右美托咪定通过激活Nrf2/HO-1通路减轻热应激诱导的人骨骼肌细胞胀亡

Dexmedetomidine attenuates heat stress-induced oncosis in human skeletal muscle cells by activating the Nrf2/Ho-1 pathway

摘要

目的 研究右美托咪定（DEX）对于热打击诱导人骨骼肌细胞（HSKMC）胀亡的保护作用及可能机制。 方法 体外培养HSKMC，热打击组（HS组）将细胞置于43 ℃的水浴锅中热打击4 h，构建细胞胀亡模型，设置对照组、HS组、30 μmol/L DEX+HS组、ML385+30 μmol/L DEX+HS组、si-Nrf2+HS组、si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS组。通过CCK-8法检测细胞活力，透射电子显微镜观察细胞超微结构，Annexin V-FITC/PI免疫荧光流式细胞术检测细胞胀亡和细胞凋亡，使用谷胱甘肽（GSH）和GSH-px试剂盒检测细胞中GSH及GSH-px含量，TBA法检测丙二醛（MDA），比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）、超氧歧化酶（SOD）、三磷酸腺苷（ATP）表达水平，ELISA法检测肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6、IL-1β水平，qRT-PCR及Western blotting法检测porimin、caspase-3、Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1等蛋白表达水平变化，荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS），JC-1荧光染色法检测线粒体膜电位损伤。 结果 与对照组相比，HS组细胞和细胞器肿胀、胞质内空泡化明显，符合胀亡表现，细胞活力下降，细胞双阳性细胞率（Annexin-V+/PI+）、porimin蛋白表达量增加（P<0.05），caspase-3蛋白在各组间的差异无统计学意义（P>0.05），ROS、MDA、LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量增多（P<0.05），ATP、线粒体膜电位、GSH、GSH- px和SOD水平降低（P<0.05）。与HS组相比，30 μmol/L DEX+HS组细胞损伤减轻，细胞活力升高，细胞双阳性细胞率下降（P<0.05），ROS、MDA、LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量下降（P<0.05），ATP、线粒体膜电位、GSH、GSH- px和SOD含量升高（P<0.05），Nrf2、p-Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达升高（P<0.05）。与30 μmol/L DEX+HS组相比，经ML385或si-Nrf2干预后，DEX对HSKMC细胞的保护作用减弱（P<0.05）。 结论 热打击诱导人骨骼肌细胞发生胀亡，DEX抑制热打击诱导的胀亡，可能机制是激活Nrf2/HO-1信号通路减轻HSKMC的氧化损伤以及抑制炎症因子分泌。

Abstract

Objective To investigate the protective effects of dexmedetomidine (DEX) against heat stress (HS)-induced oncosis in human skeletal muscle cells (HSKMCs) and its underlying mechanisms. Methods A HSKMC model of HS-induced oncosis were established by 43 ℃ water bath for 4 h, and the effects of treatments with 30 μmol/L DEX, ML385 (a Nrf2 inhibitor) +DEX, si-Nrf2+HS, and si-Nrf2+DEX prior to modeling on cell viability was assessed using CCK-8 assay. Oncosis characteristics were evaluated using transmission electron microscopy and Annexin V-FITC/PI flow cytometry. The oxidative stress markers (GSH, GSH-Px, MDA, SOD and ROS), mitochondrial membrane potential, energy metabolism, and inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-1β) in the cells were quantified using standard kits, and the expressions of porimin, caspase-3 and Nrf2 pathway proteins were analyzed using Western blotting and qRT-PCR. Results HS induced typical oncotic features in HSKMCs including organelle swelling and cytoplasmic vacuolization. DEX pretreatment significantly attenuated these changes, reduced Annexin V⁺/PI⁺ cell ratio and cellular porimin expression, and lowered the levels of ROS and MDA while restoring GSH and SOD levels. DEX pretreatment also significantly increased the mitochondrial membrane potential and ATP level, upregulated the expressions of Nrf2, p-Nrf2, HO-1 and NQO1, and suppressed the expressions of TNF-α, IL-6 and IL-1β. The protective effects of DEX were obviously attenuated by interventions with ML385 or si-Nrf2. Conclusion DEX mitigates HS-induced HSKMC oncosis by activating the Nrf2/HO-1 pathway to relieve oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and inflammatory responses.

