂）；恒温摇床（苏州培英实验设备有限公司）；Western blotting电泳仪（Bio-Rad）；化学发光凝胶成像自动显影仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.3 建模与分组

参照文献^［13］制备S.P悬液。1%戊巴比妥钠按体质量10 µL/g腹腔注射麻醉小鼠；医用酒精消毒额顶皮肤、剪开皮肤并清理多余毛发；固定小鼠并调整姿态，暴露枕骨大孔；用微量进样器从枕骨大孔注射10 μL（1×10⁹ CFU/mL）菌液，注射后缓慢拔出针头；缝合额顶皮肤，将小鼠放回笼内。小鼠出现毛发干枯、无光泽，弓背向上，反应迟钝等表现，提示建模成功。将建模成功小鼠随机分为SPM+Saline组、SPM+IOMO 25 mg/kg组和50 mg/kg组；Sham组小鼠采用相同方法注射10 μL生理盐水；n=30。从建模当日（0 d）小鼠苏醒后起，每日对小鼠灌胃给予生理盐水或者IOMO溶液，持续7 d。实验流程见图1。

1.4 记录小鼠症状评分和死亡情况

根据Koopmans等^［14］提出的症状评分标准对各组小鼠进行评价，建模后每日记录小鼠症状评分和死亡情况。

1.5 HE染色观察脑组织病理学改变

麻醉小鼠后用20 mL生理盐水灌注，脊椎脱臼法处死小鼠，取完整脑组织；脑组织用生理盐水清洗后置于4%多聚甲醛中固定24 h；常规石蜡包埋，制备成厚度约4 μm的病理切片。将切片置于55 ℃烤箱内烘烤30 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，加入苏木精染液染色5 min，流水冲洗；加入伊红染液染色1 min，流水再冲洗后，脱水、透明，滴加中性树胶封片，自然晾干，在光学显微镜下观察组织病理变化并采集图像。

1.6 尼氏染色观察神经细胞形态变化

取1.5中制备的小鼠脑组织病理切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，浸入甲基紫染液中染色10 min，蒸馏水洗涤，滴加 Nissl Differentiation分化数秒，无水乙醇处理、二甲苯透明，充分洗涤后滴加中性树胶封片，自然晾干，在光学显微镜下观察切片染色情况并采集图像。

1.7 qRT-PCR检测小鼠脑皮质组织中炎症相关分子mRNA表达情况

参照试剂盒说明书，用TRIzol试剂提取小鼠脑皮质组织的总RNA，逆转录成cDNA，设计引物（引物由生工生物工程有限公司合成，序列见表1），以cDNA为模板，设置3复孔，进行qRT-PCR检测，以18S为内参对照，按2^-∆∆Ct计算相对表达量，采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。

1.8 脑含水量检测

取完整的小鼠脑组织置于小玻璃瓶中，称取脑组织湿质量W₁；随后将小玻璃瓶置于温度100 ℃的烤箱内脱水24 h，称量脑组织干质量W₂，计算脑含水量，脑含水量（%）=（W₁-W₂）/W₁。

1.9 伊文思蓝（EB）染色检测BBB通透性

小鼠尾静脉注射EB染料（1%，2 mL/kg），循环1 h后观察到小鼠四肢、口鼻等皮肤裸露处明显变蓝；随后麻醉小鼠，用20 mL生理盐水灌注，脊椎脱臼法处死小鼠，取完整脑组织；加入2 mL/100 mg二甲基甲酰胺匀浆研磨，55 ℃孵育18 h，离心取上清液，测定样品吸光度A_{620 nm}并计算EB透过量。

