升麻素抑制MAPK通路调节辅助性T细胞免疫平衡改善小鼠克罗恩病样结肠炎

Cimifugin ameliorates Crohn's disease-like colitis in mice by modulating Th-cell immune balance via inhibiting the MAPK pathway

摘要

目的 探索升麻素（CIM）对小鼠克罗恩病（CD）样结肠炎的作用以及可能的机制。 方法 30只体质量20~23 g（6~8周龄）的C57BL/6雄性小鼠随机分为空白对照组、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）组和CIM组，10只/组。TNBS组使用TNBS灌肠建立CD样结肠炎模型，CIM组经TNBS灌肠后每日灌胃CIM（12.5 mg/kg）。通过记录小鼠体质量变化和疾病活动指数（DAI）评分，测量结肠长度，进行HE染色炎症评分以及检测肠黏膜中炎症因子水平评估CIM对小鼠结肠炎的作用；采用免疫荧光及免疫印记检测小鼠肠屏障损伤；流式细胞术检测各组小鼠肠系膜淋巴结中辅助性T细胞亚群的比例；通过网络药理学预测CIM潜在作用靶点，KEGG富集分析筛选关键通路，分子对接验证CIM与MAPK通路核心蛋白的结合能力；Western blotting验证MAPK信号通路的改变。 结果 CIM干预改善了TNBS诱导的小鼠体质量降低和结肠缩短，同时DAI评分和结肠组织炎症评分低于TNBS组（P<0.05）。ELISA和PCR检测结果显示，同TNBS组相比，CIM降低小鼠肠黏膜组织中促炎因子（IFN-γ和IL-17）的水平并促进抗炎因子（IL-4和IL-10）表达（P<0.05）。免疫荧光结果显示，CIM可改善TNBS诱导的小鼠上皮细胞Claudin-1的缺失和移位，以及杯状细胞的减少（P<0.05）；免疫印记数据提示CIM组小鼠结肠黏膜中Claudin-1和ZO-1表达高于TNBS组（P<0.05）。流式细胞术检测结果表明CIM干预后肠系膜淋巴结中Th1和Th17细胞比例下降，而Th2及Treg细胞比例升高（P<0.05）。KEGG富集分析发现CIM对肠炎的作用可能与MAPK信号通路相关，分子对接显示，CIM与MAPK通路核心靶点之间有很好的结合，免疫印记结果显示p-JNK、p-ERK和p-p38在CIM组的小鼠肠黏膜中表达低于TNBS组（P<0.05）。 结论 CIM可改善肠屏障损伤从而缓解TNBS诱导的小鼠克罗恩病样结肠炎，这与其抑制MAPK信号通路的激活调节小鼠肠道Th1/Th2和Th17/Treg平衡有关。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic effects of cimifugin on Crohn's disease (CD)-like colitis in mice and its possible mechanism. Methods Thirty adult male C57BL/6 mice were randomized equally into control group, 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)-induced CD-like colitis model group, and cimifugin treatment (daily gavage at 12.5 mg/kg) group. The therapeutic effect of cimifugin was evaluated by observing changes in body weight, disease activity index (DAI) scores, colon length, histopathological inflammation scores, and inflammatory cytokine levels in the colonic mucosa. Intestinal barrier integrity in the mice was assessed using immunofluorescence assay and Western blotting for claudin-1 and ZO-1; T-helper (Th) cell subset ratios in the mesenteric lymph nodes were analyzed with flow cytometry. Network pharmacology, KEGG enrichment analysis and molecular docking were used to predict the targets of cimifugin and analyze the key pathways and cimifugin-MAPK protein interactions, which were validated by Western blotting in the mouse models. Results In mice with TNBS-induced colitis, cimifugin treatment significantly attenuated body weight loss and colon shortening, lowered DAI and histopathological scores, decreased IFN-γ and IL-17 levels, and increased IL-4 and IL-10 levels in the colonic mucosa. Cimifugin treatment also significantly improved TNBS-induced claudin-1 dislocation and reduction of goblet cells, upregulated claudin-1 and ZO-1 expressions, reduced Th1 and Th17 cell percentages, and increased Th2 and Treg cell percentages in the colonic mucosa of the mice. KEGG analysis suggested a possible connection between the effect of cimifugin and MAPK signaling, and molecular docking showed strong binding affinity between cimifugin and MAPK core proteins. Western blotting demonstrated significantly decreased phosphorylation levels of JNK, ERK, and p38 in the colonic mucosa of cimifugin-treated mouse models. Conclusion Cimifugin alleviates TNBS-induced CD-like colitis by repairing intestinal barrier damage and restoring Th1/Th2 and Th17/Treg balance via suppressing MAPK pathway activation.