Graphical abstract

关键词

右美托咪定 / 横纹肌溶解症 / 胀亡 / 人骨骼肌细胞 / Nrf2/HO-1通路

Key words

dexmedetomidine / rhabdomyolysis / oncosis / human skeletal muscle cells / Nrf2/HO-1 pathway

创伤、遗传或中毒等可导致肌肉细胞的急性损伤，即横纹肌溶解症，其病理生理学核心是由于细胞膜破坏和三磷酸腺苷（ATP）耗尽而致钙离子流入细胞^［1-4］。细胞胀亡作为一种关键的促炎性细胞死亡形式，参与了横纹肌溶解症的发生和发展，其机制可能与ATP耗竭、炎性损伤和氧化损伤有关^{［5， 6］}。右美托咪定（DEX）作为临床中广泛应用的麻醉药物，是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，具备抗氧化应激损伤、抑制炎症因子以及抗细胞凋亡等作用^{［7， 8］}。既往研究表明，DEX是一种高选择性的α2-肾上腺素能受体，通过减少炎症和防止细胞死亡对多种器官具有保护作用^{［9， 10］}。课题组前期动物实验表明，DEX可减轻全身炎症反应及氧化应激反应，对横纹肌溶解起保护作用，但未从细胞层面研究DEX对横纹肌溶解保护作用的具体机制^［11］。本研究基于热打击诱导人骨骼肌细胞（HSKMC）发生胀亡，在细胞水平探讨DEX对热打击诱导HSKMC胀亡的作用，并阐明其作用机制是否与激活Nrf2/HO-1通路（氧化应激反应的主要机制^{［12， 13］}）有关。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

HSKMC株（武汉普诺赛公司）；DEX（默克）；porimin抗体、caspase-3抗体、Nrf2抗体（Bioss）；离心机（中国恒诺仪器，型号：AXTGL16M）；恒温水浴锅（北京三二八科学，型号：HH.S11-Ni2）；透射电镜（FEI，型号：FEI Tecnai G2 Spirit 120 kV Bio-TWIN）；人IL-6 ELISA试剂盒（江莱生物）；人TNF-α ELISA试剂盒（江莱生物）；人IL-1β ELISA试剂盒（江莱生物）；ATP试剂盒（南京建成）；GSH试剂盒（南京建成）；GSH-px试剂盒（南京建成）；MDA试剂盒（南京建成）；SOD测试盒（南京建成）；ROS试剂盒（碧云天）；JC-1试剂盒（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1　细胞模型的建立及热打击后复温时间筛选

将HSKMC培养在高糖型杜氏改良培养基（普诺赛）中，培养基中添加10%胎牛血清和1%双抗（四秀青），在37 ℃、含5% CO₂的细胞培养箱中孵育，当细胞培养达到70%时进行热打击处理。对照组细胞不进行处理，热打击组（HS组）将HSKMC置于43 ℃的水浴锅中进行热打击4 h，构建热打击细胞损伤模型，随后将其移至细胞培养箱中分别复温0、12、24、48 h，CCK-8法检测复温后0、12、24、48 h的细胞活力。细胞活力在60%左右考虑复温时间合适，并决定后续实验复温时间。

1.2.2　筛选DEX用药浓度

分别使用浓度梯度为1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L的DEX处理细胞24 h，通过CCK-8法检测细胞活力判断DEX毒性，筛选DEX初始范围浓度。在上述DEX筛选范围内，设置对照组（NC）、HS组、1 μmol/L DEX+HS组、30 μmol/L DEX+HS组、60 μmol/L DEX+HS组，结合DEX毒性及不同浓度DEX干预结果筛选DEX终浓度。

1.2.3　细胞分组

根据研究目的设置分组：对照组：正常培养，不进行热打击，之后进行相关检测。HS组：将细胞置于43 ℃的水浴锅中热打击4 h，制备热打击细胞胀亡模型，然后按照筛选的复温时间进行复温，然后进行检测。DEX干预组（30 μmol/L DEX+HS）：终浓度DEX预处理细胞24 h后，按照HS组步骤进行造模、复温处理。Nrf2抑制组（ML385+30 μmol/L DEX+HS）：加入10 μmol/L ML385（Nrf2抑制剂， selleck）处理12 h，再加入终浓度DEX预处理细胞24 h，再按照HS组步骤进行造模、复温。Nrf2敲低组1（si-Nrf2+HS）：加入si-Nrf2（博迈德）转染24 h，本组无DEX干预，直接按照HS组步骤进行造模、复温。Nrf2敲低组2（si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS）：加入si-Nrf2转染24 h，再加入终浓度DEX预处理细胞24 h，再按照HS组步骤进行造模、复温。