1.10 Western blotting测定脑皮质AQP4、VE-Cadherin、Occludin、IFN-γ和iNOS水平

麻醉小鼠后用20 mL生理盐水灌注，脊椎脱臼法处死小鼠，取脑皮质组织；取得的组织加入RIPA裂解液裂解，离心后取上清液提取总蛋白；BCA法绘制标曲并定量蛋白浓度。制备10% SDS-PAGE凝胶，恒压电泳分离蛋白，将蛋白转印至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入AQP4（1∶500）、VE-Cadherin（1∶500）、Occludin（1∶1000）、IFN-γ（1∶500）、iNOS（1∶1000）和β-actin（1∶5000）一抗，4 ℃孵育过夜；次日用TBST漂洗PVDF膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST漂洗后加入ECL显影液显色，以β-actin为内参，采用全自动凝胶成像分析仪进行拍照，采用Image J软件分析条带灰度值，以待测目的蛋白与内参β-actin 灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.11 流式细胞分析检测脑组织浸润淋巴细胞IFN-γ水平

参照文献［15］方法配制FACS缓冲液（含2% FBS的PBS溶液）、10% 1640培养基、40% Percoll和70% Percoll 用于实验。小鼠脑组织经研磨后加入胶原酶D和DNase消化，离心后用40% Percoll重悬；随后将40% Percoll（含细胞）沿试管壁缓慢滴加到70% Percoll上层，离心后收集40% Percoll和70% Percoll之间的单核细胞层，FACS缓冲液离心清洗。加入胞内染色刺激剂37 ℃刺激6 h，按说明书要求加入流式抗体（CD11b-percp、CD45-APC），4 ℃避光孵育30 min；FACS缓冲液清洗后加入PB固定液（200 μL/样品），4 ℃固定过夜；次日用1 mL PB固定液清洗1次，100 μL PB固定液重悬，按说明书要求加入流式抗体IFN-γ-PE，4 ℃避光孵育30 min，1 mL PB固定液清洗2次，重悬后待测。圈门策略参考文献^［16］，结果采用Flow jo软件分析。

1.12 行为学评价

1.12.1 旷场实验（OFT）

采用OFT评价各组小鼠的习惯性记忆。在训练阶段，小鼠从旷场实验箱（50 cm×50 cm×40 cm，底部均分为16小格）角落面向箱壁放入，自由活动5 min，采用Smart视频分析软件统计小鼠穿越箱底分隔线的次数（LCT）；24 h后再次测试，受试小鼠因对实验箱环境有习惯性记忆而探索行为减少，LCT下降^［17］。行为学实验采用盲法，即由不了解具体分组情况的人员实施和记录；每轮实验间用75%乙醇溶液擦拭实验箱内部，清理小鼠排泄物，并待乙醇完全挥发后再放入下一只小鼠。

1.12.2 新物体识别实验（NORT）

采用NORT评价各组小鼠的认知能力。训练阶段，在实验箱（50 cm×50 cm×40 cm）一侧放置两个完全相同的物体（两物体处于对称位置），将受试小鼠放入实验箱中，自由探索5 min；在测试阶段（24 h后），将实验箱中的一个物体更换为新物体（新物体的颜色、形状等与旧物体不同，尺寸、体积与旧物体相似），再次将受试小鼠放入实验箱中，自由探索5 min，采用Smart视频分析软件记录小鼠探索新物体的时间T₁和探索旧物体的时间T₂，计算识别指数RDI=T₁/（T₁+T₂）×100%^［17］。

1.13 统计学分析

计量资料以\mathrm{均数}±标准差表示，使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，数据作正态性和方差齐性检验，生存率统计采用Kaplan-Meier法，组间比较采用双因素方差分析，其余两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IOMO降低SPM小鼠症状评分和死亡率

各组小鼠症状评分和生存率（图2）。Sham组小鼠在注射生理盐水后仅出现短暂的体质量下降趋势，饮食及活动正常；SPM+Saline组和SPM+IOMO组小鼠在建模后出现毛发干枯、无光泽，弓背向上，反应迟钝，体质量下降等症状。与Sham组相比，SPM+Saline组小鼠的症状评分随时间升高（P<0.05）；灌胃IOMO 25 mg/kg（1次/d，连续7 d，下同）仅使SPM小鼠的症状评分略有下降趋势，而灌胃IOMO 50 mg/kg使SPM小鼠的症状评分降低（P<0.05），生存率提高（P<0.05），呈现治疗效应的剂量依赖关系，后续研究中采用IOMO 50 mg/kg作为有效剂量。