Graphical abstract

关键词

克罗恩病 / 升麻素 / MAPK / 辅助性T细胞 / 免疫平衡 / 肠屏障

Key words

Crohn's disease / cimifugin / MAPK / helper T cells / immune homeostasis / intestinal barrier

炎症性肠病（IBD）是一种胃肠道慢性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），其中CD具有致残性严重影响患者的身心健康^{［1， 2］}。尽管CD的发病机制尚未完全明了，但环境、遗传、微生物和免疫等因素相互作用，形成了一个复杂的网络，共同推动了疾病进程^{［3， 4］}。CD患者存在肠黏膜免疫失衡，其中辅助性T细胞亚群应答紊乱可释放大量的促炎细胞因子，进而加重肠屏障损伤和肠道炎症^{［5， 6］}。当前，抗炎治疗仍是CD的主要治疗方案^［7］，尽管地塞米松、美沙拉嗪、阿达木单抗等药物对活动期CD抗炎治疗具有不错的疗效，但仍存在不良反应、不应答或耐药性等问题，亟需开发新型且安全有效的治疗药物^［8］。近年来，传统中药在多种炎性相关性疾病（包括IBD）治疗中表现出巨大的药用价值^［9］。我们前期也报道多种天然植物或中药提取物在IBD治疗中的作用，如中药紫堇提取物乙酰紫堇灵可通过抑制肠上皮细胞凋亡改善小鼠肠屏障损伤^［10］，柠檬提取物香叶木素可通过调节免疫应答减轻小鼠结肠炎^［11］。传统中药防风，具有抗过敏、抗炎和抗氧化的多种生物活性^［12］，升麻素（CIM）是防风的主要活性成分，被证实具有抗炎作用，并且在肠易激综合征中具有保护肠屏障的作用^［13］，但CIM在CD结肠炎中的作用尚未见报道。本研究构建了TNBS小鼠结肠炎模型（具有与人类CD类似的结肠炎症状）^［14］，通过评估小鼠肠炎症状、肠屏障功能以及辅助性T细胞亚群的应答反应，观察CIM对TNBS诱导的CD样结肠炎的作用；使用网络药理学及分子对接技术预测分析CIM缓解CD样肠炎的潜在分子机制并进行验证。综上，本研究旨在为CD抗炎治疗提供新的药物选择，同时也明确CIM在CD中的药理作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

实验采用体质量20~23 g（6~8周龄）的雄性C57BL/6小鼠（江苏集萃药康生物科技股份有限公司）。所有小鼠在恒温恒湿的SPF环境下喂养。实验开始前，小鼠需适应性培养7 d。本实验通过蚌埠医科大学动物伦理委员会审查（伦理批号：伦动科批字［2023］第427号）。