1.2.4　CCK-8法检测细胞活力

细胞正常培养至70%，取1个96孔板，每组加入调整好的细胞悬液100 μL，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中，贴壁后进行后续实验；向各孔中加入10 μL CCK8溶液，用酶标仪测定吸光度A_{450 nm}，吸光度值低表示细胞代谢活跃度下降。

1.2.5　透射电子显微镜检测细胞胀亡

将收集后的细胞进行水洗、脱水、包埋等操作后，放恒温烘箱内聚合，超薄切片机切片及染色，最后在透射电镜观察、拍片。细胞胀亡镜下表现为细胞和细胞器肿胀、胞质内空泡化明显，核周间隙增宽，细胞核凝聚、固缩，部分包膜连续性中断。^［14］

1.2.6 Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞胀亡和细胞凋亡

采集细胞后，悬浮细胞离心（2000 r/min离心5 min）收集，用预冷PBS（4 ℃）洗涤细胞2次（2000 r/min离心5 min）收集细胞；加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀染色，避光，室温孵育15 min；然后加入5 μL碘化丙啶，混匀，室温孵育15 min（上机前5 min再加入5 μL的碘化丙啶染色），进行流式细胞仪的观察和检测（激发波长488 nm，发射波长530 nm）。本染色法可用于检测凋亡及胀亡，早期凋亡细胞仅与Annexin-V结合，呈绿色荧光（Annexin-V+/PI-），而胀亡细胞则同时与Annexin-V和碘化丙啶结合，呈现绿色和红色双荧光信号（Annexin-V+/PI+）^{［15， 16］}。

1.2.7　Western blotting检测胀亡、凋亡相关蛋白及Nrf2通路蛋白表达

收集细胞后进行转膜，小心取出转移膜置于封闭液中封闭1 h，将封闭后的膜分别加入对应的一抗（Porimin，1∶1000；caspase-3，1∶1000；Nrf2，1∶1000；p-Nrf2，1∶1000；HO-1，1∶1000；NQO1，1∶1000），4 ℃反应过夜，用1×TBST洗涤3次，将二抗用1×TBST稀释300倍，将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中作用60 min，用1×TBST洗膜，将其放入化学发光成像系统成像，以β-actin为内参，计算胀亡蛋白porimin、凋亡蛋白caspase-3、Nrf2通路相关蛋白（Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1）表达水平。

1.2.8　检测细胞中抗氧化指标及ATP

取对数生长期细胞接种于6孔板中。弃去培养基，荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）；比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）、ATP、超氧歧化酶（SOD）；硫代巴比妥酸（TBA）法检测丙二醛（MDA）；严格按照试剂盒说明书检测细胞中ROS、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、SOD、MDA、LDH活性。

ROS检测：每个玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定15 min，冷PBS洗涤2次；滴加封闭液（5%正常山羊血清），在湿盒中37 ℃孵育60 min，滴加DCFH-DA（1∶500稀释）置湿盒中37 ℃孵育60 min，再用PBS洗涤5次；滴加DAPI后荧光显微镜下观察拍照，检测荧光信号，荧光强度与ROS水平成正比^［17］。

1.2.9　检测细胞中炎症因子

按照实验分组进行处理，药物处理后，收集各组细胞培养上清液，分装，采用ELISA法检测炎症因子肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-1β（IL-1β），按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.10　JC-1检测线粒体膜电位

加入1 mL JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37 ℃孵育20 min。吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次。在激发波长525 nm、发射波长590 nm处检测JC-1聚合物，用荧光显微镜观察。红色荧光表示JC-1聚集体，绿色荧光表示JC-1单体，蓝色荧光表示细胞核定位。JC-1聚集体与单体的荧光强度比值降低，表示线粒体膜电位降低^［18］。