2.2 IOMO对SPM小鼠脑组织病理形态学的影响

HE染色结果显示（图3），Sham组小鼠脑组织完好，神经细胞形态正常且排列有序，细胞核着色均匀；而SPM+Saline组小鼠脑组织结构疏松，血管扩张充血，神经细胞肿胀变形，细胞核固缩，可见坏死细胞，并有大量炎症细胞浸润；相较于SPM+Saline组，SPM+IOMO组（50 mg/kg）小鼠脑组织细胞形态有所恢复，细胞核固缩减少，炎症细胞浸润程度明显减轻。

各组小鼠脑组织内均有呈尼氏染色阳性的神经元细胞。与Sham组相比，SPM+Saline组小鼠脑组织尼氏染色阳性细胞数目明显减少；而与SPM+Saline组相比，SPM+IOMO组小鼠脑组织尼氏染色阳性细胞数明显增加（图4）。

2.3 IOMO对SPM小鼠脑皮质炎症相关分子mRNA水平的影响

与Sham组相比，SPM+Saline组小鼠脑皮质组织中促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、iNOS和炎症小体通路相关分子NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、IL-18 mRNA水平明显升高（P<0.05）；而与SPM + Saline组相比，IOMO 50 mg/kg可以逆转上述分子mRNA水平（P<0.05，图5）。

2.4 IOMO对SPM小鼠脑组织含水量和BBB通透性的影响

与Sham组相比，SPM+Saline组小鼠脑组织EB含量（P<0.05）和含水量（P<0.05）升高，提示SPM小鼠BBB损伤，通透性增加，发生脑水肿；而与SPM+Saline组相比，SPM+IOMO组小鼠脑组织EB含量（P<0.05）和含水量（P<0.05）降低（图6）。

2.5 IOMO对SPM小鼠BBB通透性相关分子表达水平的影响

与Sham组相比，SPM+Saline组小鼠脑皮质血管内皮钙黏蛋白VE-Cadherin和闭合蛋白Occludin表达减少，水通道蛋白Aquaporin-4（AQP4）和BBB损伤的关键调控因子iNOS、IFN-γ表达增加（P<0.05）；而与SPM+Saline组相比，IOMO 50 mg/kg可逆转上述分子表达水平（P<0.05，图7）。

与Sham组相比，SPM+Saline组小鼠脑组织CD11b^loCD45⁺IFN-γ⁺细胞比例明显升高（P<0.05）；而与SPM+Saline组相比，SPM+IOMO组小鼠脑组织CD11b^loCD45⁺IFN-γ⁺细胞比例明显降低（P<0.05，图8）。

2.6 IOMO缓解SPM引起的小鼠学习记忆功能障碍

旷场实验显示（图9A、B），Sham组小鼠在测试阶段的自主活动比在训练阶段减少（P<0.05）；而SPM+Saline组小鼠的自主活动在训练阶段和测试阶段差异没有统计学意义（P>0.05）；IOMO 50 mg/kg可恢复小鼠的习惯性记忆能力（P<0.05）。在新物体识别实验中（图9C），Sham组小鼠对新鲜物体具有明显的偏好性，表现为对新事物探索时间长于对旧事物（P<0.05）；而SPM+Saline组小鼠对新物体的探索欲明显较低，探索新、旧物体的时间差异无统计学意义（P>0.05）；IOMO 50 mg/kg治疗可恢复小鼠的学习记忆能力（P<0.05）。

3 讨论

炎症因子风暴和BBB损伤在SPM的发生发展中发挥重要作用^［18］。本研究首次发现IOMO可显著降低SPM小鼠的症状评分和死亡率，缓解过度炎症反应和神经元损伤，降低BBB通透性，改善脑水肿，恢复SPM小鼠后期的自主行为和学习记忆能力，对SPM具有显著保护和治疗作用。