1.1.2 实验主要试剂

TNBS试剂和细胞核染料DAPI（Sigma）；CIM（上海源叶生物科技有限公司）；小鼠ELISA试剂盒（武汉博士德生物）；RT-qPCR引物（上海生工，表1）；RT-qPCR试剂盒（TaKaRa）；AB-PAS染色试剂盒和苏木素伊红（HE）染色试剂盒（索莱宝）；RPMI 1640培养基（Gibco）；流式抗体Alexa Fluor 700标记的CD3、PE标记的IFN-γ、Alexa Fluor 488标记的白细胞介素-4（IL-4）、APC标记的IL-17A、PE标记的Foxp3及Foxp3转录因子流式固定破膜缓冲液、细胞刺激混合物（加蛋白转运抑制剂，×500）（eBioscience）；流式抗体BV605标记的CD4和APC标记的CD25（BD）；紧密连接蛋白1（Claudin-1）、闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、β-激动蛋白（β-actin）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）抗体及Alexa Fluor® 555标记的山羊抗兔IgG（Abcam）；BCA试剂盒和RIPA裂解液（碧云天）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模及药物干预

将30只WT小鼠随机分成：WT组、TNBS组、CIM组，10只/组。诱导CD样结肠炎模型时，预先将小鼠禁食不禁水24 h，50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉腹腔注射麻醉小鼠，先用甘油润滑肛周和导管，用镊子轻柔扩肛，再用导管经肛门插入肠道深约3.5 cm，每只小鼠予TNBS 2.5 mg/50%酒精灌肠100 μL，最后将小鼠倾斜45°倒置3 min以防液体从肛门漏出；WT组小鼠按照相同步骤灌入等量的50%酒精^［15］。TNBS灌肠30 min后，CIM组的小鼠使用12.5 mg/kg^［16］的CIM进行灌胃，100 μL/d连续6 d，剩下两组每天给予等量生理盐水灌胃。于造模第7天取检：提取各组小鼠结肠组织及肠系膜淋巴结，进行后续实验。

1.2.2 小鼠肠炎症状评估

每日记录小鼠体质量；疾病活动指数（DAI）：于取检当日根据小鼠体指数、大便形状和出血情况进行评估^［15］；根据HE染色试剂盒，对小鼠结肠组织切片进行HE染色，并根据文献推荐的肠炎组织学评分量表进行肠组织病理评分^［15］。评分范围均为0~4分，分值越大代表肠炎越重。

1.2.3 小鼠结肠黏膜中炎症因子表达水平检测

使用PCR和ELISA检测炎症因子水平：首先将小鼠结肠黏膜组织刮下，进行PCR检测需将粘膜组织中加入Trizol裂解液，提取RNA，经反转录后，采用TaKaRa公司SYBR Green法检测IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-17A的mRNA水平，以GAPDH为内参基因；进行ELISA检测需加入RIPA裂解液提取总蛋白，按照ELISA试剂盒说明书检测炎症因子IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-17A的蛋白水平。

1.2.4 小鼠肠屏障损伤评估

免疫荧光染色：4 μm厚的小鼠结肠组织切片，经二甲苯和梯度酒精脱蜡、抗原修复和封闭后，依次孵育Claudin-1抗体（1∶400）和Alexa Fluor® 555标记的山羊抗兔IgG，DAPI复染细胞核，置于显微镜下采集图片。

AB-PAS染色：脱蜡后的石蜡切片依据AB-PAS染色试剂盒说明书进行操作，其中阿利新蓝（AB）染色液可以将酸性黏蛋白染成蓝色，而杯状细胞中含有大量的酸性黏蛋白，因此呈现蓝紫色，置于显微镜下采集图片，通过计数每个400倍视野下杯状细胞的数量，评估肠屏障损伤程度。

Western blotting检测：将各组小鼠结肠黏膜称质量后加入RIPA裂解液中，经过研磨振荡离心后提取总蛋白，蛋白经定量、变性、电泳和转膜。膜再经封闭后，加入一抗［ZO-1（1∶1000）、Claudin-1（1∶1000）、β-actin（1∶3000）］和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG（1∶3000）孵育，最后经底物显色并采集图片。

1.2.5 小鼠肠系膜淋巴结中T细胞亚群比例检测

流式细胞术检测：提取各组小鼠肠系膜淋巴结于RPMI 1640培养基中，经过研磨、离心、过滤等步骤提取肠系膜淋巴结单个核细胞用于后续染色。将单个核细胞分为2份，一份用于检测Th1/Th2/ Th17，一份用于Treg检测。