1.2.11　实时荧光定量PCR法检测胀亡、凋亡相关蛋白及Nrf2通路的mRNA表达

将细胞加入1 mL Trizol（invitrogen），在匀浆仪上匀浆1 min，吸取到1.5 mL EP管中，加入500 μL酚氯仿，4 ℃离心10 min，吸取上层上清于一个新的离心管中，加入700 μL异丙醇，混匀，于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，去上清，用75%乙醇洗涤1次，溶于50 μL DEPC处理水中，电泳检测。RNA浓度计算公式为：A260×40 ng/µL。按照说明书使用invitrogen的superscript III进行逆转录。引物序列［博迈德生物科技（固安）有限公司，表1］。Nrf2通路mRNA表达水平升高，可上调下游相关抗氧化酶表达，使氧化产物含量下降，减轻氧化损伤^［13］。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.5.1软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复温时间点的筛选

与对照组相比，HS组复温0 h细胞活力下降（P<0.05），随复温时间的延长逐渐加重，复温至48 h，细胞活力下降（P<0.05，图1）。选择复温24 h用于后续实验。

2.2 DEX用药浓度的筛选

DEX浓度在1~16 μmol/L范围内对于细胞活力影响较小，DEX浓度为128 μmol/L时，细胞活力下降超过50%，差异有统计学意义（P<0.05，图2A）。对照组与HS组间细胞活力的差异有统计学意义（P<0.05），HS组与1 μmol/L DEX+HS组间细胞活力的差异无统计学意义（P>0.05），但与30 μmol/L DEX+HS组、60 μmol/L DEX+HS组间细胞活力的差异有统计学意义（P<0.05），30 μmol/L DEX+HS组与60 μmol/L DEX+HS组间细胞活力的差异无统计学意义（P>0.05，图2B）。DEX终浓度选取30 μmol/L并应用于后续实验。

2.3 各组细胞活力检测

与对照组相比，HS细胞活性低于对照组（P<0.05）；与HS组比较，30 μmol/L DEX+HS组细胞活力升高（P<0.05），si-Nrf2+HS组细胞活力下降（P<0.05）；与30 μmol/L DEX+HS组相比，ML385+30 μmol/L DEX+HS组及si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS组细胞活力下降，差异有统计学意义（P<0.05，图3）。

2.4 透射电子显微镜观察细胞胀亡

电镜下观察，对照组细胞表现为核大浓染，染色质浓密，线粒体结构完整；HS组细胞体积增大，胞质内空泡化，线粒体肿胀，出现脱颗粒现象，细胞核周围间隙明显增宽，部分细胞膜出现中断。与HS组相比，经30 μmol/L DEX预处理后，细胞肿胀程度较前减轻，细胞体积缩小，胞质空泡化现象明显减弱，线粒体肿胀减轻。与30 μmol/L DEX+HS组相比，si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS组和ML385+30 μmol/L DEX+HS组无明显变化（图4）。

2.5 Annexin V-FITC/PI免疫荧光流式细胞术检测细胞胀亡

与对照组相比，HS组细胞双阳性细胞率增加（P<0.05）；与HS组比较，30 μmol/L DEX+HS组双阳性细胞率下降（P<0.05），si-Nrf2+HS组双阳性细胞率升高（P<0.05）；与30 μmol/L DEX+HS组相比，ML385+30 μmol/L DEX+HS组和si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS组双阳性细胞率升高，差异有统计学意义（P<0.05，图5）。

2.6 各组HSKMC中胀亡、凋亡相关蛋白及Nrf2信号通路蛋白表达

Western blotting检测结果显示，与对照组比较，HS组胀亡蛋白porimin相对表达量升高（P<0.05），Nrf2信号通路蛋白（Nrf2、p-Nrf2、HO-1和NQO1）表达量下降（P<0.05），差异有统计学意义。与HS组相比，30 μmol/L DEX+HS组porimin蛋白相对表达量降低（P<0.05），Nrf2信号通路蛋白表达量升高（P<0.05）。与30 μmol/L DEX+HS组相比，ML385+30 μmol/L DEX+HS组和si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS组porimin蛋白相对表达量升高（P<0.05），Nrf2、p-Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达量下降（P<0.05），差异有统计学意义。凋亡蛋白caspase-3在各组中的差异均无统计学意义（P>0.05，图6）。