目前临床上对于SPM的治疗，主要采用抗生素（如头孢曲松^［19］）联合糖皮质激素药物（如地塞米松和氢化可的松^［20］）进行抗菌、抗炎处理。现有治疗方案通过抑制炎症反应、改善神经元代谢、控制粘连和水肿等缓解患者症状、改善预后。但是抗生素的大规模使用带来致病菌进化、耐药菌增加等问题^［21］；临床研究发现糖皮质激素类药物对带有脓毒性休克症状的SPM患者有加重病情的风险^［22］，而且在一些以小鼠为实验对象的基础研究中发现，糖皮质激素类药物可能加重海马神经元损伤^［23］。与现有临床用药相比，中药具有多靶点、多途径和低不良反应等优势，其在以新冠肺炎为代表的急重症感染性疾病治疗中发挥重要作用，成为干预此类疾病的理想选择之一^［6］。研究表明，IOMO具有较强的抗炎、抗氧化等免疫调控功能，还可通过增加脑源性神经营养因子的表达发挥神经元保护作用^［7］，因此本研究尝试运用IOMO对SPM小鼠进行治疗干预。本研究结果显示，IOMO可以有效改善SPM小鼠的症状，降低死亡率；脑组织HE染色和尼氏染色结果显示，IOMO组小鼠脑组织细胞形态有所恢复，炎性浸润现象明显改善，神经元细胞形态和数量趋于正常。前期研究证实，灌胃给予IOMO 25~100 mg/kg具有明确的抗抑郁效应^［24］，IOMO 50 mg/kg还具有抗PTSD^［8］、改善AD小鼠学习记忆能力^［25］等作用。目前已经上市的巴戟天寡糖胶囊（北京同仁堂，国药准字Z20120013）治疗抑郁症口服剂量为300~600 mg/d（以IOMO计算），临床研究数据显示^［26-28］，该剂量长期服用不良反应轻微，显示出良好的安全性。以该临床给药剂量折算成小鼠剂量为45.05~90.1 mg/kg，与本研究采用剂量基本一致。在SPM小鼠症状评分和死亡率实验中，高剂量IOMO（50 mg/kg）的治疗效果优于低剂量（25 mg/kg），表现出一定的剂量依赖关系，这与上述IOMO相关研究中的效应剂量一致，提示IOMO在抗抑郁有效剂量范围内，可有效保护和治疗SPM导致的脑损伤。

SPM病理的关键驱动因素是机体对细菌的免疫反应^［2］。在一项包含48例BM患者的临床研究中发现，患者脑内以TNF-α为代表的炎症因子水平与疾病的严重程度和中枢神经系统后遗症呈正相关^［29］；有研究也发现^［30］，SPM小鼠脑组织中IL-1β水平与中枢神经系统后遗症相关。在本研究中，SPM+Saline组小鼠脑皮质组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18、IFN-γ、iNOS等促炎性细胞因子水平高于Sham组，与上述文献报道基本一致，提示SPM+Saline组小鼠脑组织中存在严重炎症反应；相较于SPM+Saline组，SPM+IOMO组小鼠脑组织中炎症因子水平下降，炎症反应得以缓解。IL-18和部分IL-1β主要来源于激活的炎症小体，实验结果显示SPM组小鼠脑组织炎症小体相关分子NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD mRNA水平升高，而IOMO组水平降低，提示炎症小体可能是IOMO抑制炎症因子风暴的途径之一。