Th1（CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺）、Th2（CD3⁺CD4⁺IL-4⁺）和Th17（CD3⁺CD4⁺IL-17A⁺）检测：用100 μL完全培养基重悬细胞加入细胞刺激剂（含蛋白转运抑制剂，×500）于37 ℃刺激孵育细胞5 h，收集细胞经过离心封闭（Fc受体结合抑制剂多克隆抗体，5 μL/管）后进行表面抗体染色30 min（anti-CD3-eFlour450、anti-CD4-BV605），再经洗涤、离心、固定、破膜后进行胞内因子染色1 h（anti-IFN-γ-PE、anti-IL-4-FITC、anti-IL-17A-APC），洗去未结合抗体，200 μL PBS重悬细胞上机检测；

Treg细胞（CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）检测：用100 μL PBS重悬细胞后经Fc受体结合抑制剂多克隆抗体封闭后进行表面抗体染色30 min（anti-CD4，anti-CD25抗体），使用Foxp3 转录因子流式固定破膜缓冲液处理细胞30 min 后进行胞内染色1 h（anti-Foxp3-FITC），洗去未结合抗体，200 μL PBS重悬细胞上机检测。使用BD FACSCanto仪器收集数据，使用FlowJo V10软件分析数据。

1.2.5 小鼠结肠黏膜MAPK信号通路检测

将各组小鼠结肠黏膜称重后加入RIPA裂解液中，经过研磨振荡离心后提取总蛋白，蛋白经定量、变性、电泳和转膜。膜再经封闭后，加入p38（1∶1000）、ERK（1∶1000）、JNK（1∶1000）、p-p38（1∶1000）、p-ERK（1∶1000）、p-JNK（1∶1000）和β-actin抗体（1：3000）4 ℃孵育过夜，然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG（1∶3000）室温孵育1 h，最后经底物显色并采集图片。

1.3 网络药理学预测分析

CIM与CD相关靶点筛选：首先从PubChem数据库中查询CIM药物的分子式和结构式，并将其导入至Swiss Target Prediction数据库中获取CIM的作用靶点，接着从DisGeNET疾病数据库中检索出CD的作用基因，将二者导入Venny 2.1在线工具获得交集基因。再将交集靶点导入David数据库进行GO和KEGG通路富集分析，同时把交集靶点导入String数据库得到蛋白互作图（PPI）。

1.4 分子对接

利用PubChem数据库获取药物CIM的3D结构（SDF格式），同时利用PDB数据库获取MAPK通路中的关键靶点MAP3K14、MAP2K1、MAPK14、MAPK1、IKBKB、BRAF、CASP3和JUN的受体结构（PDB格式），将二者导入CB-Dock2在线数据库中进行分子对接计算结合能^［18］。

1.5 统计学分析

采用SPSS 27.0和GraphPad Prism 10软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CIM可改善TNBS诱导的小鼠体质量及肠炎症状

与WT组相比，TNBS组小鼠的体质量下降、DAI评分升高且结肠长度缩短，而经CIM干预后，小鼠体质量的降低（图1A）、DAI评分（P<0.05，图1B）和结肠长度（P<0.05，图1C、D）均得到了改善。

2.2 CIM减轻TNBS诱导的小鼠肠组织损伤

HE染色显示：TNBS组小鼠结肠表现出黏膜下层炎症细胞浸润和隐窝的破坏，以及组织炎症评分明显增高（P<0.05，图2A、B）；而经CIM干预后，小鼠结肠组织损伤得到了改善（P<0.05，图2A、B）。

2.3 CIM抑制TNBS诱导的小鼠肠黏膜炎症水平

ELISA和PCR结果显示：与TNBS组小鼠相比，CIM组小鼠肠黏膜中抗炎因子IL-4、IL-10升高（P<0.05），而促炎因子IFN-γ、IL-17A降低（P<0.05，图3A、B）。