2.7 各组HSKMC中抗氧化指标、炎症指标和ATP的检测结果

对照组MDA、LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量低于HS组（P<0.05），GSH、GSH-px、SOD和ATP的含量高于HS组，差异有统计学意义（P<0.05）；HS组MDA、LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量高于30 μmol/L DEX+HS组（P<0.05），GSH、GSH- px、SOD和ATP含量低于30 μmol/L DEX+HS组，差异有统计学意义（P<0.05）；与30 μmol/L DEX+HS组相比，ML385+30 μmol/L DEX+HS组及si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS组MDA、LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量增多（P<0.05），GSH、GSH- px、SOD和ATP含量减少，差异有统计学意义（P<0.05，图7）。

2.8 各组HSKMC中ROS检测

荧光显微镜下观察ROS表达水平，与对照组相比，HS组细胞内ROS含量升高（P<0.05）；与HS组相比，30 μmol/L DEX+HS组细胞内的ROS表达降低（P<0.05），si-Nrf2+HS组细胞内的ROS表达升高，差异有统计学意义（P<0.05，图8）。

2.9 各组HSKMC线粒体膜电位检测

对照组红色荧光JC-1聚集体高于HS组，对照组绿色荧光JC-1单体低于HS组，对照组JC-1聚集体与单体的荧光强度比值高于HS组，线粒体膜电位升高，差异有统计学意义（P<0.05）。HS组与30 μmol/L DEX+HS组间JC-1聚集体与单体的荧光强度比值的差异有统计学意义（P<0.05，图9）。

3 讨论

重症中暑是一种高发病率和高致死率的疾病，且合并多器官功能障碍综合征时病死率高达40%，横纹肌溶解症是重症中暑常见的并发症，其全身影响范围从血流肌酶的无症状升高到危及生命的急性肾脏损伤和电解质异常^{［19，20］}，重症中暑横纹肌溶解的具体发生发展机制尚不清楚。线粒体内产生的ROS及其衍生物可导致膜蛋白的氧化损伤，抑制呼吸链的电子传递，减少ATP的产生，最终导致细胞胀亡和凋亡^{［21，22］}。胀亡作为一种关键的促炎性细胞死亡形式，主要依赖非caspase途径，这一机制不仅与横纹肌溶解症的发生发展密切相关，还与急性冠脉综合征、再灌注损伤及肿瘤等密切相关^{［4，5，18，23］}。寻找合适的药物降低氧化应激水平，对减轻横纹肌溶解症患者氧化应激损伤具有潜在价值。

细胞凋亡和细胞胀亡主要根据细胞体积和核形态进行鉴别，透射电子显微镜被认同为检测细胞死亡方式的金指标。细胞胀亡主要表现为细胞和细胞器肿胀、胞质内空泡化明显、膜通透性增加等^［24］。porimin也被称为促胀亡受体，是介导细胞胀亡的特异性蛋白，porimin蛋白和配体一旦结合，会快速破快细胞膜的完整性，介导细胞膜形成孔道，增加细胞膜通透性，造成细胞肿胀死亡^［23］。caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，是细胞凋亡的执行者^{［25，26］}。采用Annexin-V与PI进行细胞双染实验，可用于检测凋亡及胀亡，绿色和红色双荧光信号（Annexin-V+/PI+）考虑胀亡^{［15，16］}。本研究结果显示，热打击后HSKMC电镜下表现符合胀亡特征，胀亡蛋白porimin及双阳性细胞率（Annexin-V+/PI+）升高，而caspase-3蛋白差异无统计学意义，热打击诱导HSKMC发生胀亡而非凋亡。本研究结果与既往研究^［27］结果一致，不同点在于本研究改良了造模条件，与在细胞培养箱中进行热打击相比，采用水浴锅进行热打击可使温度控制更精确，细胞受热更均匀。此外，细胞凋亡是一种主动耗能的程序性死亡，而细胞胀亡是一种被动的低耗能或不耗能的过程，在胀亡发生的过程中，线粒体功能发生障碍，ATP 生成减少^［14］。本研究发现，热打击后线粒体膜电位及ATP水平明显降低，符合胀亡特点。