BBB调控循环和中枢神经系统之间的物质交流，是保护中枢神经系统免受病原体侵袭的关键结构^［31］。在SPM中，S.P本身的毒力因子和继发的炎症因子风暴均对BBB产生破坏作用，引发免疫细胞浸润和级联炎症反应，这是SPM预后不良、后遗症高发的重要原因^［3］。AQP4在脑组织和BBB细胞广泛表达，对维持脑内水平衡和BBB完整性发挥重要作用；在SPM中，星形胶质细胞等AQP4表达升高，诱发细胞毒性脑水肿，导致不良预后^［32］。VE-cadherin和Occludin主要表达于内皮细胞，是组成细胞间紧密连接的重要成分^［33］。在本研究中，SPM+Saline组小鼠脑组织含水量、EB含量和AQP4水平明显升高，提示BBB通透性增加，出现脑水肿症状，与上述文献报道一致；与SPM+Saline组相比，IOMO给药小鼠脑组织含水量、EB含量和AQP4水平明显降低，提示BBB被部分修复、通透性降低，脑水肿症状缓解。然而，EB染色尚无法精确揭示BBB损伤的具体位置，在SPM中同时存在着紧密连接蛋白破坏^{［34， 35］}、脑微血管内皮细胞穿孔^{［36， 37］}等多种BBB损伤。本研究发现IOMO治疗使SPM小鼠VE-Cadherin和Occludin表达水平回升，提示部分修复S.P对BBB连接蛋白的破坏，这可能是IOMO保护BBB的机制之一，IOMO是否同时通过其他途径（如影响肺炎链球菌溶血素的穿孔作用）发挥BBB保护作用还需要进一步研究和探讨。

BBB和神经元损伤与SPM患者的中枢神经系统后遗症呈正相关^［3］。为进一步研究IOMO对SPM小鼠学习和记忆功能障碍的影响，本研究通过OFT和NORT对各组小鼠进行评价；造模21 d后，SPM+Saline组小鼠习惯记忆能力和自主探索能力明显降低；而SPM+IOMO组小鼠的习惯记忆能力和自主探索能力明显回升，表明IOMO能有效改善SPM引起的学习记忆能力损伤。

IFN-γ和iNOS在SPM病理进程中扮演重要角色，其中IFN-γ也是SPM临床检测的主要指标之一^［38］。在SPM中，IFN-γ的产生主要受炎症小体接头蛋白ASC和IL-18调控^［39］；IFN-γ激活巨噬细胞和抗原呈递细胞，并与IL-1β一起调节其他细胞因子的产生，使其成为细胞因子风暴的关键调控因子^［40］。在小鼠SPM模型中IFN-γ可通过诱导一氧化氮合酶2破坏BBB^［13］；而Too等^［41］研究者发现，与WT小鼠相比，IFN-γ^-/-小鼠的BBB通透性和促炎细胞因子水平降低，海马和皮层神经元损伤减少，行为和认知障碍得到改善。iNOS主要在中性粒细胞中存在，在炎症、感染等病理状态下可出现异常高表达，诱导NO合成，进而引发细胞毒性；研究表明NO在BM的发生和发展中发挥重要作用^［42］，可促进BBB破坏和促炎性细胞因子的产生^［43］。在本研究中，SPM+Saline组小鼠脑皮质中IFN-γ、iNOS和脑组织浸润淋巴细胞（CD11b^loCD45⁺）中IFN-γ水平明显升高，而SPM+IOMO组小鼠IFN-γ、iNOS水平明显下降，提示IOMO可能通过调控IFN-γ、iNOS水平抑制级联炎症反应，保护BBB。Chi等^［44］研究者发现口服IOMO吸收较差，口服后血液和脑内的药物浓度较低；进一步研究发现IOMO可能主要通过“肠-脑”轴影响中枢神经系统功能，发挥治疗作用^［45］。肠道菌群与BBB功能关系密切^［46］，这可能是IOMO发挥BBB保护作用的重要内在机制。本研究的不足之处主要在于尚未对IOMO影响炎症因子水平和保护血脑屏障的机制作深入探索，这也是我们未来进一步研究的方向。

综上所述，IOMO能缓解SPM引起的急性症状，降低死亡率；减少脑组织炎症反应和神经元损伤，减轻脑水肿和神经系统后遗症。其作用机制可能与其抑制过度炎症反应、保护血脑屏障有关。本研究也为IOMO应用于急重症感染性疾病的治疗提供了理论依据。

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