2.4 CIM改善TNBS诱导小鼠肠屏障损伤

免疫荧光染色显示：与TNBS组小鼠相比，经CIM干预后小鼠结肠组织中Claudin-1的缺失及移位得到明显改善（图4A）；同时，TNBS诱导后导致小鼠结肠组织中杯状细胞数量明显减少，经CIM干预后得到改善（P<0.05，图4B、C）。Western blotting结果发现：与TNBS组小鼠相比，经CIM治疗后Claudin-1和ZO-1的蛋白水平在肠黏膜组织中升高（P<0.05，P<0.05，图4D~F）。

2.5 CIM调控TNBS模型小鼠Th1/Th2细胞应答平衡

流式细胞术结果表明：与WT组小鼠相比，TNBS组小鼠肠系膜淋巴结中Th1细胞比例升高，经CIM干预后Th1细胞比例下降（P<0.05，P<0.05，图5A、B）；另外，与TNBS组相比，CIM组Th2细胞比例明显升高（P<0.05，P<0.05，图5C、D）。

2.6 CIM改善TNBS模型小鼠免疫细胞Th17/Treg应答平衡

流式细胞术结果显示：TNBS组小鼠肠系膜淋巴结中Th17细胞比例高于WT组，而经CIM干预后Th17细胞比例下降（P<0.05，图6A、B）；另外，CIM组Treg细胞比例明显多于TNBS组（P<0.05，图6C、D）。

2.7 CIM网络药理学及分子对接

Venny 图结果发现CIM与CD的交集基因有27个（图7A），将交集基因导入String数据库得到蛋白互作图（PPI）（图7B）。KEGG、GO富集分析显示，CIM对CD的作用可能和与MAPK信号通路相关（图7C、D）。将KEGG富集到的与MAPK通路相关的8个关键蛋白靶点（MAP3K14、MAP2K1、MAPK14、MAPK1、IKBKB、BRAF、CASP3和JUN）分别与CIM进行分子对接，发现CIM与相关靶点结合能均小于-5kcal/mol（表2）。

2.8 CIM抑制TNBS诱导小鼠MAPK信号通路

Western blotting检测结果表明：与TNBS组相比，CIM组p-p38、p-ERK和p-JNK表达降低（图8，P<0.05）。

3 讨论

天然植物单体以其强大的抗炎作用，在炎症相关性疾病包括IBD治疗中表现出极大的药理价值^［19］。CIM是传统中草药防风中的活性成分，具有抗炎特性^［20］。在类风湿关节炎中CIM可以减轻LPS诱导RAW264.7细胞的炎症损伤^［21］。此外，Liu等^［16］的研究表明，CIM可能为一种治疗过敏性哮喘的药物，因其具有抑制体内气道炎症的作用。我们的研究证实，CIM可改善TNBS诱导小鼠结肠炎症状（TNBS诱导的小鼠是克罗恩病研究的一种常用的动物模型，可以引发类似人类克罗恩病的肠道炎症反应和组织损伤，表现为肠黏膜免疫细胞浸润、上皮结构紊乱、隐窝脓肿或消失^{［22， 23］}），小鼠体质量降低、结肠缩短、DAI评分和炎症评分升高均得到了改善。另外，既往研究报道，CD患者和TNBS小鼠肠黏膜组织中存在高水平促炎介质，而抗炎因子水平降低^［24］。我们的数据显示，CIM干预会导致TNBS小鼠肠黏膜组织中的促炎因子（IFN-γ、IL-17A）水平下降和抗炎因子（IL-4、IL-10）升高。以上结果提示，CIM表现出缓解CD肠炎症状的药理作用，为CD治疗药物的研发提供新的选择。