线粒体中生成的ROS及其衍生物等可通过对膜蛋白造成氧化损伤，诱导线粒体通透性转换孔产生，抑制呼吸链的电子传递，减少ATP生成，参与胀亡的发生。SOD、GSH是机体重要的抗氧化酶，MDA是脂质过氧化物的裂解产物，其表达水平与氧自由基的生成呈正相关，氧化损伤后细胞膜的完整性可以通过LDH渗漏量反映出来。因此，SOD、GSH、MDA及LDH均为评价氧化应激的重要指标^［28-31］。本研究发现，HS组细胞活力下降，ROS、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量增多，线粒体膜电位降低及ATP水平下降，提示热打击诱导HSKMC胀亡可导致氧化应激损伤、炎症反应及ATP耗竭，这与既往一项体外研究^［18］结果相符。此外，本研究还测定了评估氧化应激的其他指标（GSH、GSH-px、LDH、SOD和MDA），结果发现HS组GSH、GSH-px和SOD水平降低，MDA、LDH水平升高，这提示热打击诱导HSKMC发生胀亡后，细胞内GSH、GSH- px、SOD等抗氧化酶活性下降以及ATP耗竭，细胞抗氧化能力降低，致使氧化与代谢功能障碍，ROS、LDH和脂质过氧化产物MDA大量累积，进一步验证了氧化应激参与了热打击诱导HSKMC胀亡的发生。

DEX是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、镇痛、抗焦虑、抑制交感神经系统活动等作用，作用机制可能涉及AC-cAMP-PKA通路、TLR4/NF-κB途径JAK2-STAT3途径和NF-κB/COX-2途径等^{［8，32-34］}。本团队前期动物实验显示，DEX可以降低ROS的生成，通过抑制NLRP3炎症小体活化减轻劳力性热射病大鼠横纹肌溶解症^［11］。本研究发现，与HS组相比，DEX预处理后可明显增加细胞活力及存活率，减轻电镜下细胞及细胞器损伤，降低胀亡特异性蛋白porimin表达，说明DEX能减轻热打击诱导HSKMC胀亡损伤。DEX降低了ROS、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，这与课题组前期动物研究结果一致^［11］；此外，本研究发现DEX提高了GSH、GSH-px、SOD活性以及线粒体膜电位、ATP水平，降低了脂质过氧化物MDA及LDH含量，说明DEX通过增强细胞的抗氧化能力减轻ROS氧化应激损伤、改善线粒体功能障碍并抑制炎症反应。

Nrf2-Keap1信号通路被认为是细胞内最重要的抗氧化应激机制之一。当细胞受毒物刺激时，Nrf2从Keap1中解偶联进入细胞核内，通过调控下游抗氧化分子如HO-1、NQO1等的表达，从而抵抗氧化应激损伤^{［13，35］}。研究表明，萝卜硫素通过激活Nrf2/ARE通路减少凋亡和胀亡减轻肝缺血再灌注损伤^［22］；亦有研究表明氧化应激反应参与了热打击骨骼肌细胞胀亡^［18］。因此，我们推测DEX可以通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制热打击诱导的HSKMC发生胀亡。本研究发现，与对照组相比，热打击组Nrf2/HO-1通路相关蛋白（Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1）表达下降，DEX可以逆转这些改变，表明DEX可以通过调控Nrf2/HO-1通路而抑制热打击诱导的HSKMC发生胀亡。为了进一步探究Nrf2/HO-1通路是否参与了DEX对HSKMC胀亡的保护作用，本研究选择Nrf2抑制剂ML385以及siNrf2敲低Nrf2的表达来进一步验证。本研究发现，ML385或siNrf2均可抑制Nrf2/HO-1通路的激活，提高GSH、SOD活性，降低脂质过氧化物MDA含量，并且这两组间Nrf2通路相关蛋白的差异无统计学意义，进一步证明DEX通过激活Nrf2/HO-1信号通路，促进Nrf2的转录和表达，减轻氧化应激损伤，为DEX的临床转化提供理论研究基础。

综上所述，热打击诱导HSKMC发生胀亡，结合本文细胞实验及相关指标检测，发现DEX预处理对热打击诱导HSKMC胀亡具有保护作用，其机制可能作用于Nrf2/HO-1信号通路实现。但本研究仅局限于细胞水平，后续还需以动物模型深入研究DEX调控Nrf2/HO-1信号通路抑制胀亡的具体机制。

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