肠屏障损伤是IBD的重要病理特征，高水平的促炎细胞因子起着关键作用，可以直接损伤肠上皮细胞，从而破坏肠道屏障的完整性^{［25， 26］}。另外，促炎细胞因子激活免疫细胞，如巨噬细胞和T细胞，进一步放大炎症反应，形成复杂的免疫网络，损伤肠上皮屏障，推动疾病的进展^［27］。因此，我们进一步探索了CIM对肠屏障的作用，数据提示CIM恢复了肠黏膜组织中紧密连接蛋白定位于上皮细胞表面，且升高其表达量。此外，CIM还能增加小鼠结肠组织中杯状细胞的数量。杯状细胞是肠道上皮的一种重要细胞类型，主要负责分泌黏液，形成保护性的黏液层，从而防止有害物质和病原体直接接触和侵害肠上皮细胞^［28］。杯状细胞数量的增加意味着肠道黏膜屏障的增强，这有助于维护肠道的稳态，减少炎症和感染的风险^［29］。以上结果证实，CIM可能通过抑制炎症因子的水平从而缓解TNBS诱导的肠屏障损伤。

辅助性T细胞（Th细胞）在免疫系统中扮演着至关重要的角色，其应答失衡在炎症性肠病（IBD）的发生和发展过程中具有影响^［30］。在IBD患者中，Th1和Th17细胞的比例升高，导致促炎细胞因子（IFN-γ和IL-17A）的过度分泌，引发持续的急性和慢性炎症。相反，Th2和Treg细胞的比例降低，导致抗炎和免疫调节功能的削弱，无法有效控制炎症反应^{［31， 32］}。靶向调控Th1/Th2和Th17/Treg应答平衡对于开发有效的CD治疗策略至关重要。因此，我们重点观察CIM对辅助性T细胞的调控作用，流式细胞术结果显示，CIM可抑制小鼠肠系膜淋巴结中Th1和Th17细胞的过度活化和分泌促炎细胞因子的能力，同时促进Th2和Treg细胞的活性和分泌抗炎细胞因子的能力。以上结果表明，CIM可能是通过调控肠黏膜免疫紊乱而抑制促炎因子的水平从而缓解屏障损伤和肠炎症状。

为了深入地了解CIM调控Th细胞应答改善CD肠炎的分子机制，我们进行了网络药理学预测分析，初步锁定CIM抗肠炎的作用可能通过调控MAPK信号发挥作用。MAPK是信号级联的重要组成部分，在IBD患者结肠炎的进展和恶化中发挥着重要作用^［33］。研究表明，MAPK可被多种促炎细胞因子激活，同时还能调节多种促炎细胞因子的合成^［34］。已证实，MAPK通过影响细胞因子的产生、免疫细胞的活化、上皮屏障的完整性以及细胞凋亡相关途径影响IBD^［35］。同时我们将KEGG富集到的MAPK通路关键靶点与CIM进行分子对接，发现CIM与MAP3K14、MAP2K1、MAPK14、MAPK1、IKBKB、BRAF、CASP3和JUN都具有良好的结合力（均小于-5kcal/mol），因此MAPK信号通路可能是CIM治疗肠炎的潜在分子机制。文献报道，MAPK通路的关键蛋白包括ERK1/2（ERK）、JNK和p38三个亚基已被证实在IBD模型中被激活^［36］。MAPK通路通过将ERK、JNK和p38磷酸化成p-ERK、p-JNK和p-p38来激活炎症信号。我们的结果证实，在TNBS小鼠肠黏膜中MAPK信号被激活，而CIM可抑制p-ERK、p-JNK和p-p38的表达。提示，CIM可能通过抑制MAPK信号而改善CD样肠炎。本研究表明，天然植物单体升麻素（CIM）具有改善TNBS诱导小鼠肠屏障损伤和缓解肠炎症状的作用，CIM可调控TNBS诱导的小鼠肠黏膜辅助性T细胞亚群免疫紊乱，表现为抑制Th1和Th17细胞应答而促进Th2和Treg细胞应答，这一作用可能与抑制MAPK信号活化有关。

综上所述，本研究证实升麻素可通过抑制MAPK信号的活化，调控肠黏膜免疫紊乱，从而缓解TNBS小鼠肠炎，这为CD治疗药物的研发提供新的理论依据。

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